Summary
Cette étude décrit un procédé détaillé pour l'isolement et la caractérisation de cellules de cancer ovarien primaire à partir de spécimens cliniques solides. Spécimens cliniques sur le cancer de l'ovaire sont soumis à une digestion enzymatique pour obtenir viable, libre fibroblastes cancer épithélial de l'ovaire (COE) de cellules très approprié pour des applications en aval.
Abstract
Des outils fiables pour enquêter sur l'initiation de cancer de l'ovaire et la progression sont nécessaires d'urgence. Bien que l'utilisation de lignées de cellules de cancer de l'ovaire reste un outil précieux pour la compréhension du cancer de l'ovaire, leur utilisation a de nombreuses limites. Il s'agit notamment de l'absence d'hétérogénéité et la pléthore de modifications génétiques associées à des passages in vitro prolongée. Ici, nous décrivons une méthode qui permet de créer rapidement des cellules de cancer ovarien primaire forment les échantillons cliniques solides collectés au moment de la chirurgie. Le procédé consiste à soumettre les échantillons cliniques à une digestion enzymatique pendant 30 minutes. La suspension de cellules isolées est autorisé à croître et peut être utilisé pour une application en aval, y compris le criblage de médicaments. L'avantage de l'ovaire primaires des lignées cellulaires de cancer sur des lignées cellulaires de cancer de l'ovaire est établi qu'ils sont représentatifs des échantillons cliniques spécifiques originaux dont ils sont dérivés et peuvent être dérivées de différents sites si primacancer de l'ovaire ry ou métastatique.
Introduction
Malgré sa faible incidence, le cancer de l'ovaire est le plus meurtrier des maladies gynécologiques et la cinquième cause de décès par cancer chez les femmes 1,2. Ceci est principalement dû à l'absence d'outils et de modèles fiables qui récapitulent fidèlement l'initiation et la progression de la maladie 3. La plupart de nos connaissances d'aujourd'hui sur le cancer de l'ovaire a été possible grâce à l'utilisation de cellules immortalisées ovariennes épithéliales de surface (IOS), des lignées de cellules de cancer de l'ovaire et les cellules cancéreuses ovariennes primaires récupérées à partir du liquide d'ascite 4-7. Malheureusement, leur utilisation présente plusieurs limites, y compris un certain nombre de modifications génétiques et phénotypiques liées au processus d'immortalisation ou dans les passages in vitro et l'hétérogénéité de la population résultant de la préparation fluide ascite.
Par conséquent, les cellules ovariennes cancéreuses primaires dérivées à partir d'échantillons solides identifiables et spécifiques d'un cancer de l'ovaire représentent uniquoutil de e pour l'étude de la progression du cancer de l'ovaire.
Les principales difficultés rencontrées dans le ces cellules malignes obtention sont dues à une prolifération de cellules stromales ou les fibroblastes avec la perte de la viabilité et de l'absence prématurée de la capacité de prolifération dans la culture de ces cellules COE. Plusieurs méthodes pour créer une seule cellule suspensions de tumeurs solides existent actuellement, par des moyens mécaniques ou dissociation enzymatique, mais certaines techniques donnent une plus grande quantité de la solution privilégiée 8. Ici, nous montrons que la digestion enzymatique à la dispase II entraîne une récupération efficace des cellules de SOE gratuit fibroblastes viables. Les cultures COE ainsi obtenus sont très sensibles à la manipulation génétique et sont également utiles dans des tests de dépistage de drogue, ce qui indique que ces cultures SOE sont adaptés à de nombreuses applications en aval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Déclaration d'éthique
Échantillons solides de cancer de l'ovaire ont été obtenus par le Fonds pour l'Université du Minnesota tissus sur les marchés publics (TPF) après Comité Institutional Review Board: Conseil de sujets humains (CISR) approbation.
Une. Configuration de réactifs
- Préparer le milieu complet DMEM en la complétant avec du DMEM 10% FBS, et 100 unités de pénicilline-streptomycine. Stocker le milieu à 4 ° C et chaud à 37 ° C avant de l'utiliser.
- Aliquote dispase II dans des volumes séparés de 5-10 ml pour éviter le gel multiples dégèle et conserver à -20 ° C dans un congélateur sans nonfrost.
2. Collection de tissus
- Prélever des échantillons solides de cancer de l'ovaire (~ 5 g en taille) au moment de l'intervention chirurgicale à partir des zones macroscopiquement identifiés comme le cancer par un pathologiste. Les échantillons cliniques sont dé-identifiés et enregistrés conformément aux protocoles institutionnels.
- Placer les échantillons dans un stérile, scREW couvercle, le polypropylène spécimens récipient rempli avec 30 ml de PBS glacé. Le transport des spécimens de laboratoire de pathologie chirurgicale au laboratoire de recherche pour le traitement de la glace, et dans les 30 minutes à partir de la collecte de l'échantillon (Figure 1).
3. Traitement des tissus
- Travailler dans des conditions stériles, transférer les échantillons sur une boîte de Pétri (60 mm x 60 mm) contenant 10 ml de frais, PBS glacé et en utilisant une lame de rasoir stérile, outre les couper en plus petits morceaux possibles (2 mm ou moins) ( Figures 2A et 2B).
- Transférer les tissus hachés dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml d'préchauffé (37 ° C pendant 30 min) dispase II (2,4 U / ml) dans du DMEM et incuber à 5% de CO2 et à 37 ° C pendant 30 min. Pour assurer une digestion optimale des échantillons, agiter manuellement la suspension de cellules toutes les 5 min.
- Après 30 min d'incubation, le transfert (en utilisantune pipette sérologique de 10 ml) de la suspension cellulaire sur un tamis cellulaire (70 um de maille) placé sur le dessus d'un tube conique de 50 ml et d'appliquer une légère pression contre la grille, avec un piston de la seringue. Jeter n'importe quel tissu non dissocié (restant sur le dessus de la maille) et recueillir la suspension cellulaire obtenue dans le tube de 50 ml conique stérile. Centrifuger à 320 g pendant 7 minutes à 4 ° C (figure 3).
- Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de DMEM contenant 10% de FBS.
- Incuber la suspension de cellules dans une boîte de Petri à 5% de CO 2 et 37 ° C (Figure 4).
- Changer le milieu après 24 h de la plaque initiale. Ceci permet d'éliminer les débris cellulaires et la majorité des erythrocytes présents dans la culture.
- Changer le milieu tous les trois jours pendant les deux semaines suivantes, après quoi les cultures de primaire EOC sont prêts pour des applications en aval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Échantillons cliniques fraîches de cancer de l'ovaire sont recueillies après une intervention chirurgicale (figure 1) et coupées en petits morceaux (Figures 2A et 2B) constituant la suspension cellulaire. Cela permet d'obtenir une exposition optimale des spécimens pour le traitement enzymatique. Suspension cellulaire est exposée à une digestion enzymatique et on a incubé à 37 ° C pendant 30 min. Au cours de la période d'incubation de la suspension devient de plus en plus nuageux (en particulier après chaque agitation) et c'est un signe de désagrégation du tissu. A la fin de la période d'incubation, la suspension est transférée sur un tamis cellulaire pour séparer les cellules de SOE non dissocié à partir de n'importe quel tissu (Figure 3). La suspension cellulaire récupérée est placé à 5% de CO 2 et 37 ° C (F igure 4). A ce stade, la morphologie des cultures de cellules révèle la présence de deux cellules de SOE comme une suspension de cellules individuelles et en petits amas. La culture à ce point révèle également la présentation CE des érythrocytes et de petits débris, comme indiqué à la figure 5. Il est important alors que le COE va lentement (sur une période de 1-3 jours) adhérer au plastique, les érythrocytes et les débris cellulaires ne sera pas et ils finiront progressivement "disparaître de la culture". Au jour 3 de dépôt initial, les cultures COE montrent de plus en plus adhérentes amas de cellules COE et de moins en moins des érythrocytes et des débris comme le montre la figure 6. Par jour 6-7, les cellules forment COE formes tourbillonnantes comme (flèche) et commencent à se propager à la matière plastique pour former des agrégats multicellulaires grandes menant à la morphologie pavée typique des cellules COE comme le montre la figure 7. Au jour 14, les cellules deviennent généralement COE confluence (figure 8) et sont maintenant prêts pour les essais et les applications en aval.
pload/51581/51581fig1.jpg "/>
Figure 1. Prélèvement des échantillons cliniques. Les échantillons solides de cancer de l'ovaire sont recueillies au moment de la chirurgie et placé dans un couvercle à vis, contenant polypropylène spécimen stérile rempli avec 30 ml de PBS glacé.
Figure 2. Traitement des échantillons cliniques. A) spécimen solides transférés sur une boîte de Petri contenant 10 ml de frais, glacée 1x PBS. B) Les échantillons cliniques en outre coupées en morceaux d'environ 2 mm.
Figure 3. Séparation des cellules à partir de tissus non dissociées EOC. Après digestion enzymatique, les échantillons cliniques sont transférées sur un tamis cellulaire et une légère pression est appliquée sur les échantillons cliniques digérés à l'aide d'un piston de la seringue. Cela permet de détachement mécanique de COU de tissus conjonctifs et la récupération des cellules COE.
Figure 4. Plaquage de cellules résultant EOC suspension. Après l'élimination de tous les tissus non dissociées, la suspension cellulaire est centrifugée et remise en suspension dans 10 ml de DMEM containing 10% de FBS et incubées dans une boîte de Petri à 5% de CO 2 et 37 ° C.
Figure 5. Morphologie du COE cultures de cellules immédiatement après le traitement. Suspension cellulaire immédiatement après placage montre COE comme un seul suspensions cellulaires et en touffes (tous les deux indiqué par les flèches), les érythrocytes et les débris cellulaires abondent encore à ce stade. Grossissement 20X.
Figure 6. Morphologie des cultures de cellules de SOE à jour 3 après placage culture cellulaire. EOC au jour 3 après l'étalement montre semi-adhérent EOC cell groupe (indiqué par la flèche) et de la contamination des érythrocytes moins. Grossissement 20X.
Figure 7. Cultures COE établies après une semaine de placage culture cellulaire EOC. Une semaine après dépôt initial montre grappes de turbulence comme des cellules d'épandage sur le plastique de culture de tissus. Grossissement 20X.
Figure 8. Cultures Confluent COE. Confluent monocouche de cellules COE montrant la morphologie typique pavé épithéliale après 14 jours de culture.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Une meilleure compréhension de l'étiologie du cancer de l'ovaire et le développement est crucial pour améliorer les résultats des femmes touchées par cette maladie dévastatrice. Dans ce contexte, l'utilisation d'établi et "disponible dans le commerce" lignée de cellules de cancer de l'ovaire a sans doute été extrêmement utile. Cependant, nous savons aujourd'hui que les lignées cellulaires de cancer ne sont pas représentatifs de la tumeur humaine qu'ils proviennent dans de nombreux aspects, y compris l'absence d'hétérogénéité 9,10.
Ici, nous rapportons une méthode rapide et fiable pour l'isolement et la culture des cellules de cancer ovarien primaire directement à partir de spécimens cliniques du cancer de l'ovaire, dans les 30 min de l'isolement de l'échantillon chirurgical.
Parce que les cellules primaires sont isolées à partir d'un échantillon solide par rapport à un fluide d'ascites, ce qui a l'avantage d'isoler les cellules à partir de stades précoces de la maladie avant le moment où se produit la formation de liquide d'ascite. Cette technique a également l'advantage d'isoler des cellules de cancer ovarien primaire à partir d'un site spécifique. Le succès dans l'obtention de cellules viables de cancer de l'ovaire primaires en utilisant ce protocole est largement tributaire de la rapidité avec laquelle l'échantillon peut être traité après la chirurgie. Pour de meilleurs résultats, les échantillons doivent être reçues dans les 30 minutes de la chirurgie. Si cela n'est pas possible, les échantillons doivent être conservés à 4 ° C (dans du PBS) pendant la nuit et traitées le lendemain. Dans notre expérience, le traitement des échantillons après stockage pendant la nuit diminue le rendement. L'exposition à la dispase II pendant plus de 30 min réduit également la viabilité des cellules et ne doit pas être effectuée. Une alternative à la Dispase traitement II peut être un traitement avec de la collagénase ou hyaluronidase. Cependant, cela se traduit par une diminution de rendement 8. En raison de la grande variabilité dans les échantillons cliniques, certains peuvent avoir contamination de globules rouges plus grande par rapport aux autres. Si c'est le cas, nous vous proposons "laver" les tissus hachés (étape3,1) avec du PBS avant de les exposer à une digestion enzymatique. Cela permettra de réduire le nombre de globules rouges dans la préparation et, finalement, de faciliter l'adhérence des cellules épithéliales primaires.
Parce que les échantillons cliniques ne sont pas stériles (ils perdent stérilité dès qu'ils arrivent au laboratoire de pathologie chirurgicale), il est essentiel d'effectuer toutes les étapes dans des conditions strictement stériles. Bien que la contamination de la culture est possible, en général, il se produit dans moins de 10% des cas. Le protocole ci-dessus peut être utilisé avec n'importe quelle consistance d'un échantillon clinique.
La principale limitation de ce protocole est que le nombre de cellules récupérées à partir de chacun des échantillons est fortement dépendante de la taille des échantillons fournis. La taille typique d'un échantillon est d'environ 3 cm x 3 cm. Une autre limite est représentée par le fait que, bien que les cellules cancéreuses ovariennes primaires se développent de façon exponentielle jusqu'à 10 passages in vitro (donc dispoding la possibilité de faire des stocks viables) ils ont finalement vieillir et mourir, limitant ainsi la disponibilité de cellules à partir d'un seul donneur. Bien que nous ne réalisons pas de séparation des cellules tumorales de fibroblastes, nous faisons l'hypothèse que le nombre relativement élevé (10%) la concentration de sérum au long du processus peut donner des cellules de cancer de l'ovaire un avantage de survie sur les fibroblastes. Il est également probable que les cellules qui sont moins sujettes à la séparation d'avec le compartiment stromal (fibroblastes) peuvent ne pas ventiler et restent sur le filtre lors de la séparation.
Les cellules obtenues avec ce protocole sont particulièrement adaptés pour les applications futures, notamment d'enquêtes visant à comprendre les processus conduisant à l'initiation de cancer de l'ovaire et le développement. Les applications futures comprennent également l'utilisation de ces cellules primaires pour in vitro et in vivo des tests de nouveaux agents de chimiothérapie pour le cancer de l'ovaire ainsi que des biomarqueurs pour la détection précoce.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le personnel de l'installation de tissus sur les marchés publics de l'Université du Minnesota de l'aide pour la collecte des échantillons de tissus des patients. Ce travail a été soutenu par le programme du ministère de la Défense recherche sur le cancer de l'ovaire (OCRP) de OC093424 de Mo, par le Fonds communautaire pour MB Shaver Recherche sur le Cancer Randy, par le Minnesota ovaire Cancer Alliance pour Mo et par le fonds oncologie gynécologique du ministère de MB. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou de la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
- Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
- Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
- Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
- Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
- Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
- Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
- Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
- Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
- Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).
