Summary
इस अध्ययन ठोस चिकित्सीय नमूनों से प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है. डिम्बग्रंथि के कैंसर चिकित्सीय नमूनों बहाव के अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक उपयुक्त व्यवहार्य, fibroblast मुक्त उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर (EOC) कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए enzymatic पाचन के अधीन हैं.
Abstract
डिम्बग्रंथि के कैंसर दीक्षा और प्रगति की जांच के लिए विश्वसनीय उपकरणों की तत्काल जरूरत है. डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों का उपयोग डिम्बग्रंथि के कैंसर को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बना रहता है, उनके उपयोग कई सीमाएं हैं. ये विविधता की कमी और विस्तारित इन विट्रो passaging के साथ जुड़े आनुवंशिक परिवर्तन की बहुतायत में शामिल हैं. यहाँ हम प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं का तेजी से स्थापना के लिए अनुमति देता है एक तरीका है कि सर्जरी के समय में एकत्र ठोस चिकित्सीय नमूनों फार्म का वर्णन. विधि 30 मिनट के लिए enzymatic पाचन के लिए चिकित्सीय नमूनों को subjecting के होते हैं. पृथक सेल निलंबन बढ़ने की अनुमति दी है और दवा स्क्रीनिंग सहित बहाव के आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. स्थापित डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों पर प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों का लाभ वे से प्राप्त कर रहे हैं और अलग अलग साइटों है कि क्या से प्राप्त किया जा सकता मूल विशिष्ट नैदानिक नमूनों के प्रतिनिधि हैं कि है प्राइमाRY या metastatic डिम्बग्रंथि के कैंसर.
Introduction
अपने अपेक्षाकृत कम भार के बावजूद, डिम्बग्रंथि के कैंसर gynecological रोगों और महिलाओं 1,2 के बीच कैंसर से होने वाली मौतों का पांचवां प्रमुख कारण की घातक है. इस सच्चाई से रोग 3 की दीक्षा और प्रगति पुनरावृत्ति कि विश्वसनीय उपकरणों और मॉडल की कमी की वजह से है. डिम्बग्रंथि के कैंसर के बारे में हमारे ज्ञान आज के अधिकांश जलोदरग्रस्त द्रव 4-7 से बरामद अमर डिम्बग्रंथि सतह उपकला कोशिकाओं (IOSEs), डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों और प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के उपयोग के माध्यम से संभव हो गया है. दुर्भाग्य से, उनके उपयोग के स्थायीकरण की प्रक्रिया के साथ या इन विट्रो मार्ग में जुड़े आनुवंशिक और प्ररूपी परिवर्तन का एक नंबर और जलोदरग्रस्त तरल पदार्थ तैयार करने से उत्पन्न जनसंख्या की विविधता सहित कई सीमाएं हैं.
इसलिए, डिम्बग्रंथि के कैंसर की पहचान योग्य और विशिष्ट ठोस नमूनों से व्युत्पन्न प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को एक uniqu प्रतिनिधित्वडिम्बग्रंथि कैंसर की प्रगति का अध्ययन करने के लिए ई उपकरण.
प्राप्त इन घातक कोशिकाओं में शामिल मुख्य कठिनाइयों व्यवहार्यता का नुकसान और इन EOC कोशिकाओं की संस्कृति में proliferative क्षमता की समयपूर्व कमी के साथ साथ stromal कोशिकाओं या fibroblasts के एक ऊंचा के कारण होते हैं. ठोस ट्यूमर से एकल कक्ष निलंबन बनाने के लिए कई तरीकों वर्तमान में यांत्रिक साधनों या एंजाइमी हदबंदी के माध्यम से, हालांकि कुछ तकनीकों वरीय परिणाम 8 की एक बड़ी राशि उपज मौजूद हैं. यहाँ, हम बताते हैं कि व्यवहार्य, fibroblast मुक्त EOC कोशिकाओं का एक प्रभावी वसूली में dispase द्वितीय परिणामों के साथ enzymatic पाचन. तो प्राप्त EOC संस्कृतियों आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए अत्यधिक अतिसंवेदनशील होते हैं और भी दवा स्क्रीनिंग टेस्ट में उपयोगी होते हैं, इन EOC संस्कृतियों कई बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं कि यह दर्शाता है.
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Protocol
आचार विवरण
डिम्बग्रंथि के कैंसर के ठोस नमूनों संस्थागत समीक्षा बोर्ड समिति के बाद मिनेसोटा विश्वविद्यालय के ऊतक अधिप्राप्ति सुविधा (TPF) से प्राप्त किया गया: मानव विषय बोर्ड (आईआरबी) की मंजूरी.
1. अभिकर्मक सेटअप
- 10% FBS, और 100 इकाइयों पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन साथ DMEM सप्लीमेंट द्वारा पूरा DMEM मध्यम तैयार. 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम स्टोर और गर्म करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से पहले का उपयोग करने के लिए.
- कई फ्रीज से बचने के लिए 5-10 मिलीलीटर के अलग संस्करणों में विभाज्य dispase द्वितीय एक nonfrost मुक्त फ्रीजर में -20 डिग्री सेल्सियस पर thaws और दुकान.
2. ऊतक संग्रह
- Macroscopically एक रोगविज्ञानी द्वारा कैंसर के रूप में पहचान किए गए क्षेत्रों से सर्जरी के समय में डिम्बग्रंथि के कैंसर (आकार में ~ 5 ग्राम) की ठोस नमूनों ले लीजिए. नैदानिक नमूनों-de पहचान और संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार पंजीकृत हैं.
- एक बाँझ, अनुसूचित जाति में नमूनों रखेंREW ढक्कन, polypropylene ठंडा पीबीएस के 30 मिलीलीटर से भरा कंटेनर नमूनों. और नमूना संग्रह से 30 मिनट (चित्रा 1) के भीतर, बर्फ पर प्रसंस्करण के लिए अनुसंधान प्रयोगशाला के लिए शल्य विकृति प्रयोगशाला से नमूनों के परिवहन.
3. ऊतक प्रसंस्करण
- बाँझ शर्तों के तहत काम करते हुए, एक पेट्री डिश पर नमूने (60 मिमी x 60 मिमी) ताजा, ठंडा पीबीएस के 10 मिलीलीटर युक्त और आगे (2 मिमी या उससे कम) छोटी संभव टुकड़ों में काट एक बाँझ धार, का उपयोग (हस्तांतरण आंकड़े 2A और 2 बी).
- DMEM में dispase द्वितीय (2.4 यू / एमएल) (30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस) prewarmed के 10 एमएल युक्त एक 15 मिलीलीटर शांकव ट्यूब में कीमा बनाया हुआ ऊतकों स्थानांतरण और 30 मिनट के लिए 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. नमूनों का इष्टतम पाचन सुनिश्चित करने के लिए मैन्युअल सेल घोल हर 5 मिनट आंदोलन.
- 30 मिनट ऊष्मायन, स्थानांतरण (इस्तेमाल करने के बादएक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट) एक सेल झरनी (70 माइक्रोन जाल) पर सेल घोल एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर रखा और एक सिरिंज सवार का उपयोग जाल के खिलाफ एक कोमल दबाव लागू होते हैं. (जाल के शीर्ष पर शेष) किसी भी undissociated ऊतक त्यागें और 50 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में प्राप्त सेल निलंबन लीजिए. 4 डिग्री सेल्सियस पर 7 मिनट (चित्रा 3) के लिए 320 XG पर अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 10% FBS युक्त DMEM के 10 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend.
- सेल 5% सीओ 2 पर एक पेट्री डिश में निलंबन और 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 4) सेते हैं.
- प्रारंभिक चढ़ाना से 24 घंटे के बाद मध्यम बदलें. यह सेलुलर मलबे को हटाने और संस्कृति में मौजूद एरिथ्रोसाइट्स के बहुमत के लिए अनुमति देता है.
- मध्यम प्राथमिक EOC की संस्कृतियों बहाव के अनुप्रयोगों के लिए तैयार कर रहे हैं जिसके बाद निम्न दो सप्ताह के लिए हर तीन दिन, बदलें.
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Representative Results
डिम्बग्रंथि के कैंसर की ताजा चिकित्सीय नमूनों चित्रा (1) सर्जरी के बाद एकत्र की है और सेल घोल का गठन छोटे टुकड़ों (आंकड़े 2A और 2 बी) में कटौती कर रहे हैं. इस एंजाइमी उपचार के लिए नमूनों का इष्टतम प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है. सेल घोल enzymatic पाचन के संपर्क में है और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated है. ऊष्मायन समय के दौरान घोल (विशेष रूप से प्रत्येक आंदोलन के बाद) तेजी से बादल बन जाता है और इस ऊतक disaggregation का एक संकेत है. ऊष्मायन समय के अंत में, गारा किसी भी undissociated ऊतक (चित्रा 3) से EOC कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सेल झरनी पर स्थानांतरित किया है. बरामद सेल निलंबन 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस (एफ igure 4) पर रखा गया है. इस स्तर पर सेल संस्कृतियों की आकृति विज्ञान एक एकल कक्ष निलंबन के रूप में और छोटे clumps में दोनों EOC कोशिकाओं की उपस्थिति का पता चलता है. इस बिंदु पर संस्कृति भी presen का पता चलता है एरिथ्रोसाइट्स और चित्रा 5 में दिखाया गया के रूप में छोटे मलबे के CE. EOC धीरे धीरे (1-3 दिनों की अवधि में) प्लास्टिक, एरिथ्रोसाइट्स और सेल मलबे का पालन करना होगा महत्वपूर्ण बात है, जबकि ऐसा नहीं करेंगे और वे अंततः और उत्तरोत्तर "संस्कृति से गायब हो" होगा. प्रारंभिक चढ़ाना से 3 दिन तक, EOC संस्कृतियों पक्षपाती EOC सेल समूहों और 6 चित्र में दिखाया के रूप में उत्तरोत्तर कम एरिथ्रोसाइट और मलबे में वृद्धि दिखा. दिन 6-7 से, EOC कोशिकाओं ज़ुल्फ़ की तरह आकार (तीर) के रूप में और 7 चित्र में दिखाया गया है EOC कोशिकाओं के विशिष्ट cobblestone आकारिकी के लिए अग्रणी बड़ा बहुकोशिकीय समुच्चय के रूप में करने के लिए प्लास्टिक के लिए प्रसार करने के लिए शुरू करते हैं. 14 दिन से, EOC कोशिकाओं आम तौर पर मिला हुआ (चित्रा 8) बन गया है और अब नीचे की ओर परीक्षण और अनुप्रयोगों के लिए तैयार हैं.
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नैदानिक नमूनों का आंकड़ा 1. संग्रह. डिम्बग्रंथि के कैंसर के ठोस नमूनों सर्जरी के समय में एकत्र की है और ठंडा पीबीएस के 30 मिलीलीटर से भरा एक बाँझ, पेंच ढक्कन, polypropylene नमूना कंटेनर में रखा जाता है.
नैदानिक नमूनों की चित्रा 2. प्रसंस्करण. ए) ताजा, ठंडा 1x पीबीएस. बी के 10 एमएल युक्त एक पेट्री डिश पर स्थानांतरित ठोस नमूना) नैदानिक नमूनों आगे आकार में 2 मिमी के बारे में टुकड़ों में काट लें.
Undissociated ऊतकों से EOC कोशिकाओं के चित्रा 3. पृथक्करण. Enzymatic पाचन के बाद, नैदानिक नमूनों एक सेल झरनी पर स्थानांतरित कर रहे हैं और एक कोमल दबाव एक सिरिंज सवार का उपयोग करके पच नैदानिक नमूनों पर लागू किया जाता है. इस संयोजी ऊतक और EOC कोशिकाओं की वसूली से EOC के यांत्रिक टुकड़ी के लिए अनुमति देते हैं.
चित्रा 4. EOC कोशिकाओं निलंबन जिसके परिणामस्वरूप की चढ़ाना. किसी भी undissociated ऊतकों को हटाने के बाद, सेल निलंबन centrifuged है और DMEM आगे के 10 एमएल में resuspendedaining 10% FBS और 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पेट्री डिश में incubated
तुरंत तुरंत चढ़ाना के बाद प्रसंस्करण. सेल निलंबन के बाद EOC सेल संस्कृतियों का चित्रा 5. आकृति विज्ञान एक एकल कक्ष निलंबन के रूप में EOC से पता चलता है और clumps (दोनों तीर द्वारा संकेत) में, एरिथ्रोसाइट्स और सेल मलबे में अभी भी इस स्तर पर जाना लाजिमी है. मूल बढ़ाई, 20X.
3 दिन में EOC सेल संस्कृतियों का आंकड़ा 6. आकृति विज्ञान चढ़ाना अर्द्ध पक्षपाती EOC सी से पता चलता है के बाद 3 दिन में. EOC सेल संस्कृति चढ़ाना के बाद(तीर द्वारा संकेत) पक्ष क्लस्टर और कम एरिथ्रोसाइट संदूषण. मूल बढ़ाई, 20X.
चित्रा 7. प्रारंभिक चढ़ाना के बाद एक सप्ताह. EOC सेल संस्कृति चढ़ाना से एक सप्ताह के बाद स्थापित EOC संस्कृतियों टिशू कल्चर प्लास्टिक पर फैल कोशिकाओं की ज़ुल्फ़ की तरह समूहों से पता चलता है. मूल बढ़ाई, 20X.
चित्रा 8. मिला हुआ EOC संस्कृतियों. संस्कृति में 14 दिनों के बाद ठेठ उपकला cobblestone आकारिकी दिखा EOC कोशिकाओं का मिला हुआ monolayer.
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Discussion
डिम्बग्रंथि के कैंसर के एटियलजि और विकास का एक बेहतर समझ के लिए इस घातक रोग से प्रभावित महिलाओं के परिणाम में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस संदर्भ में, के उपयोग की स्थापना की और 'व्यावसायिक रूप से उपलब्ध "डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइन निस्संदेह काफी उपयोगी रहा है. बहरहाल, आज हम कैंसर कोशिका लाइनों वे विविधता 9,10 की कमी सहित कई पहलुओं में से उत्पन्न मानव ट्यूमर के प्रतिनिधि नहीं हैं कि पता है.
यहाँ, हम सीधे शल्य नमूना अलगाव के 30 मिनट के भीतर डिम्बग्रंथि के कैंसर के नैदानिक नमूनों से अलगाव और प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के संवर्धन के लिए एक तेजी से और विश्वसनीय विधि की रिपोर्ट.
प्राथमिक कोशिकाओं जलोदर द्रव बनाम एक ठोस नमूना से अलग कर रहे हैं क्योंकि यह पूर्व जलोदर द्रव गठन तब होता है जब समय पर रोग की प्रारंभिक अवस्था से कोशिकाओं को अलग करने का लाभ दिया है. इस तकनीक को भी adv हैएक विशिष्ट साइट से प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं को अलग करने की antage. इस प्रोटोकॉल का उपयोग व्यवहार्य प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को प्राप्त करने में सफलता नमूना सर्जरी के बाद कार्रवाई की जा सकती है कि कैसे जल्दी पर काफी हद तक निर्भर है. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, नमूनों सर्जरी से 30 मिनट के भीतर प्राप्त हो जाना चाहिए. यह संभव नहीं है, तो नमूना रातोंरात (पीबीएस) में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा और अगले दिन संसाधित किया जाना चाहिए. हमारे अनुभव में, रात भर भंडारण निम्न नमूनों के प्रसंस्करण उपज कम हो जाती है. अब से 30 मिनट के लिए dispase द्वितीय के संपर्क में भी सेल व्यवहार्यता कम कर देता है और नहीं किया जाना चाहिए. द्वितीय उपचार dispase के लिए एक वैकल्पिक collagenase या hyaluronidase के साथ इलाज किया जा सकता है. हालांकि, इस कमी हुई उपज 8 में यह परिणाम है. दूसरों की तुलना में क्योंकि नैदानिक नमूनों में महान परिवर्तनशीलता की, कुछ बड़े लाल रक्त कोशिका संदूषण हो सकता है. यदि यह मामला है, हम "धुलाई" कीमा बनाया हुआ ऊतकों (कदम का सुझाव3.1) पीबीएस के साथ पहले enzymatic पाचन के लिए उन्हें उजागर. इस तैयारी में लाल रक्त कोशिकाओं की संख्या कम करने और अंततः प्राथमिक उपकला कोशिकाओं के आसंजन की सुविधा होगी.
नैदानिक नमूनों (वे जैसे ही वे शल्य विकृति प्रयोगशाला में आने के रूप में बाँझपन खो) बाँझ नहीं होते हैं, क्योंकि यह सख्ती से बाँझ शर्तों के तहत सभी चरणों के प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है. संस्कृति के प्रदूषण संभव है, आम तौर पर यह मामलों के कम से कम 10% में होता है. ऊपर प्रोटोकॉल नैदानिक नमूना के किसी भी स्थिरता के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमा प्रत्येक नमूने से बरामद कोशिकाओं की संख्या प्रदान नमूनों के आकार पर निर्भर है कि है. एक ठेठ नमूना के आकार के बारे में 3 सेमी x 3 सेमी है. एक और सीमा तथ्य का प्रतिनिधित्व करती है कि प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं इन विट्रो में 10 मार्ग (इसलिए प्रावधानों के लिए तेजी से बढ़ने जबकिडिंग व्यवहार्य और देखिए बनाने के लिए अवसर) वे अंततः senesce और मर जाते हैं, इस प्रकार एक दाता से कोशिकाओं की उपलब्धता सीमित. हम fibroblasts से ट्यूमर कोशिकाओं के किसी भी जुदाई प्रदर्शन नहीं करते हैं, हम इस प्रक्रिया के दौरान सीरम के अपेक्षाकृत उच्च (10%) एकाग्रता डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं fibroblasts पर एक अस्तित्व लाभ दे सकता है कि परिकल्पना है. यह भी stromal डिब्बे (fibroblasts) से अलग होने के लिए कम संभावना है कि कोशिकाओं disaggregate नहीं हो सकता है और जुदाई के दौरान फिल्टर पर रहेगा कि संभावना है.
इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त कोशिकाओं डिम्बग्रंथि के कैंसर दीक्षा और विकास के लिए प्रमुख प्रक्रियाओं को समझने के उद्देश्य से जांच सहित भविष्य अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक उपयुक्त हैं. भविष्य का आवेदन भी इन विट्रो के लिए इन प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग गर्भाशय के कैंसर के साथ ही जल्दी पता लगाने के लिए बायोमार्कर के लिए उपन्यास रसायन चिकित्सा एजेंटों के विवो परीक्षण में शामिल हैं.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम मरीज के ऊतकों के नमूनों के संग्रह के साथ सहायता के लिए मिनेसोटा विश्वविद्यालय के ऊतक अधिप्राप्ति सुविधा के कर्मचारियों को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम एमबी मिनेसोटा डिम्बग्रंथि के कैंसर गठबंधन द्वारा और एमबी तक Gynecological कैंसर विज्ञान विभागीय कोष से, रैंडी शेवर कैंसर रिसर्च और एमबी के लिए सामुदायिक कोष द्वारा, रक्षा विभाग डिम्बग्रंथि के कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (ओसीआरपी) MB तक OC093424 द्वारा समर्थित किया गया. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
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