Abstract
그것은 심각한 감염을 개발하기 위해 자신의 더 큰 위험 관련, 위장 (GI) 면역 억제 환자의 기관에 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 감염을 식별하는 데 매우 중요합니다. CMV 감염의 검출을위한 다수의 실험 방법 혈청학, 바이러스 배양, 분자 및 방법을 포함하여 개발되었다. 종종, 이러한 방법은 CMV와 조직의 참여를 반영하고 특히 지역 조직의 참여를 식별하지 않습니다. 따라서 위장관에서 CMV 감염의 검출은 자주 생검 조직의 조직 학적 전통에 의해 이루어집니다. 면역 조직 화학 (IHC)과 함께 헤 마톡 실린과 에오신 (H & E) 염색이 생검 검사의 대들보가 남아있다. H & E와 IHC 때로는 해석이 어려워, 비정형 (모호한) 염색 패턴을 초래한다. 그것은 CMV 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)이 성공적으로 매우 포르말린 - 고정 파라핀 (FFPE) 조직 검사 조직에서 수행 될 수 있다는 것을 나타내었다민감도와 특이도가 높은. 이 프로토콜의 목적은 임상 실험실 설정에 FFPE 생검 조직에서 CMV의 검출을위한 qPCR에 테스트를 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 GI 조직 검사에서 CMV에 대한 모호한 염색의 경우 환자에 대한 큰 도움이 될 전망이다.
Introduction
임상 검체에서 거대 세포 바이러스 (CMV) 감염의 해석은 매우 중요하다. CMV는 헤르페스 바이러스의 betaherpesvirinae 아과의 구성원입니다. 다른 헤르페스 바이러스와 유사하게, CMV 활성 바이러스 복제 하나의 부족에 의해 특징 영구 또는 잠복 감염을 확립하는 기능을 갖는다. 바이러스의 재 활성화는 질병의 증상 2-4을 동반 할 수 비리 릴리스 특징 활성 바이러스 복제, 선도, 스트레스 또는 다른 면역 억제의 시간 동안 발생할 수 있습니다. 위장 (GI) CMV 질환의 증상은 자주 복통 및 / 또는 혈변 1이 (가) 있습니다.
조직 학적으로 거대 세포 바이러스 위장염의 진단은 헤 마톡 실린 및 CMV 바이러스 흠을 식별 할 수 에오신 (H & E)를 사용합니다. 임상 혐의가 높은 아직 명백한 흠이 발생하지 않습니다되는 경우, 면역 조직 화학 (IHC)는 자주 외래 시험 방법으로 사용됩니다. 그러나, IHC또한 해석이 어려운 (그림 2) 5 만들고, 드문 비 고전 나타나는 세포의 염색 패턴 (모호한)에 의해 방해 할 수 있습니다. 이는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) GI 생검 조직과 GI 생검에서 CMV를 검출하는 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에)로부터 추출 된 DNA를 사용하고자 하였다. 이 기술은 GI 생검에서 거대 세포 바이러스의 검출에 유용한 것으로 표시하고, 모호한 IHC 염색의 경우 5,6에 특히 도움이되었습니다. 또한, qPCR에 또한 6 사용할 수있는 경우 추가 임상 CMV 테스트 데이터와 상관 관계가 표시되었습니다. CMV를 감지하는 qPCR에의 사용은 CMV에 대한 임상 혐의가 높은 경우 초기 진단과 치료로 이어질 수 있지만, H & E 및 CMV IHC는 부정적이다.
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Protocol
임상 시험 심사위원회의 승인을 받아, 전자 실험실 데이터베이스의 검색은 위장에서 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 감염 사례 조직 병리학 진단 (GI) 생검 (헤 마톡 실린을 나타내는 (FFPE) 블록 및 임베디드 포르말린 고정, 파라핀을 확인하기 위해 수행되었다 에오신 (H & E) 및 / 또는 면역 조직 화학 (IHC)).
FFPE GI 생검 조직에서 1. 조직 처리
- 사이토 메갈로 바이러스 (CMV)에 대한 FFPE GI 생검 조직 블록을 상환 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에). 이러한 블록을 실온에서 저장된다.
- 블록의 고유 한 식별 번호와 함께 사전 라벨 1.7 밀리리터의 microfuge 튜브.
- 마이크로톰 핸드 휠을 잠급니다.
- 카세트 클램프로 조직 블록 좌석.
- 신선하지 않는 블레이드를 사용하여 마이크로톰에 칼 각도로 블록을 맞 춥니 다.
- 10 μm의 두께 부분을 잘라 마이크로톰을 조정합니다.
- 일의 잠금을 해제전자 핸드 휠 미리 블레이드를 향해 블록.
- 각각의 컷이 조직의 스크롤에 출시 할 수 있도록, 10 μm의 두께 간격으로 블록의 5 부분을 잘라냅니다. 각 스크롤 원하는 생검 조직의 적절한 표현이 포함되어 있는지 확인합니다.
- 마이크로톰 핸드 휠을 잠급니다.
- 포셉으로 만 교차 오염 가능성을 줄이기 위해 파라핀으로 스크롤을 조작주의하면서, 미리 라벨링 원심 분리기 튜브에 조직의 모든 5 스크롤을 배치합니다. 튜브에 뚜껑을 스냅 랙에 다시 배치합니다.
- 마이크로톰에서 조직 블록을 제거합니다.
- 제거하고 잎을 버린다.
- 이전의 조직과 접촉 할 수있는 어떤 표면 또는 장비의 오염을 제거.
- 칼 홀더에 신선한, 사용하지 않는 날을 놓습니다.
- 반복 처리 할 각 추가 블록 1.4-1.14 단계를 반복합니다. 티슈 두루마리 함유의 microfuge 튜브 포까지 실온에서 저장 될 수있다DNA 추출의 전자.
FFPE GI 생검 조직의 스크롤 2. DNA 추출
참고 :이 프로토콜이 FFPE 조직의 DNA 추출 키트 (: 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조주의)의 패키지 삽입에서 적응됩니다.
- 각 샘플의 미세 튜브에 1 ㎖의 크실렌 (MSDS를 참조하십시오주의)를 추가합니다. 적극적으로 10 초 동안 뚜껑과 소용돌이를 닫습니다.
- 구체적으로 다음과 같은 수정과 제조업체의 제품 삽입에 설명 된 DNA 추출을 진행합니다.
- 먼저 각각의 미세 튜브 내부 통제 (IC)의 6 μl를 추가합니다.
- 1 시간 동안 56 ° C에서 ATL / 단백질 분해 효소 K 용해 배양 한 다음, 1 시간 30 분 동안 99 ° C에서보다는 90 ° C를 품어.
- 최종 DNA 용출 단계 동안, 정중 DNA 정화 컬럼의 뚜껑을 열고 오히려 buffe보다 막의 중앙에 50 μL DNase의 증류 / RNase가없는 물을 적용R은 ATE.
주 : 해당 스토리지 및 시약의 준비를위한 패키지 안내서를 참조하십시오. DNA는 5 FFPE 스크롤에서 추출해야합니다. 실내 온도 (15-25 ℃)에서 모든 원심 분리 단계를 수행합니다.
CMV 3. qPCR에
- 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 프로 시저
- CMV 분석 실행을위한 엑셀 PCR 워크 시트를 생성합니다. 이 Excel 워크 시트는 마그네슘과 마스터 믹스를 만들기 위해 필요한 각 시약의 총 금액을 계산합니다. 이 샘플 당 필요한 각 시약의 양을 아래 나열된 배 샘플 및 컨트롤의 수와 곱 하나 (때문에 피펫으로 손실을 보상하기 위해).
- 양의 각 PCR 반응에 다음과 같은 시약은 표시 다음을 포함한다 :
시약0; 샘플 당 금액
CMV의 LC 마스터 믹스 유리 병 12.5 μL
MG 솔루션 노란색 유리 병 2.5 μL
총 양 15.0 μL
- 양의 각 PCR 반응에 다음과 같은 시약은 표시 다음을 포함한다 :
- 물이나없는 대상 컨트롤 (NTC), 음성 대조군, 낮은 양성 대조군, 높은 긍정적 인 제어, QS3 또는 QS4 하나, 모든 환자의 샘플을, 모든 분석에 포함 실행합니다. 모세 혈관의 순서로 설정해야합니다.
- 4 ℃에서 저장되는 실시간 PCR 기기의 냉각 블록 별을 얻 냉각 블록에 적합한 모세관 튜브를 놓습니다. 모세관 튜브의 표면을 만지지 마십시오. 모세 혈관을 취급 할 때는 항상 장갑을 사용합니다.
- 증폭 생산에 오염되지 않은 깨끗한 후드의 모든 중합 효소 연쇄 반응을 설정TS.
- 모든 환자 샘플, 플러스 5 컨트롤을 테스트하기 위해 PCR 키트에서 마스터 튜브의 정확한 수를 제거합니다. 하자 마스터 유리 병, 마그네슘 용액 냉각 블록 PCR 등급 물 해동. 각 마스터 유리 병 (12) 시험에 대한 충분한 시약이 포함되어 있습니다.
- 조심스럽게 마스터 유리 병 와동 빠른 최대 속도로 원심 분리기를 회전.
- 하나의 유리 병에 각 마스터 유리 병의 내용을 결합하고 다시 부드럽게 소용돌이.
- 하나의 멸균의 microfuge 튜브에 PCR 워크 시트에 표시된 금액의 마스터 믹스와 마그네슘의 솔루션을 결합합니다.
- 정량 표준 (QS)입니다 위치 5 모세관을 제외하고, 각 모세관 튜브에 부드럽게 나누어지는 마그네슘과 마스터 믹스 15 μl를 섞는다.
- 깨끗한 후드에서 처리 후드 Mg를 모세관 및 마스터 믹스를 함유하는 냉각 블록을 이동.
- 마스터의 나머지 30 μL에 내부 통제의 2 μL (IC)를 추가Mg를 섞는다. 위치 5 모세관 (QS에 대한 위치)에 부드럽게 나누어지는 15 μl를 섞는다.
- 물 피펫 10 μL은 해당 모세관 튜브에 DNA, 또는 샘플의 DNA를 제어 할 수 있습니다. 캐핑 도구를 사용하여 모세관 튜브를 모자.
- 실시간 PCR 기기에 블록 / 샘플을 냉각 가라.
- CMV 분석 실행을위한 엑셀 PCR 워크 시트를 생성합니다. 이 Excel 워크 시트는 마그네슘과 마스터 믹스를 만들기 위해 필요한 각 시약의 총 금액을 계산합니다. 이 샘플 당 필요한 각 시약의 양을 아래 나열된 배 샘플 및 컨트롤의 수와 곱 하나 (때문에 피펫으로 손실을 보상하기 위해).
- 실시간 PCR 장비를 프로그램 (표 1 참조)
- 증폭과 검출은 실시간 PCR 기기에서 수행
- 컴퓨터에 로그온
- 두 악기 아이콘을 클릭하고 소프트웨어에 로그인합니다.
- 실시간 PCR 기기를 켭니다
- 전면 화면에서 "CMV / EBV"를 클릭하십시오.
- 매크로 마법사의 지시를 따릅니다.
- 소프트웨어에서 메시지가 표시되면 자체 테스트를 실행하는 상자를 선택합니다. 자체 테스트 기기를 사용하고있는 각각 하루에 한 번 수행해야합니다.
- 실행의 이름을 지정합니다.
- LEF 상부에 위치한 샘플 개수를 조정컨트롤과 환자의 합계 페이지 t 코너는 실행에 포함 된 각각의 환자 샘플의 식별 번호를 입력합니다.
- "애비 양의"탭을 클릭합니다.
- "샘플 유형"에서 표준에 해당하는 샘플의 유형을 지정합니다.
- 정량 표준 (QS)의 예상 농도를 입력합니다.
- 쿨러 블록에서 모세관 튜브를 제거하고 (블록 샘플 중 1 냉각 등, 회전 목마에 위치 # 1에 배치해야합니다) 회전 목마의 해당 위치에 배치합니다.
- 악기의 원심 분리기를 눌러 시작으로 회전 목마를 놓습니다.
- 원심 분리기를 열고 회전 목마를 제거합니다.
- 실시간 PCR 기기에 회전 목마를 놓습니다. 뚜껑을 닫습니다.
- 을 눌러 "시작 실행".
- 실시간 PCR 악기 샘플은 각각의 위치를 확인합니다. 이 검사가 완료 될 때까지 악기에서 멀리 떨어진 곳에서 걷지 않는다 ESPE모세관의 하나가 컨베이어에없는 경우 cially. 악기는이를 기록하고 실행이 계속 될 경우 요청합니다. 떠나기 전에 예라고 응답.
- 실행이 완료되면, 생성 된 보고서를 닫습니다.
- "절대 정량"을 클릭합니다.
- 다음 색상 보정에있는 화살표를 클릭합니다.
- 드롭 다운 상자에서 "색상 선택 보상"을 클릭합니다.
- 실행에 적용 할 최신 색 보정 파일을 선택합니다.
- 상자가 뜨면 확인을 클릭합니다.
- 표준 곡선의 화살표를 클릭합니다.
- 드롭 다운 메뉴에서 "외부 사용"을 선택합니다.
- 가장 최근의 외부 표준 곡선 파일을 선택한 다음 확인을 클릭합니다.
- 농도가 할당되어있는 경우 곡선이 존재하지 일직선를 보장하기 위해 절대 정량 메뉴의 각 곡선 봐. 705/Back (530)의 절대 정량이 자동으로 분석됩니다.
- 숨어품 질 관리
- 어느 쪽이든 더 자주하는 쪽을 택 시약의 새로운 로트 번호가 수신 될 때마다 새로운 표준 곡선, 또는 6 개월마다, 생성합니다.
- 마그네슘과 마스터 믹스에 각 표준의 10 μl를 추가합니다. 이전에 추출 된 DNA와 키트에 포함 된 기준을 고려한다.
- 마그네슘은 정확한 정량을 보장하기 위해 표준 곡선을 생성하는 데 사용과 마스터 믹스에 각 표준에 대한 내부 통제의 1 μl를 추가합니다. 아니 템플릿 컨트롤 (NTC)에 대한 밀리그램 마스터 믹스에 IC를 추가하지 마십시오.
- 16 데이터 포인트에 달하는, NTC 및 정량 표준 QS 4, 3, 2, 1, 표준 곡선을 생성하기위한 실행 QS4의 1:10 희석의 세 개의 반복을 준비한다.
- 반복 된 표준에 대한 드롭 다운 메뉴 "의 복제"를 선택합니다
- 채널 530/back의 없음을 선택하고 실행을 분석 할 때 색 보정을 켜
- "(런) 표준 곡선"에서 "선택 전으로 저장영원한 "곡선의 이름을 지정합니다. 저장할 때 "표준 곡선으로 적용"주석을 입력합니다.
- 결과를 그래프. 그 결과 선형 계수는 0.81 ≥해야합니다.
- 매일 실행의 경우, 런타임에서 컨트롤로 QS3 또는 QS4의 복사본을 포함한다. 현재 외부 표준 곡선은 분석 단계에서 실행으로 가져올 수있다.
- 실행 관리 : DNA 제어, 음성 대조군, 낮은, 높은 양을 제어합니다. 예상 바이러스 부하가 결정하고 각 공급 업체 및 로트 번호에 따라 조정된다.
- 각 샘플에 IC를 추가하고 DNA를 추출하는 동안 제어 할 수 있습니다.
- 컨트롤의 범위 밖으로 떨어질 경우, 받아 들일 수없는 결과를 기록하고, 문제 해결에 대한 분석을 참조하십시오.
- 컨트롤의 주파수
- NTC, 음, 낮은 양, 양의 높은, 및 표준 제어 : 모든 실행에 포함.
참고 : 컨트롤에 대한 허용 한계를. 더 피크가 관찰 될 수 없습니다노 템플릿 (NTC) 및 음성 대조군에 대한 개발. 봉우리는 530 채널에 존재해야하며, 예상 바이러스 부하는 결정 낮고 높은 긍정적 인 컨트롤의 각 공급 업체 및 로트 번호에 따라 조정됩니다.
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Representative Results
228 조직 블록의 총 모호 CMV IHC와 조직학 및 긍정적 인 면역 조직 화학 (IHC), 18 일을 기준으로 91 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 긍정적 인 사례로 구성되었다 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에), 79 음의 컨트롤에 의해 테스트되었습니다. 도 2에 도시 된 바와 같이, CMV 양성 케이스 전형적인 CMV 바이러스 개재물 (A) 및 / 또는 양성 IHC 염색 (B)을 보여준 것이다. 음성 대조군이 더 의심스러운 조직 학적 또는 IHC 염색 5 표시되지 것입니다 반면 모호한 경우는 드문, 비 고전 나타나는 염색 패턴 (C)을 증명하고있다.
조직 병리학 CMV에 대한 긍정적 인 91 생검, 88 qPCR에 (표 2)에서 양성이었다. 기존의 조직학 기반으로 진정한 긍정적 인 정의와, 전형적인 CMV 바이러스 포함 및 / 또는 일반적인 CMV IHC 즉, 이러한 데이터는 96.7 %의 민감도 결과.
모호한 CMV IHC 염색 18 (78 %) 생검의 포티은 qPCR에 5에서 CMV 양성 반응. 이러한 18 애매한 경우 중, 열한 추가 생검 조직 병리학 CMV에 대한 긍정적이었다 같은 날 촬영했다. 이러한 14 qPCR에 긍정적 인 샘플 가운데 10 생검 조직 병리학에 CMV에 대한 긍정적이었다 같은 날 촬영했다. 테스트 18 모호한 생검, (11)은 조직 검사가 수행 된 시간의 7 일 이내에 제출 또는 다른 표본에서 CMV 테스트에 대한 추가 임상 정보를했다. 상기 11 예 중 8 (73 %)은 qPCR에 의해 CMV 양성 반응. 이 11 생검, 5 (45 %)이 추가로 긍정적 인 CMV 표본으로 qPCR에 의해 양성 반응; 3 (27 %)이 멋 부리다 테스트더 긍정적 인 CMV 표본으로 qPCR에 의해 필자; 3 (27 %)이 추가로 부정적인 CMV 표본으로 qPCR에 의해 부정적인 테스트.
위에서 언급 된 연구 이외에, 그것은 얻는 추가 헤 마톡 실린과 에오신 (H & E) 수치가 더 바이러스 흠이 처음 H & E에서 볼 수없는 및 CMV IHC가 모호하는 경우에 도움이 될 것입니다 여부를 확인하는 관심이었다. 따라서 모호 CMV IHC와 18 블록의 각각에 대한 H & E 수준은 5 회 수행 하였다. 두 병리학 정중 이러한 경우를 조사하고 추가 슬라이드 (데이터 미도시)의 임의의 식별 바이러스 개재물을 식별 할 수 없었다.
| 희망 실시간 중합 효소 연쇄 반응 매개 | ||||||
| 설정 읽기 : | ||||||
| 기본 채널 | 온도를 탐색 | 최대 순위를 탐색 악기의 종류 | 모세관 크기 | |||
| (530) | 30 ° C | 12 | 6 채널 | 20 μL | ||
| 프로그램 이름 : 효소의 활성화 | ||||||
| 사이클의 수 : 1 | ||||||
| 분석 모드 : 없음 | ||||||
| 대상 ° C | HH를 잡고 : MM : SS | 램프 속도 | 초 대상 | 단계 크기 | 단계 지연 | 획득 모드 |
| 95 | 0시 10분 0초 | (20) | 0 | 0 | 0 | 없음 |
| 프로그램 이름 : 단계를 터치 다운 | ||||||
| 사이클의 수 : 10 | ||||||
| 분석 모드 : 없음 | ||||||
| 대상 ° C | HH를 잡고 : MM : SS | 숫양P 비율 | 초 대상 | 단계 크기 | 단계 지연 | 획득 모드 |
| 95 | 0시 0분 5초 | (20) | 0 | 0 | 0 | 없음 |
| 65 | 0시 0분 20초 | (20) | 55 | 1 | 1 | 없음 |
| 72 | 0시 0분 15초 | (20) | 0 | 0 | 0 | 없음 |
| 프로그램 이름 : DNA의 증폭 | ||||||
| 사이클의 수 : 40 | ||||||
| 분석 모드 : 정량 | ||||||
| 대상 ° C | HH를 잡고 : MM : SS | 램프 속도 | 초 대상 | 단계 크기 | 단계 지연 | 획득 모드 |
| 95 | 0시 0분 5초 | (20) | 0 | 0 | 0 | 없음 |
| 55 | 0시 0분 20초 | (20) | 0 | 0 | 0 | 하나의 |
| 72 | 0시 0분 15초 | 10 | 0 | 0 | 0 | 없음 |
| 프로그램 이름 : 냉각 | ||||||
| 사이클의 수 : 1 | ||||||
| 분석 모드 : 없음 | ||||||
| 대상 ° C | HH를 잡고 : MM : SS | 램프 속도 | 초 대상 | 단계 크기 | 단계 지연 | 획득 모드 |
| (40) | 0시 0분 30초 | (20) | 0 | 0 | 0 | 없음 |
표 1. 나열된 파라미터 cytomegalovi를 검출하기위한 실시간 중합 효소 연쇄 반응의 셋업에서 목표 온도 사이클 번호,주기 길이에 대한 지침으로 표기 포르말린 고정, 파라핀 위장 조직 검사에서 RUS. 이러한 매개 변수는 기기의 모델과 제조업체에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다.
| 조직학 긍정적 인 케이스 | PCR 긍정적 인 케이스 | 감광도 | 조직학 부정적인 케이스 | PCR 부정적인 케이스 | Specitivity |
| 91 | 88 | 96.7 % | 79 | 78 | 98.7 % |
포르말린 고정, 파라핀 위장 조직 검사에서 거대 세포 바이러스의 검출에 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에) 표 2. 감도 (96.7 %)와 특이도 (98.7 %).이 표 등 5 맥코이에서 수정되었습니다.
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생검 조직의 10 미크론 두께의 부분이 절단되어 그림 1. 카세트 클램프에 올바르게 장착 조직 블록과 일반적인 마이크로톰)으로 그것의 미세 관 C로 전송 스크롤 B))에 출시 할 수 있습니다. 생검 조직의 다섯 스크롤은 DNA 추출을위한 하나의 microfuge 튜브에 배치됩니다.
예상 IHC 염색 패턴 (원본을 나타내는 CMV에 대한 단일 클론 항체로 염색 그림 2.)은 Hematoxylin 화살표 (원래 배율 400 배)으로 표시된 바와 같이 풍부한 전형적인 CMV에 포함 된 항목을 표시하는 대장 생검의 스테인드 섹션을 에오신. B) 대장 생검 배율 400 배).
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Discussion
많은 실험 방법은 혈청 학적 검사, 바이러스 배양, 분자 바이러스 혈증의 분석, 조직 검사 재료의 조직 학적, 그리고 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 (FFPE) 조직 검사 최근에 설명 된대로, 분자 분석을 포함하여 거대 세포 바이러스의 진단 (CMV) 감염을 사용할 수 있습니다 조직 5,6. 혈청 검사는 진단의 의지가 한 번 만 안정적으로 노출을 식별하고 급성 CMV 감염 7과 잘 상관하지 않습니다. 기존의 초기 항원 쉘 유리 병 모두 바이러스 성 문화, 후자 8의 경우 가장 2-3일에, 긴 분석 시간에 의해 방해된다. 분자 혈증 분석법은 대부분 모니터링 치료 효능 9-11위한 잠재력 정량적되는 장점을 갖는, 개발되고있다. 위장 (GI) 요로의 지역 참여에 대한 임상 우려가있을 때 불행하게도, 바이러스 혈증의 분석은 조직의 참여를 반영하고 구체적으로 지역화 감염을 식별하지 않습니다. 따라서, Histology은 위장관의 CMV 감염을 식별하기위한 황금 표준되었습니다.
그것은 심각한 감염을 개발하기 위해 자신의 큰 위험이 주어진 세포 이식 줄기 / 활성 위장관의 CMV 화학 요법에 같은 HIV / AIDS를 가진 사람과 같은 면역 억제 환자의 감염, 또는 기관을 식별하는 데 매우 중요합니다. 이는 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에)가 GI 생검 5에서 CMV를 검출하는 매우 민감하고 구체적인 방법으로보고되었다. 비슷한 결과는 다른 연구 (6)에 의해 지원되었다.
절차를 통해 모든 단계가 중요하지만, 특별한 배려를받을 자격이 몇 가지 주요 핵심 단계가 있습니다. 마이크로톰에 조직을 처리하는 동안, 그것은 블레이드 시험편 간의 교차 오염의 가능성을 줄이기 위해, 각 샘플 사이에 스위칭 될 필수적이다. 마찬가지로, 마이크로톰 영역에의 오염은 조직 적절한 클리너를 사용하여 촬영과 접촉 수도마이크로톰 제조업체가 권고했다 또한 이러한 위험을 줄일 수 있습니다.
프로토콜 동안 추가 키 단계는 추출 처리 및 증폭 모두 제어 역할 DNA 추출, 동안 샘플에 내부 제어 IC (단계 2.3)의 추가이다. IC의 검출 채널 (705)에서 발생하는 반면, CMV 바이러스의 검출, 채널 (530)에서 발생하기 때문에 IC의 증폭 및 검출, CMV의 증폭을 방해하지 않는다. 각 기관은 IC에 대한 허용 범위를 설정한다. 추출 후, DNA 품질이 평가 될 필요가 없다. 즉, DNA의 농도의 분광 광도 측정은 일상적 DNA 분리 다음 수행되지 않는다. 종래 DNA 추출에 첨가하면, IC는 추출 처리를위한 대조군으로서 작용한다. 대안 적으로, IC의 1 μL 밀리그램 바이알 각 마스터 믹스에 첨가 될 수있다. Mg를 마스터 믹스에 첨가하면, IC는 증폭 C 역할ontrol.
또한 필수적입니다 시약 설정에 대해 (피펫 및 팁 포함) 깨끗한 후드를 사용하는 것이 모두의 qPCR 반응의 셋업시. 이 후드는 그 안에서 조작하는 증폭 산물, 즉 포스트 실시간 또는 기존의 PCR을 필요가 없습니다. 이러한 증폭 제품은 에어로졸이되고 거짓 긍정적 인 결과로 이어지는 후속 준비의 qPCR 반응을 오염시킬 수 있습니다. 많은 실험실도 비 핵산 시약 및 샘플을 추가하기위한 두 번째 후드와 장비를 피펫 팅을위한까지 지정 후드 및 장비의 이동 및 핵산을 제어 할 수 있습니다. 개별 실험실은 가장 자신의 개인 공간 제약을 주어 어떤 작품을 결정해야합니다.
예기치 않은 결과를 문제 해결 절차를 수행하는 동안 필요할 수 있습니다. 샘플의 IC (즉, 일직선)의 증폭의 증거가없는 경우, 제 원래 DNA의 extracti에서 qPCR의 반응을 반복하도록 권장피펫 오류를 확인하는 것은 샘플에 반응 준비하는 동안 발생하지 않았다. IC가 반복 반응에 일직선으로 유지하고 나머지 충분한 생검 조직이 있으면, 제 DNA 추출은 추출 공정 중에 IC를 추가 중시하여 수행있다. 이 재 추출 시험편 또한 편평한 IC 라인을 설명하면, 원래 시료 내에 존재하는 반응 억제제가있을 가능성이있다. qPCR의 반응 제어가 적절하게 수행되지 않았기 때문에이 경우에, 시험 결과는 CMV의 검출을위한 불확정 것이다.
물은 어떠한 대상 컨트롤 (NTC)가 대상의 증폭을 보여 없으면 먼저 실행의 양성 비율을 분석하기 위해 권고된다. 실행이 정상적인 양성 비율보다 높은이 있으면, 어떤 시약 조작이 임의의 잠재적 인 환경 오염 물질을 식별하기 위해 수행되는 구역의 와이프 테스트를 수행하는 것이 추천된다. 환경 오염이 배제되는 경우, 사용평소 긍정적 인 컨트롤과 함께 새롭게 문을 연 물 제어 할 수 있습니다. 새로 열린 물 컨트롤 증폭 산물을 표시하지 않는다면, 이전의 수분 제어가 표적 서열에 오염 된 것 같다. 이 새로운 물 제어가 다시 오염되는 경우에는, 그것이 표적 서열에 오염되는 시약이나 후드의 일부 또는 전부의 가능성을 제기한다. 이 경우,이 프로세스 동안 사용 된 모든 후드의 오염을 제거하고 (양성 및 물) 제어의 새로운 세트를 실행하는 모든 새로운 시약을 사용하는 것이 가장 좋을 것이다. 문제가 지속되는 경우, 처리 지역과 후드에서 워크 플로우뿐만 아니라 제품 제조 업체에 문의 재평가가 수행해야합니다.
품질 기준 (QS)가 증폭 동안 적절한 카피 수를 발휘하지 않는 실행에 포함될 경우, 우선 QS (4, 3, 2, 1 및 QS4의 1:10 희석)를 실행하도록 권고된다. 이러한 표준은 적절한 범위 내에 있다면, 반복앞서 적절한 컨트롤로 지정된 샘플. QS가 적절한 범위 내에 있지 않은 경우, 프로토콜 (3.4)의 품질 제어부에 설명 된대로 새로운 표준 곡선을 생성한다. 문제가 지속되면, 현재 또는 새로운 로트 번호의 새롭게 문을 연 QS와 함께 새로운 표준 곡선을 생성하는 시도 할 수있다. 이 단계가 실패하는 경우, 제조업체에 연락하는 것은 보증 할 것이다.
황금 표준 (H & E와 IHC) 통상적 인 방법을 사용하여 계산을 기반으로 GI 조직 검사에서 CMV를 검출하는 감도 및 qPCR에 특이 즉시 황금 표준으로 더 분석적으로 민감한 qPCR의 방법을 사용하여, 진단 우위를 보여주지 않지만 크게 이러한 향상 계산 5. 또한, 18 모호 생검의 14 (78 %)이 연구에서 qPCR에 의해 CMV 양성 반응. 그것은 이러한 점은 qPCR에이 H & 하나보다 훨씬 더 민감하다는 것을 개념을 지원 느껴집니다혼자 E, 또는 GI 생검 재료에 CMV를 검출에서 IHC와 함께. 또한, 모호한 IHC 염색 패턴의 경우, 추가 레벨을 획득하는 현재 표준 방법에 비해 어떤 이점이 될 가능성이 있습니다.
이와 함께, qPCR에이 FFPE GI 생검 조직에서 CMV 감염을 검출하는 매우 민감한 특정입니다. 특히 유용한 모호 CMV IHC 염색 패턴이나 CMV에 대한 임상 적으로 매우 의심스러운 가진 GI 생검에의 qPCR의 성능입니다. 전통적인 조직학에 비해 GI 생검 재료 qPCR의 테스트는 따라서 이전보다 효과적인 환자 관리 선도, 단시간에 정확한 진단을 용이하게 할 수있다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 인물의 준비 노력이 원고를 준비하는 그녀의 도움 에이미 Thomasson, 그리고 프레드릭 Skarstedt 라이언 크리스티을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Microfuge tubes | Costar | 3620 | |
| Serrated forceps | Electron Microscopy Services | 62086-1S | Micro Forceps MF-1 |
| Tabletop centrifuges (microfuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylene | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 gallon |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| Microtome | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler centrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Cooling Block | Roche | 10800058001 | |
| LightCycler Capping Tool | Roche | 3357317 | |
| Color Compensation Kit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μl Capillaries | Roche | 1 909 339 | |
| Blades | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge low profile |
References
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