Summary
מחקר זה מתאר שיטה מפורטת לבידוד ואפיון של תאי סרטן שחלות ראשוניים מדגימות קליניות מוצקות. דגימות קליניות בסרטן השחלות חשופים לעיכול אנזימטי לקבל סרטן קיימא, ללא פיברובלסטים אפיתל השחלות תאים (EOC) מתאים במיוחד עבור יישומים במורד הזרם.
Abstract
כלים אמינים לחקירת ייזום סרטן השחלות ואת ההתקדמות נחוצים בדחיפות. בעוד שהשימוש בשורות תאי סרטן השחלות נשאר כלי רב ערך להבנת סרטן השחלות, יש השימוש בם מגבלות רבות. אלה כוללים את חוסר ההטרוגניות והשפע של שינויים גנטיים הקשורים passaging הממושך במבחנה. כאן אנו מתארים שיטה המאפשרת להקמה מהירה של תאי סרטן שחלות ראשוניים ליצור דגימות קליניות מוצקות שנאספו בזמן הניתוח. השיטה מורכבת מהכפפת דגימות קליניות לעיכול אנזימטי ל30 דקות. ההשעיה התא בודדת מותרת לגדול ויכולה לשמש ליישומים במורד הזרם, כולל הקרנת סמים. היתרון של שורות תאי סרטן השחלות עיקריות על שורות תאי סרטן השחלות הוקמו הוא שהם מייצגים את הדגימות הקליניות הספציפיות המקוריות הם נגזרים וניתן להפיק מן האתרים שונים אם פרימהסרטן השחלות ר"י או גרורתי.
Introduction
למרות השכיחות הנמוכה יחסית שלה, סרטן השחלות הוא הקטלני ביותר של מחלות גינקולוגיות והגורם המובילים החמישי של מקרי מוות מסרטן בקרב נשים 1,2. זאת, בעיקר בשל המחסור בכלים אמינים ומודלים שנאמנו לסכם ייזום והתקדמות המחלה 3. רוב הידע שלנו היום על סרטן השחלות היה אפשרי באמצעות השימוש בתאים הונצחו השחלות אפיתל פני השטח (IOSEs), שורות תאי סרטן השחלות וסרטן השחלות תאים ראשוניים התאוששו מ4-7 הנוזלים הרעיל. למרבה הצער, יש לו השימוש בם מספר מגבלות, כולל מספר השינויים הגנטיים ופנוטיפי הקשורים בתהליך הנצחה או במעברי מבחנה וההטרוגניות של האוכלוסייה כתוצאה מהכנת נוזלים רעילה.
לכן, תאי סרטן השחלות עיקריים הנגזרים מדגימות מוצקות לזיהוי והספציפיים של סרטן השחלות מייצגים uniquכלי דואר לחקר התפתחות סרטן השחלות.
הקשיים העיקריים המעורבים בתאים הממאירים אלה קבלת הם תוצאה של צמיחת יתר של תאי סטרומה או fibroblasts יחד עם הפסד של כדאיות וחוסר המוקדם של יכולת שגשוג בתרבות של תאי EOC אלה. כמה שיטות ליצירת תא בודד השעיות מגידולים מוצקים קיימות כיום, באמצעים מכאניים או ניתוק האנזימטית, לעומת זאת טכניקות מסוימות להניב כמות גדולה יותר של התוצאה המועדפת 8. כאן, אנו מראים כי עיכול אנזימטי עם dispase השני תוצאות בהתאוששות יעילה של תאי EOC קיימא, ללא פיברובלסטים. תרבויות EOC מה שהושגו הן רגישות מאוד למניפולציה גנטית ושימושיות גם בבדיקות סמים, מצביעים על כך שתרבויות EOC אלה מתאימות ליישומים רבים במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה
דגימות מוצקות של סרטן השחלות התקבלו ממתקן אוניברסיטת מינסוטה רכש רקמות (TPF) לאחר מוסדי מועצה לביקורת הוועדה: אישור דירקטוריון הסובייקט אנושי (IRB).
1. התקנה מגיב
- להכין מדיום DMEM שלם על ידי השלמת DMEM עם 10% FBS, ו100 יחידות פניצילין, סטרפטומיצין. אחסן את המדיום על 4 מעלות צלזיוס וחמה 37 מעלות צלזיוס לפני שימוש.
- dispase aliquot השני באמצעי אחסון נפרד של 5-10 מיליליטר, כדי למנוע הקפאה מרובה מפשיר ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במקפיא ללא nonfrost.
2. אוסף רקמות
- לאסוף דגימות מוצקות של סרטן השחלות (~ 5 גרם בגודל) בזמן הניתוח מאזורי macroscopically זוהו כסרטן על ידי פתולוג. דגימות הקליניות מזוהה דה ונרשמו על פי פרוטוקולים מוסדיים.
- הנח דגימות בסטרילי, scהמכסה REW, פוליפרופילן דגימות מיכל מלא ב30 מיליליטר של PBS קר כקרח. להעביר את הדגימות מהמעבדה לפתולוגיה כירורגית למעבדת המחקר לעיבוד על קרח, ובתוך 30 דקות מאיסוף דגימה (איור 1).
3. עיבוד רקמות
- עבודה בתנאים סטריליים, להעביר את הדגימות על צלחת פטרי (60 מ"מ x 60 מ"מ) המכיל 10 מיליליטר של PBS הטרי קר כקרח, ובאמצעות סכין סטרילי גילוח, לחתוך יותר לתוך החתיכות אפשריות (2 מ"מ או פחות) הקטנות ביותר ( 2A דמויות ו2 ב ').
- העבר את הרקמות טחונות לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מכיל 10 מיליליטר של prewarmed (37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות) dispase השני (2.4 U / ml) בDMEM ולדגור על 5% CO 2 ו37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. כדי להבטיח עיכול מיטבי של הדגימות, להתסיס ידני תרחיף התא כל 5 דקות.
- לאחר 30 דגירה דקות, העברה (באמצעותפיפטה סרולוגיות 10 מיליליטר) תרחיף התאים על גבי מסננת תא (70 רשת מיקרומטר) ממוקם על גבי צינור חרוטי 50 מיליליטר ולהחיל לחץ עדין נגד הרשת באמצעות בוכנת מזרק. לבטל את כל רקמת undissociated (שנותרה בחלק העליון של הרשת) ולאסוף את ההשעיה התא שהושגה בצינור חרוטי סטרילי 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב320 XG במשך 7 דקות ב 4 ° C (איור 3).
- בטל supernatant ו resuspend התא גלולה ב 10 מיליליטר של DMEM המכיל 10% FBS.
- דגירה ההשעיה התא בצלחת פטרי ב 5% CO 2 ו37 ° C (איור 4).
- שינוי הבינוני לאחר 24 שעות מהציפוי הראשוני. זה מאפשר להסרת פסולת הסלולר ורוב אריתרוציטים הווה בתרבות.
- לשנות את המדיום כל שלושה ימים בשבועיים שלאחר מכן, לאחר שהתרבויות של EOC העיקרי מוכנות ליישומים במורד הזרם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דגימות קליניות טריות של סרטן השחלות נאספות לאחר הניתוח (איור 1) וחותכים לחתיכות קטנות (2A דמויות ו2B) המהוות את תרחיף התא. זה מאפשר חשיפה אופטימלית של הדגימות לטיפול אנזימטי. תרחיף תא חשוף לעיכול אנזימטי וטופחו על C ° 37 ל30 דקות. במהלך זמן הדגירה slurry הופך עכור יותר ויותר (במיוחד לאחר כל תסיסה) וזה סימן של disaggregation רקמות. בסוף זמן הדגירה, התרחיף מועבר על גבי מסננת תא להפריד תאי EOC מכל רקמת undissociated (איור 3). ההשעיה התא התאוששה ממוקמת ב5% CO 2 ו37 ° C (igure F 4). בשלב זה את המורפולוגיה של תרביות התאים חושפת את נוכחותם של שני תאי EOC כהשעית תא בודדת ובגושים קטנים. התרבות בנקודה זו גם חושפת את presen הספירה של אריתרוציטים ופסולת קטנה כפי שמוצג באיור 5. חשוב לציין בעת EOC יהיה לאט (על פני תקופה של 1-3 ימים) לדבוק בפלסטיק, אריתרוציטים ופסולת תא לא יהיה והם יהיו בסופו וההדרגה "ייעלמו מהתרבות". ביום 3 מציפוי ראשוני, תרבויות EOC להראות הגדלת אשכולות חסיד EOC תא והדרגה פחות כדורית אדומה ופסולת כפי שמוצג באיור 6. ביום 6-7, תאי EOC יוצרים צורות כמו מערבולת (חץ) ומתחילים להתפשט לפלסטיק כדי ליצור אגרגטים רב תאיים גדולים יותר מובילים למורפולוגיה המרוצפת האופיינית לתאי EOC כפי שמוצגים באיור 7. ביום 14, תאי EOC בדרך כלל להיות מחוברות (איור 8) וכעת הם מוכנים לבדיקה ויישומים במורד הזרם.
pload/51581/51581fig1.jpg "/>
איור 1. האוסף של דגימות קליניות. דגימות מוצקה של סרטן השחלות נאספים בזמן הניתוח ולהציב מכסה בורג, מיכל מלא ב30 מיליליטר של PBS קר כקרח סטרילית, דגימת פוליפרופילן.
איור 2. עיבוד של דגימות קליניות. א) דגימה מוצקה מועברת על גבי צלחת פטרי המכילה 10 מיליליטר של טרי, 1x PBS. ב 'קר כקרח) דגימות קליניות לחתוך עוד יותר לחתיכות של כ -2 מ"מ בגודל.
ass = "jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 3. הפרדה של תאים מרקמות EOC undissociated. בעקבות עיכול אנזימטי, דגימות קליניות מועברות על גבי מסננת תא ולחץ עדין מיושם בדגימות קליניות מתעכלים באמצעות בוכנת מזרק. זה יאפשר לניתוק מכאני של EOC מרקמות ושחזור של תאי EOC חיבור.
איור 4. ציפוי של תאים וכתוצאה מהשעית EOC. לאחר הסרת כל רקמות undissociated, ההשעיה תא centrifuged וresuspended ב10 מיליליטר של DMEM המשך10% FBS aining וטופחו בצלחת פטרי ב 5% CO 2 ו37 ° C.
איור 5. מורפולוגיה של תרביות תאי EOC מייד לאחר עיבוד. תא השעיה מייד לאחר ציפוי תערוכות EOC כהשעיות תא בודדות ובגושים (שניהם מסומנים על ידי החיצים), אריתרוציטים ופסולת תא עדיין בשפע בשלב זה. ההגדלה מקורית, 20X.
איור 6. מורפולוגיה של תרביות תאי EOC ביום 3 לאחר ציפוי תרבית תאים. EOC ביום 3 לאחר ציפוי תערוכות למחצה חסיד ג EOCאשכול ell (מצויינים על ידי החץ) וזיהום כדורית אדומה פחות. ההגדלה מקורית, 20X.
איור 7. תרבויות EOC הוקמו לאחר שבוע מציפוי התרבות. תא EOC שבוע אחד לאחר ציפוי ראשוני מציגה אשכולות כמו מערבולת של תאים מתפשטים על הפלסטיק בתרבית הרקמה. ההגדלה מקורית, 20X.
איור 8. תרבויות המחוברות EOC. monolayer ומחוברות של תאי EOC מראים את המורפולוגיה המרוצפת אפיתל הטיפוסית לאחר 14 ימים בתרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבנה טובה יותר של האטיולוגיה סרטן השחלות ופיתוח היא חיונית לשיפור התוצאות של נשים מושפעות מהמחלה ההרסנית הזאת. בהקשר זה, השימוש בהוקם ו" זמין מסחרי "שורת תאי סרטן השחלות הייתה ללא ספק שימושית מאוד. עם זאת, היום אנחנו יודעים ששורות תאי הסרטן אינן נציג של הגידול האנושי הם מקורם בהיבטים רבים, כולל חוסר ההטרוגניות 9,10.
כאן אנו מדווחים שיטה מהירה ואמינה לבידוד ותרבית של תאי סרטן שחלות ראשוניים ישירות מדגימות קליניות של סרטן השחלות בתוך 30 דקות של בידוד דגימה כירורגית.
מכיוון שהתאים הראשוניים מבודדים מדגימה מוצקה לעומת מיימת נוזל, יש לזה את היתרון של בידוד תאים משל המחלה בשלבים מוקדמים לפני הזמן שבו היווצרות נוזל מיימת מתרחשת. טכניקה זו יש גם את עו"דantage של בידוד תאי סרטן שחלות ראשוניים מאתר ספציפי. ההצלחה בהשגת תאים סרטני קיימא עיקריים שחלות באמצעות פרוטוקול זה תלויה במידה רבה באיזו מהירות המדגם יכול להיות מעובד לאחר ניתוח. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש קיבלו את הדגימות תוך 30 דקות מניתוח. אם זה לא אפשרי, יש לשמור את הדגימה ב 4 ° C (PBS) למשך לילה ומעובד ביום שלמחרת. מניסיוננו, עיבוד של דגימות הבאות אחסון הלילה מקטין את התשואה. חשיפה לdispase השני למשך זמן ארוך יותר מאשר 30 דקות גם מקטינה את כדאיות תא ולא צריך להיות מבוצעת. אלטרנטיבה לdispase טיפול השני יכולה להיות טיפול עם collagenase או hyaluronidase. עם זאת, זה תוצאות בתשואה ירדה 8. בגלל השונות הגדולות בדגימות קליניות, חלקם יכולים להיות זיהום תא דם אדום גדול יותר בהשוואה לאחרים. אם זה המקרה, אנו ממליצים "כביסה" רקמות טחונות (שלב3.1) עם PBS לפני חושף אותם לעיכול אנזימטי. זה יקטין את מספר תאי דם האדומים בהכנה וסופו של דבר להקל על ההדבקה של תאי האפיתל הראשוניים.
בגלל הדגימות הקליניות אינן סטריליים (הם מאבדים את העקרות ברגע שהם מגיעים למעבדה לפתולוגיה כירורגית), זה הוא קריטי כדי לבצע את כל השלבים בתנאים סטריליים לחלוטין. בעוד הזיהום של התרבות אפשרי, בדרך כלל זה קורה בפחות מ -10% מהמקרים. הפרוטוקול לעיל ניתן להשתמש עם כל עקביות של דגימה קלינית.
המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא שמספר התאים התאוששו מדגימות תלויה מאוד בגודל של הדגימות שסופקו. הגודל של דגימה אופיינית הוא כ 3 ס"מ X 3 סנטימטר. מגבלה נוספת היא מיוצגת על ידי העובדה שבזמן שתאי סרטן השחלות עיקריים לגדול באופן אקספוננציאלי עד 10 מעברים במבחנה (ולכן proviדינג ההזדמנות לעשות מניות קיימא) שהם בסופו להזדקן ולמות, ובכך להגביל את הזמינות של תאים מתורם יחיד. למרות שאנו לא לבצע כל הפרדה של תאים סרטניים מfibroblasts, אנו משערים כי (10%) ריכוז הגבוה היחסי של סרום לאורך כל התהליך עשוי לתת תאי סרטן השחלות יתרון הישרדותי על פני fibroblasts. כמו כן סביר להניח שתאים שנוטים פחות להפרדה מתא סטרומה (fibroblasts) לא יכולים disaggregate ויישארו במסנן במהלך הפרדה.
תאים שהושגו עם פרוטוקול זה הם מתאימים ביותר עבור יישומים עתידיים, כולל חקירות שמטרתו להבין את התהליכים שהובילו לייזום סרטן השחלות ופיתוח. יישומים עתידיים כוללים גם שימוש בתאים ראשוניים אלה עבור במבחנה בבדיקת vivo של סוכני כימותרפיה חדשניים לסרטן השחלות, כמו גם סמנים ביולוגיים לגילוי מוקדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לצוות של מתקן רכש רקמות של אוניברסיטת מינסוטה לקבלת סיוע באיסוף דגימות רקמת מטופל. עבודה זו נתמכה על ידי תכנית משרד ההגנה חקר סרטן השחלות (OCRP) OC093424 לMB, על ידי מחקר רנדי מכונת גילוח למלחמה בסרטן והקרן הקהילתית לMB, על ידי השחלות הברית למלחמה בסרטן מינסוטה לMB ועל ידי הקרן לגינקולוגיה אונקולוגיה המחלקתית לייט. היו הממנים שום תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנה של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
- Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
- Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
- Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
- Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
- Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
- Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
- Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
- Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
- Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).
