Summary
Denna studie beskriver en detaljerad metod för isolering och karakterisering av primära ovariala cancerceller från fasta kliniska prover. Ovarian cancer kliniska prover utsätts för enzymatisk nedbrytning för att få livskraftiga, fibroblast fria epitelial ovarialcancer (EOC) celler mycket lämplig för tillämpningar efter.
Abstract
Finns ett akut behov tillförlitliga verktyg för att undersöka äggstockscancer initiering och progression. Medan användningen av äggstockscancercellinjer fortfarande ett värdefullt verktyg för att förstå äggstockscancer, har deras användning många begränsningar. Dessa inkluderar bristen på heterogenitet och den uppsjö av genetiska förändringar som förknippas med förlängd in vitro aging. Här beskriver vi en metod som möjliggör snabb etablering av primära äggstockscancerceller bilda fasta kliniska prover som samlats in i samband med operationen. Metoden består i att utsätta kliniska prover för enzymatisk nedbrytning i 30 min. Den isolerade cellsuspension tillåts växa och kan användas för efterföljande ansökan inklusive drogscreening. Fördelen med primär äggstockscancercellinjer över etablerade äggstockscancercellinjer är att de är representativa för de ursprungliga specifika kliniska prover de härrör från, och kan härledas från olika platser oavsett primary eller metastaserad äggstockscancer.
Introduction
Trots sin relativt låga förekomsten, är äggstockscancer den dödligaste av de gynekologiska sjukdomar och den femte vanligaste orsaken till dödsfall i cancer bland kvinnor 1,2. Detta är främst på grund av bristen på tillförlitliga verktyg och modeller som troget rekapitulera initiering och progression av sjukdomen 3. De flesta av vår kunskap i dag om äggstockscancer har varit möjligt genom användning av förevigat äggstock yta epitelceller (IOSEs), äggstockscancer cellinjer och primära äggstockscancerceller som återvunnits från ascitesvätska 4-7. Tyvärr har deras användning flera begränsningar, inklusive ett antal genetiska och fenotypiska förändringar i samband med odödliggörande process eller in vitro-passager och heterogenitet befolkningen till följd av ascitesvätska förberedelser.
Därför primära äggstockscancer celler från identifierbara och specifika fasta exemplar av äggstockscancer utgör en unique verktyg för att studera äggstockscancer progression.
De största svårigheterna i att få dessa maligna celler beror på en överväxt av stromaceller eller fibroblaster tillsammans med förlust av livskraft och för tidig brist på proliferativ kapacitet i kulturen i dessa EOC celler. Flera metoder för att skapa encelliga suspensioner från solida tumörer finns idag, genom mekaniska medel eller enzymatisk dissociation, men vissa tekniker ger en större mängd av det föredragna resultatet 8. Här visar vi att enzymatisk spjälkning med dispas II leder till en faktisk återställande av livskraftiga, fibroblast fria EOC celler. De så erhållna EOC kulturer är mycket mottagliga för genetisk manipulation och är också användbara i drogscreeningtest, vilket tyder på att dessa EOC kulturer är lämpliga för många tillämpningar i efterföljande led.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethics Uttalande
Fasta exemplar av äggstockscancer erhölls från University of Minnesota Facility Tissue upphandling (TPF) efter Institutional Review Board kommitté: Human Ämne Board (IRB) godkännande.
1. Reagens Setup
- Förbered Komplett DMEM-medium genom att komplettera DMEM med 10% FBS och 100 enheter penicillin-streptomycin. Förvara medium vid 4 ° C och värm till 37 ° C före användning.
- Alikvot dispas II i separata volymer av 5 till 10 ml för att undvika flera frys tinar och förvara vid -20 ° C i en nonfrost fria frys.
2. Tissue Collection
- Samla fasta exemplar av äggstockscancer (~ 5 gi storlek) vid tiden för operationen från områden som makroskopiskt identifierats som cancer av en patolog. Kliniska prover är de-identifieras och registreras i enlighet med institutionella protokoll.
- Placera proverna i en steril, screw lock, prover polypropylen behållare fylld med 30 ml iskall PBS. Transportera proverna från den kirurgiska patologi laboratorium till forskningslaboratoriet för bearbetning på is, och inom 30 minuter från provtagning (Figur 1).
3. Vävnadsbearbetning
- Att arbeta under sterila betingelser, överför proven till en petriskål (60 mm x 60 mm) innehållande 10 ml färsk, iskall PBS och med användning av ett sterilt rakblad, ytterligare skuren i de minsta bitarna möjliga (2 mm eller mindre) ( Fig. 2A och 2 B).
- Överför den finhackade vävnader in i ett 15 ml koniskt rör innehållande 10 ml av förvärmd (37 ° C under 30 min) dispas II (2,4 U / ml) i DMEM och inkubera vid 5% CO2 och 37 ° C under 30 min. För att säkerställa optimal nedbrytning av proverna, skaka manuellt celluppslamningen var 5 min.
- Efter 30 min inkubation, överföring (med användningen 10 ml serologisk pipett) cellen uppslamningen på en cell sil (70 um mesh) placerades på toppen av en 50 ml koniskt rör och applicera ett lätt tryck mot mesh med användning av en sprutkolv. Kassera odissocierad vävnad (kvar på toppen av mesh) och samla den erhållna cellsuspensionen i 50 ml steril koniska rör. Centrifugera vid 320 x g under 7 min vid 4 ° C (figur 3).
- Kasta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 ml av DMEM innehållande 10% FBS.
- Inkubera cellsuspensionen i en petriskål vid 5% CO2 och 37 ° C (figur 4).
- Ändra mediet efter 24 h från den initiala pläteringen. Detta möjliggör avlägsnande av cellrester och majoriteten av de erytrocyter som finns i kulturen.
- Ändra mediet var tredje dag för följande två veckor, varefter de i primära EOC är redo för tillämpningar efter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Färska kliniska prover av äggstockscancer samlas efter operation (Figur 1) och skär i små bitar (fig. 2A och 2B) som utgör cell slurry. Detta gör det möjligt för optimal exponering av proverna för den enzymatiska behandlingen. Cell uppslamning utsätts för enzymatisk digerering och inkuberades vid 37 ° C under 30 min. Under inkubationstiden uppslamningen blir alltmer grumlig (särskilt efter varje omröring) och detta är ett tecken på vävnads disaggregering. Vid slutet av inkubationstiden uppslamningen överfördes på ett cellfilter för att separera EOC celler från någon icke dissocierad vävnad (Figur 3). Den utvunna cellsuspensionen placeras vid 5% CO2 och 37 ° C (F igure 4). I detta skede morfologin för cellkulturer visar förekomst av både EOC celler som en enkelcellsuspension och i små klumpar. Kulturen på denna punkt avslöjar också den pre ce av erytrocyter och små skräp som visas i figur 5. Huvudsakligen samtidigt EOC långsamt (under en period av 1-3 dagar) ansluter sig till plast, erytrocyter och cellfragment kommer inte, och de kommer så småningom och progressivt "försvinner från kulturen". Vid dag 3 från initial plätering, visar EOC kulturer ökar vidhäftande EOC cell kluster och progressivt mindre erytrocyt och skräp som visas i figur 6. Vid dag 6-7, EOC celler bildar virvelliknande former (pil) och börjar sprida sig till plasten för att bilda större multicellulära aggregat som leder till det typiska gatsten morfologi EOC-celler såsom visas i fig. 7. Vid dag 14, EOC celler blir vanligtvis sammanflytande (Figur 8) och är nu redo för efterföljande testning och applikationer.
pload/51581/51581fig1.jpg "/>
Figur 1. Insamling av kliniska prover. Fasta exemplar av äggstockscancer samlas vid tidpunkten för kirurgi och placeras i en steril, skruvlock, polypropylen provbehållare fylld med 30 ml iskall PBS.
Figur 2. Behandling av kliniska prover. A) Fasta exemplar som överförs på en petriskål med 10 ml av färsk, iskall 1x PBS. B) Kliniska prover skäras ytterligare i bitar ca 2 mm i storlek.
Figur 3. Separation av EOC celler från odissocierad vävnader. Efter enzymatisk nedbrytning, är kliniska prover överförs till en cell sil och ett lätt tryck appliceras på de uppdelade kliniska prover med hjälp av en sprutkolv. Detta möjliggör mekanisk avskiljning av EOC från bindväv och återvinning av EOC celler.
Figur 4. Plätering av resulte EOC celler suspension. Efter avlägsnande av eventuella icke dissocierad vävnad cellsuspensionen centrifugerades och återsuspenderades i 10 ml av DMEM fortsaining 10% FBS och inkuberades i en petriskål vid 5% CO2 och 37 ° C.
Figur 5. Morfologi av EOC cellkulturer omedelbart efter bearbetning. Cell suspensionen omedelbart efter plätering visar EOC som en enda cell-suspensioner och i klumpar (båda visas med pilarna), erytrocyter och cellfragment fortfarande finns i överflöd på detta stadium. Original förstoring, 20X.
Figur 6. Morfologi av EOC cellkulturer vid dag 3 efter plätering. EOC cellodling på dag 3 efter plätering visar semi-vidhäftande EOC cell kluster (som indikeras av pilen) och mindre kontamination erytrocyt. Original förstoring, 20X.
Figur 7. Etablerade EOC kulturer efter en vecka från bordläggningen. EOC cellodling en vecka efter första plätering visar virvel-liknande kluster av celler som sprids på vävnadsodling plast. Original förstoring, 20X.
Figur 8. Confluent EOC kulturer. Confluent monolager av EOC celler visar typiska epitel kullersten morfologi efter 14 dagar i odling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En bättre förståelse av äggstockscancer etiologi och utveckling är avgörande för att förbättra resultatet av kvinnor som drabbats av denna förödande sjukdom. I detta sammanhang, att använda etablerade och "kommersiellt tillgänglig" äggstockscancer cellinje har utan tvekan varit oerhört användbart. Men i dag vet vi att cancercellinjer inte är representativa för den mänskliga tumören de kom från i många aspekter, bland annat bristen på heterogenitet 9,10.
Här rapporterar vi en snabb och tillförlitlig metod för isolering och odling av primära äggstockscancerceller direkt från kliniska prover av äggstockscancer inom 30 min av kirurgiska exemplar isolering.
Eftersom de primära cellerna är isolerade från ett fast prov kontra askitesvätska, har detta den fördelen att isolera celler från tidiga skeden av sjukdomen före den tidpunkt, när askitesvätska bildning sker. Denna teknik har också den advantage isolera primär äggstockscancerceller från en viss plats. Framgången med att få livskraftiga primära äggstockscancerceller med hjälp av detta protokoll är till stor del beroende av hur snabbt provet kan bearbetas efter operation. För bästa resultat bör proverna tas emot inom 30 minuter från kirurgi. Om detta inte är möjligt, ska provet förvaras vid 4 ° C (i PBS) över natten och behandlas påföljande dag. Enligt vår erfarenhet, bearbetning av prover efter förvaring över natten minskar utbytet. Exponering för dispas II längre än 30 minuter minskar också cellernas livskraft och bör inte utföras. Ett alternativ till dispas II behandling kan behandling med kollagenas och hyaluronidas. Detta resulterar emellertid i en minskad avkastning 8. På grund av den stora variationen i kliniska prover, kan vissa ha större röda blodförorening cell jämfört med andra. Om så är fallet, föreslår vi att "tvätta" de malet vävnad (steg3,1) med PBS före att utsätta dem för enzymatisk spjälkning. Detta kommer att minska antalet röda blodkroppar i förberedelserna och i slutändan underlätta vidhäftningen av de primära epitelceller.
Eftersom de kliniska prover är inte sterila (de förlorar sterilitet så fort de anländer till kirurgisk patologi laboratorium), är det viktigt att utföra alla steg under strikt sterila förhållanden. Även om kontaminering av odlingen är möjlig, typiskt den förekommer i mindre än 10% av fallen. Protokollet ovan kan användas med någon konsekvens av ett kliniskt prov.
Den huvudsakliga begränsningen med detta protokoll är att antalet celler återvunna från varje prov är i hög grad beroende på storleken på de prover som föreskrivs. En typisk exemplar storlek är ca 3 cm x 3 cm. En annan begränsning är representerat av det faktum att medan primära ovariala cancerceller växa exponentiellt under upp till 10 passager in vitro (därför bestämding möjlighet att göra livskraftiga bestånd) de slutligen senesce och dör, vilket begränsar tillgången på celler från en enda donator. Även om vi inte utför någon separation av tumörceller från fibroblaster, antar vi att den relativt höga (10%) koncentration av serum under hela processen kan ge äggstockscancerceller en överlevnadsfördel över fibroblaster. Det är också troligt att celler som är mindre benägna att separation från stromal facket (fibroblaster) inte kan dela upp och kommer att förbli på filtret under separationen.
Celler som erhålls med detta protokoll är mycket lämpliga för framtida tillämpningar, inklusive undersökningar som syftar till att förstå de processer som leder till äggstockscancer initiering och utveckling. Framtida applikationer inkluderar även använda dessa primära celler för in vitro och in vivo-testning av nya kemoterapimedel för äggstockscancer samt biomarkörer för tidig upptäckt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka personalen på Facility Tissue Upphandling av University of Minnesota för hjälp med patientvävnadsprover samling. Detta arbete stöddes av Department of Defense Äggstockscancer Research Program (OCRP) OC093424 till MB, av Randy Shaver cancerforskning och gemenskapsfond till MB, vid Minnesotaäggstockscancer Alliance till MB och av Gynekologisk onkologi Institutions fond till MB. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
- Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
- Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
- Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
- Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
- Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
- Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
- Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
- Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
- Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).
