Abstract
Det er avgjørende å identifisere cytomegalovirus (CMV) infeksjoner i gastrointestinal (GI)-tarmkanalen av immunsvekkede pasienter, gitt deres større risiko for utvikling av alvorlig infeksjon. Mange laboratoriemetoder for påvisning av CMV-infeksjon er blitt utviklet, inkludert serologi, viruskultur, og molekylærbiologiske metoder. Ofte er disse metodene reflektere systemiske reaksjoner med CMV og ikke spesifikt identifisere lokale vev engasjement. Derfor er påvisning av CMV-infeksjon i mage-tarmkanalen ofte gjort ved tradisjonelle histologi av vevsprøver. Hematoxylin og eosin (H & E) flekker i forbindelse med immunhistokjemi (IHC) har vært bærebjelkene i å undersøke disse biopsier. H & E og IHC noen ganger resultere i atypiske (tvetydige) fargingsmønster, noe som gjør tolkningen av resultatene vanskelig. Det ble vist at kvantitativ polymerase chain reaction (qPCR) for CMV kan med hell gjøres på formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) vevsprøver for megethøy sensitivitet og spesifisitet. Målet med denne protokollen er å demonstrere hvordan man skal utføre qPCR testing for påvisning av CMV i FFPE vevsprøver i et klinisk laboratorium innstilling. Denne metoden er egnet til å være av stor nytte for pasienter i tilfeller av usikre farging for CMV i GI biopsier.
Introduction
Tolkning av cytomegalovirus (CMV)-infeksjon i kliniske prøver er kritisk viktig. CMV er et medlem av betaherpesvirinae underfamilie av herpesvirus. I likhet med andre herpesvirus, har CMV evnen til å etablere faste eller latent infeksjon kjennetegnet ved en mangel på aktiv virusreplikasjon 1. Reaktivering av viruset kan skje i perioder med stress eller annen immunsuppresjon, som fører til aktiv virusreplikasjon preget av virion utgivelsen, som kan være ledsaget av sykdomsmanifestasjoner 2-4. Gastrointestinale (GI) CMV sykdom symptomer ofte inkluderer magesmerter og / eller blodig avføring en.
Diagnosen CMV gastroenteritt med histologi benytter hematoxylin og eosin (H & E) for å identifisere CMV viral slutninger. I tilfeller der klinisk mistanke er høy ennå ingen åpenslutninger er observert, er immunhistokjemi (IHC) ofte brukt som en medhjelper testmetode. Imidlertid IHCkan også bli hemmet av sjeldne ikke-klassiske vises cellulær fargingsmønstre (tvetydig), noe som gjør tolkning vanskelig (figur 2) 5. Det ble søkt å bruke DNA ekstrahert fra formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) GI vevsprøver og kvantitativ polymerase chain reaction (qPCR) for å påvise CMV i GI biopsier. Denne teknikken har vist seg å være verdifulle i påvisning av CMV i GI-biopsier, og er spesielt nyttig i tvetydige IHC-farging tilfeller 5,6. Også har qPCR også vist seg å korrelere godt med ytterligere klinisk CMV test data når det er tilgjengelig seks. Bruk av qPCR påvise CMV kan føre til tidligere diagnostisering og behandling i tilfeller der klinisk mistanke for CMV er høy, men H & E og CMV IHC er negative.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Med godkjenning av Institutional Review Board, ble et søk i elektronisk laboratorie database utført for å identifisere formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) blokker som representerer tilfeller av cytomegalovirus (CMV)-infeksjon i mage (GI) biopsier diagnostisert ved histopatologi (hematoxylin og eosin (H & E), og / eller immunohistokjemi (IHC)).
En. Tissue Processing fra FFPE GI vevsprøver
- Samle FFPE GI biopsi vevsblokker for cytomegalovirus (CMV) kvantitativ polymerase chain reaction (qPCR). Disse blokker blir lagret ved romtemperatur.
- Pre-label 1,7 ml mikrofugerør med blokken unike identifikasjonsnummer.
- Lås mikrotomen hjulet.
- Sete vevet blokken i kassetten klemmen.
- Ved hjelp av en frisk, ubrukt blad, justere blokken til kniven vinkel mikrotomen.
- Juster Mikrotomen å kutte 10 mikrometer tykke seksjoner.
- Lås opp the rattet og forhånd blokken mot bladet.
- Skjær 5 deler av blokken på 10 mikrometer tykke intervaller, slik at hvert kutt for å rulle inn i en rull av vev. Sørg for at hver rull inneholder en tilstrekkelig representasjon av de ønskede biopsi vev.
- Lås mikrotomen hjulet.
- Med pinsett, plassere alle 5 ruller av vevet inn i pre-merket sentrifugerør, er forsiktig med å bare manipulere rulle av parafin for å redusere potensialet for krysskontaminering. Smekk lokket på røret og legg den tilbake på stativet.
- Fjern vevsblokk fra mikrotomen.
- Fjern og kast bladet.
- Dekontaminér eventuelle flater eller instrumenter som kan ha kommet i kontakt med den forrige vev.
- Plasser en frisk, ubrukt blad i knivholderen.
- Gjenta trinn 01.04 til 01.14 for hver ekstra blokk å bli behandlet. De mikrofuge-rør inneholdende vev ruller kan lagres ved romtemperatur inntil time av DNA-ekstraksjon.
2. DNA Utvinning fra Scrolls av FFPE GI vevsprøver
MERK: Denne protokollen er tilpasset fra pakningsvedlegget til FFPE vev DNA-ekstraksjon kit (OBS: se de relevante sikkerhetsdatablad (HMS-datablad)).
- Tilsett 1 ml xylen (FORSIKTIG: Se SDB) til hver prøve mikro tube. Lukk lokket og virvle kraftig i 10 sek.
- Fortsett med DNA-ekstraksjon som spesifikt beskrevet i produsentens produktinnsats med følgende modifikasjoner.
- Først legger 6 pl av den interne kontroll (IC) til hver mikro-sentrifugerør.
- Etter ATL / proteinase K lysis inkubering ved 56 ° C i 1 time, Inkuber ved 99 ° C i 30 min, i stedet for 90 ° C i 1 time.
- Under den endelige DNA-elueringstrinnet, åpner nøye lokket til DNA-rensing kolonnen og anvende 50 pl destillert DNAse / RNase-fritt vann i sentrum av membranen, i stedet for buffer JAE.
MERK: Se pakningsvedlegget for det aktuelle lagring og tilberedning av reagenser. DNA bør trekkes ut fra alle fem FFPE ruller. Utføre alle sentrifugeringsfremgangsmåten ved rom-temperatur (15-25 ° C).
Tre. QPCR for CMV
- Polymerase Chain Reaction (PCR) prosedyre
- Generere et Excel-PCR regneark for CMV analysekjøring. Denne Excel-regneark beregner den totale mengden av hver reagens som trengs for å gjøre opp master mix med Mg. Den multipliserer mengden av hver reagens som er nødvendig per prøve (nevnt nedenfor) ganger antall prøver og kontroller pluss en (for å kompensere for tap på grunn av pipettering).
- Inkluder følgende reagenser i hver PCR-reaksjon i mengden angitt:
Reagens0; Beløp per Sample
CMV LC mester mix hetteglass 12,5 mL
Mg gul hetteglass 2,5 mL
Totalt volum 15,0 mL
- Inkluder følgende reagenser i hver PCR-reaksjon i mengden angitt:
- Inkludere i hvert assay, driver en vann-eller ikke noe mål-kontroll (NTC), negativ kontroll, en lav positiv kontroll, en høy positiv kontroll, og enten QS3 eller QS4, og alle pasientprøver. Kapillærene bør settes opp i denne rekkefølgen.
- Skaff kjøleblokken som gjelder spesielt for real-time PCR instrument som er lagret ved 4 ° C. Plasser de passende kapillarrør i kjøleblokken. Ikke berør overflaten av kapillarrørene. Bruk alltid hansker når du håndterer kapillærene.
- Sett opp alle polymerase kjedereaksjoner i en ren hette ikke er forurenset med forsterkning produksjonts.
- Fjern riktig antall master-ampuller fra PCR kit for å teste alle pasientprøver, pluss fem kontroller. La master ampuller, Mg løsning, og PCR grade vann tine i kjøleblokken. Hver master hetteglass inneholder nok reagenser for 12 tester.
- Forsiktig vortex master ampuller og rask spinne dem i sentrifuger ved maksimal hastighet.
- Kombiner innholdet i hver master hetteglass i ett hetteglass, og forsiktig vortex igjen.
- Kombiner master mix og Mg-løsning i de mengder som er angitt på PCR regneark til en enkelt sterilt mikrosentrifugerør.
- Bland forsiktig og alikvoter 15 pl av konsentrat-blandingen med Mg i hvert kapillarrør, med unntak av den kapillære i stilling 5 som er for kvantifisering standard (QS).
- Flytt kjøleblokken som inneholder kapillarrørene og mastermiks med Mg fra den rene panseret til en behandling hette.
- Legg 2 mL av intern kontroll (IC) til de resterende 30 pl av mesterbland med Mg. Bland forsiktig og 15 ul aliquot inn i kapillarrøret i posisjon 5 (posisjonen for QS).
- Pipetter 10 pl vann, kontroll-DNA, eller prøve-DNA inn i passende kapillarrør. Cap kapillarrørene ved hjelp av tildekking verktøyet.
- Ta kjøling blokk / samples til real-time PCR instrument.
- Generere et Excel-PCR regneark for CMV analysekjøring. Denne Excel-regneark beregner den totale mengden av hver reagens som trengs for å gjøre opp master mix med Mg. Den multipliserer mengden av hver reagens som er nødvendig per prøve (nevnt nedenfor) ganger antall prøver og kontroller pluss en (for å kompensere for tap på grunn av pipettering).
- Programmere real-time PCR instrument (se tabell 1)
- Forsterkning og Detection utført på real-time PCR instrument
- Logge på datamaskinen
- Dobbelklikk på instrumentet ikonet og logge inn i programvaren.
- Slå på real-time PCR instrument
- Klikk på "CMV / EBV" fra foran skjermen.
- Følg instruksjonene på makro veiviseren.
- Velg boksen for å kjøre en selvtest når du blir bedt av programvaren. En selvtest må utføres en gang hver dag instrumentet er i bruk.
- Navn oppløpet.
- Juster prøven telle ligger i den øvre LSFt hjørne på siden til summen av kontroller og pasienter inkludert i oppkjøringen og skriv identifikasjonsnummeret til hver pasientprøve.
- Klikk på "Abs Quant"-kategorien.
- Under "Prøvetype", tilordne riktig prøvetype for standard.
- Skriv inn de forventede konsentrasjoner for kvantifisering standard (QS).
- Fjern kapillarrørene fra kjøleren blokken og plassere dem i den tilsvarende posisjon i karusellen (kjøleblokk prøve nr. 1. bør plasseres i posisjon 1 på karusellen, etc.).
- Plasser karusellen inn i instrumentets sentrifuge og trykk start.
- Åpne sentrifuge og ta karusellen.
- Plasser karusellen inn i real-time PCR instrument. Lukk lokket.
- Trykk på "Start Run".
- The real-time PCR instrument vil sjekke hver posisjon for en prøve. Ikke gå bort fra instrumentet før denne kontrollen er gjennomført, spelig hvis en av kapillærer ikke er i karusellen. Instrumentet vil merke dette og spørre om kjøringen skal videreføres. Svarer ja før avreise.
- Når kjøringen er ferdig, lukk rapporten som ble generert.
- Klikk på "Absolute Kvanitifisering".
- Klikk på pilen ved siden av Color Compensation.
- Klikk på "Velg farge Kompensasjon" fra drop-down boks.
- Velg den mest aktuelle fargekompensasjon fil som skal brukes på løp.
- Klikk på OK når boksen kommer opp.
- Klikk på pilen ved standardkurve.
- Velg "bruke ekstern" fra rullegardinmenyen.
- Velg den mest aktuelle eksterne standardkurve fil, og klikk deretter på OK.
- Se på hver kurve under Absolute Quantification meny for å sikre at kurvene er til stede og ikke flat linje, hvis konsentrasjon er tilordnet. The Absolute Kvantifisering for 705/Back 530 blir automatisk analysert.
- Qusaklighet kontroll
- Generere en ny standard kurve når en ny partinummer av reagenser er mottatt, eller hver sjette måned, avhengig av hva som er hyppigere.
- Tilsett 10 pl av hver standard til konsentrat-blanding med Mg. Tenk standardene som følger med settet som tidligere utvunnet DNA.
- Legg en mL av intern kontroll for hver standard til master mix med Mg brukes i å generere standardkurven for å sikre nøyaktig kvantifisering. Ikke legg IC til master mix med Mg for Nei Mal Control (NTC).
- Forbered en NTC og tre gjentak av kvantiteringsstandarder QS 4, 3, 2, 1, og en 1:10 fortynning av QS4 for oppkjøringen til å generere standardkurven, totalt i 16 datapunkter.
- Velg "gjengivelse av" i rullegardinmenyen for gjentatte standarder
- Velg kanal 530/back ingen og slå på fargekompensasjon når analysere kjøringen,
- Under "Standard Curve (I Run)", velg "lagre som exintern "og navnet på kurven. Skriv inn kommentaren "brukes som standard kurve" når du lagrer.
- Tegne resultatene. Den resulterende linearitet koeffisient må være ≥ 0,81.
- For daglig kjører, inkluderer en kopi av QS3 eller QS4 som en kontroll i oppkjøringen. Gjeldende ekstern standardkurve kan importeres inn i løp i analysefasen.
- Kjør Kontroller: ingen DNA-kontroll, negativ kontroll, lave, og høye positive kontroller. Forventet virusmengde fastsettes og justeres for hver leverandør og partinummer.
- Til en IC til hver prøve og kontroll under DNA-ekstraksjon.
- Hvis noen av kontrollene faller utenfor rekkevidde, registrere uakseptable resultater og henviser analysen for feilsøking.
- Hyppighet av kontroller
- Inkludere i hvert løp: en NTC, negativ, lav positiv, høy positiv, og standard kontroll.
MERK: Akseptable grenser for kontroller. Ingen topper bør observered for det ikke-templat (NTC) og negative kontroller. Toppene bør være til stede i 530 kanal og forventede viral belastning fastsettes og justeres for hver leverandør og lot-nummer for de lave og høye positive kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt 228 vevsblokker ble testet ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR), som besto av 91 cytomegalovirus (CMV) positive tilfeller basert på histologi og positiv immunhistokjemi (IHC), 18 med tvetydig CMV IHC, og 79 negative kontroller. Som illustrert i figur 2, ville CMV positive tilfeller har vist typiske CMV virale inklusjoner (A) og / eller positiv IHC-farging (B). Equivocal tilfeller ville ha demonstrert sjeldne, ikke-klassiske vises fargingsmønstre (C), mens negative kontroller ville ha vist noen mistenkelig histologi eller IHC farging 5.
Av 91 biopsier positive for CMV ved histopatologi 88 var, positive ved qPCR (tabell 2). Med en sann positiv definisjon basert på tradisjonelle histologi, dvs. typiske CMV viral slutninger og / eller typiske CMV IHC, disse dataene resulterte i en sensitivitet på 96,7%.
Fjorten av 18 (78%) biopsier med tvetydige CMV IHC flekker testet positivt for CMV ved qPCR fem. Blant disse 18 tvetydige tilfeller, elleve hadde flere biopsier tatt samme dag som var positiv for CMV ved histopatologi. Blant disse 14 qPCR positive prøver, 10 hadde biopsier tatt samme dag som var positiv for CMV på histopatologi. Av de 18 tvetydige biopsier testet, 11 hadde ytterligere klinisk informasjon vedrørende CMV testing på andre prøver som sendes inn til eller innen 7 dager etter den tiden biopsien ble tatt. Blant disse 11 tilfellene, 8 (73%) testet positivt for CMV ved qPCR. Av disse 11 biopsier, 5 (45%) testet positivt etter qPCR med flere positive CMV prøvene; 3 (27%) som ble testet positive ved qPCR med ingen positive CMV prøvene; 3 (27%) som ble testet negativt med qPCR med ytterligere negative CMV prøver.
I tillegg til disse studiene som er nevnt ovenfor, var det av interesse å finne ut om å skaffe ytterligere hematoxylin og eosin (H & E) nivåer ville være gunstig i tilfeller der ingen virusslutninger er sett på H & E i utgangspunktet og CMV IHC er tvetydig. Derfor ble H & E nivåer ganger 5 for hver av de 18 blokkene med tvetydige CMV IHC utført. To patologer nøye undersøkt disse sakene og kunne ikke identifisere merkbar viral slutninger på noen av de ekstra lysbilder (data ikke vist).
| Foreslåtte sanntids polymerase kjedereaksjon parametere | ||||||
| Oppsett Readings: | ||||||
| Standard Channel | Oppsøk Temperatur | Max Seek Pos Instrumenttype | Kapillær Size | |||
| 530 | 30 ° C | 12 | 6 kanals | 20 mL | ||
| Programnavn: Aktivering av enzymet | ||||||
| Antall sykluser: 1 | ||||||
| Analyse modus: Ingen | ||||||
| Target ° C | Hold hh: mm: ss | Ramp Rate | Sec Target | Step Size | Trinn Delay | Oppkjøp Mode |
| 95 | 00:10:00 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ingen |
| Programnavn: Touch down trinn | ||||||
| Antall sykluser: 10 | ||||||
| Analyse modus: Ingen | ||||||
| Target ° C | Hold hh: mm: ss | Ramp Rate | Sec Target | Step Size | Trinn Delay | Oppkjøp Mode |
| 95 | 00:00:05 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ingen |
| 65 | 00:00:20 | 20 | 55 | 1 | 1 | Ingen |
| 72 | 00:00:15 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ingen |
| Program navn: Amplification of DNA | ||||||
| Antall sykluser: 40 | ||||||
| Analyse modus: Kvanitifisering | ||||||
| Target ° C | Hold hh: mm: ss | Ramp Rate | Sec Target | Step Size | Trinn Delay | Oppkjøp Mode |
| 95 | 00:00:05 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ingen |
| 55 | 00:00:20 | 20 | 0 | 0 | 0 | Enslig |
| 72 | 00:00:15 | 10 | 0 | 0 | 0 | Ingen |
| Programnavn: Kjøling | ||||||
| Antall sykluser: 1 | ||||||
| Analyse modus: Ingen | ||||||
| Target ° C | Hold hh: mm: ss | Ramp Rate | Sec Target | Step Size | Trinn Delay | Oppkjøp Mode |
| 40 | 00:00:30 | 20 | 0 | 0 | 0 | Ingen |
Tabell 1. Parametrene er oppført bør brukes som en rettesnor for målet temperaturer, sykkel tall og sykkellengder i oppsett av real-time PCR for påvisning cytomegalovi rus i formalinfiksert, parafininnebygd gastrointestinale biopsier. Disse parametrene kan kreve optimalisering avhengig av instrumentmodell og produsent.
| Histologi Positive Cases | PCR Positive Cases | Følsomhet | Histologi Negative Cases | PCR Negative Cases | Specitivity |
| 91 | 88 | 96,7% | 79 | 78 | 98,7% |
Tabell 2. Følsomhet (96,7%) og spesifisitet (98,7%) av real-time PCR (qPCR) på å oppdage cytomegalovirus i formalinfiksert, parafininnebygd gastrointestinale biopsier. Denne tabellen har blitt forandret fra McCoy m.fl. fem.
es/ftp_upload/51570/51570fig1highres.jpg "width =" 400 "/>
Figur 1. Typisk mikrotom med vevet blokken sitter riktig i kassetten klemmen A) I en 10 ym tykk seksjon av vevsprøver skjæres det tillates å rulle inn i en rull B), som blir overført til et mikro-sentrifugerør C). Alle fem ruller av vevsprøver er plassert i en enkelt mikro-sentrifugerør for DNA-ekstraksjon.
Figur 2. A) Hematoxylin og eosin farget i et kolon biopsi viser rikelig, typisk CMV-inklusjoner som antydet med pilene (opprinnelig forstørrelse 400x). B) En kolon biopsi farget med et monoklonalt antistoff mot CMV viser den forventede IHC fargemønster (original forstørrelse 400x).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange laboratoriemetoder er tilgjengelige for diagnose av cytomegalovirus (CMV) infeksjoner, inklusive serologi, viruskultur, molekylær viremia assays, histologi av biopsimateriale, og som nylig demonstrert, molekylære assays av formalinfiksert, parafininnstøpte (FFPE) biopsi tissue 5,6. Serologi, en gang en bærebjelke i diagnose, identifiserer bare pålitelig eksponering og ikke korrelerer godt med akutt CMV infeksjon 7. Viral kultur, både konvensjonelle og tidlig antigen skall ampulle, hindres av lange analysetider, i det beste 2-3 dager i tilfelle av sistnevnte åtte. Molekylær viremia analyser har blitt utviklet, de som har den fordelen av å være kvantitativ med potensial for å overvåke behandling effekt 9-11. Dessverre, når det er klinisk bekymring for lokal involvering av mage (GI) tarmkanalen, viremia analyser gjenspeiler systemisk engasjement og ikke spesifikt identifisere lokalisert infeksjon. Derfor histology har vært gullstandarden for identifisering av CMV-infeksjon i mage-tarmkanalen.
Det er viktig å identifisere aktive mage-tarmkanalen CMV infeksjoner hos immunsupprimerte pasienter, for eksempel de med HIV / AIDS, på kjemoterapi, eller orgel / stamcelletransplantasjoner, gitt deres større risiko for å utvikle alvorlig infeksjon. Det ble rapportert kvantitative polymerase chain reaction (qPCR) er en svært følsom og spesifikk metode for å påvise CMV i GI biopsier fem. Lignende resultater har blitt støttet av andre studier seks.
Selv om alle trinn gjennom hele prosedyren er viktig, er det noen viktige kritiske trinnene som fortjener spesiell oppmerksomhet. Under vev prosessering på mikrotomen, er det viktig bladet byttes mellom hver prøve for å redusere muligheten for krysskontaminering mellom prøver. Tilsvarende rensing av områder på mikrotomen i vevet kan ha kommet i kontakt med ved bruk av passende rengjøringsmiddel recer anbefalt av mikrotomen produsenten vil også redusere denne risikoen.
En ytterligere viktig steg i løpet av protokollen er tilsetningen av den interne kontrollen IC (trinn 2.3) til prøven under DNA-ekstraksjon, som virker som en kontroll for både utpakkingen og forsterkning. Den forsterkning og deteksjon av IC forstyrrer ikke forsterkningen av CMV, for påvisning av CMV-virus forekommer i kanalen 530, mens deteksjon av IC forekommer i kanalen 705. Hvert laboratorium må etablere et akseptabelt område for IC. Etter ekstraksjon, ikke DNA kvalitet trenger ikke å bli vurdert. Med andre ord, blir spektrofotometrisk bestemmelse av DNA-konsentrasjon ikke er rutinemessig utført etter DNA-isolasjon. Hvis tilsettes før DNA-ekstraksjon, IC virker som en kontroll for ekstraksjonsprosessen. Alternativt kan en ul av IC legges til hver master mix med Mg hetteglass. Hvis tilsatt til konsentrat-blanding med Mg, IC fungerer kun som en forsterkning control.
Det er også viktig at under oppsett av alle qPCR reaksjoner som en ren hette (inkludert pipetter og tips) brukes for reagens satt opp. Dette panseret bør ikke ha noen forsterkning produkter, det vil si post sanntid eller konvensjonell PCR, manipulert i den. Disse forsterkning produkter kan bli aerosoliseres og forurense senere forberedt qPCR reaksjoner som fører til falske positive resultater. Mange laboratorier og med gå så langt som å utpeke hetter og utstyr for å pipettere ikke-nukleinsyre-reagenser og en andre hette og utstyr for å legge til sample-og kontroll-nukleinsyre. Individuelle laboratorier må bestemme hva som fungerer best gitt sine individuelle plassbegrensninger.
Feil uventede resultater kan være nødvendig i løpet av prosedyren. Hvis det ikke er noen bevis for forsterkning av IC (dvs. flat linje) av en prøve, er det anbefalt å først gjenta qPCR reaksjon fra det opprinnelige DNA extractifor å sikre en pipetteringsfeil ikke forekomme under prøvereaksjons preparat. Hvis IC holder seg på et flatt linje på repeat reaksjonen, og det er tilstrekkelig gjenværende vevsprøver, kan en andre DNA-ekstraksjon utført, å være oppmerksom på å legge til IC i løpet av ekstraksjonsprosessen. Ved dette re-ekstrahert prøven demonstrerer også en flat linje IC, er det sannsynlig at det er en reaksjon inhibitor til stede i den opprinnelige prøven. I dette tilfelle vil måleresultatet være usikker for påvisning av CMV siden qPCR reaksjonskontrollen ikke utfører riktig måte.
Hvis vannet, viser ingen mål-kontroll (NTC) amplifisering av målet, blir det først anbefalt å analysere positivitet frekvensen av kjøringen. Dersom kjøringen har en høyere enn normal positivitet hastighet, ville det bli anbefalt å utføre swipe tester av områder hvor alle reagenssystemer manipulasjon er utført for å identifisere alle potensielle miljøforurensning. Hvis miljøforurensning er utelukket, kan du bruke ennyåpnede vann kontroll sammen med de vanlige positive kontroller. Hvis den nyåpnede vannkontroll ikke viser en forsterkning produkt, er det sannsynlig den forrige vannkontroll ble forurenset med target-sekvensen. Imidlertid, hvis denne nye vannkontrollen igjen forurenset, reiser det mulighet for en hvilken som helst av eller alle de reagenser eller hetter som blir forurenset med target-sekvensen. I dette tilfellet, ville det være best å rense alle hetter som brukes under prosessen, og deretter bruke alle nye reagenser i å kjøre et nytt sett med kontroller (positive og vann). Hvis problemet vedvarer, bør en revurdering av arbeidsflyten i foredlingsområder og hetter, samt kontakte produktet produsenter gjøres.
Dersom kvalitetsstandarder (QS) inkludert i oppkjøringen ikke demonstrere riktig kopi nummer under forsterkning, er det anbefalt å først kjøre alle QS (4, 3, 2, 1, og en 1:10 fortynning av QS4). Hvis disse standardene faller innenfor de aktuelle områdene, og deretter gjentaprøvene som tidligere er angitt med de aktuelle kontroller. Dersom QS ikke faller innenfor de aktuelle områder, og deretter generere en ny standardkurve slik som beskrevet i kvalitetskontroll-delen av protokollen (3.4). Hvis problemet vedvarer, kan generere en ny standard kurve med nyåpnede QS av nåværende eller en ny partinummer bli forsøkt. Hvis disse trinnene er mislykket, ville kontakte produsenten være berettiget.
Selv om sensitivitet og spesifisitet av qPCR for å påvise CMV i GI biopsier basert på beregninger ved hjelp av konvensjonelle metoder (H & E og IHC) som gullstandarden ikke umiddelbart viser en diagnostisk fordel, ved hjelp av mer analytisk sensitive qPCR metode som gullstandarden forbedrer disse beregninger fem. I tillegg, 14 (78%) av de 18 tvetydige biopsier testet positivt for CMV ved qPCR i denne studien. Det føles disse punktene støtter forestillingen om at qPCR er mye mer følsom enn både H &E alene, eller i forbindelse med IHC ved detektering av CMV i GI biopsimateriale. I tillegg, i tilfeller med tvetydige IHC fargemønstre, skaffe flere nivåer vil neppe være til noen ekstra fordel i forhold til dagens standard metoder.
Til sammen er qPCR svært følsom og spesifikk å påvise CMV infeksjon i FFPE GI vevsprøver. Spesielt nyttig er qPCR resultater på GI biopsier med tvetydige CMV IHC fargingsmønstre eller klinisk svært mistenkelig for CMV. Sammenlignet med tradisjonelle histologi kan qPCR testing av GI biopsimateriale lette en nøyaktig diagnose i en kort tidsperiode, og dermed fører til tidligere og mer effektiv behandling av pasienten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner Amy Thomasson for hennes hjelp til å forberede dette manuskriptet, og Fredrik Skarstedt og Ryan Christy for deres innsats i utarbeidelsen av tallene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| Serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| Microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μl Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| Blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
- Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
- Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
- McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
- Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
- Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
- Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
- Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
- Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
- Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).
