Summary
이 연구는 고체 임상 검체에서 기본 난소 암 세포의 분리 및 특성에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 난소 암 임상 검체는 다운 스트림 애플리케이션에 매우 적합 가능한, 섬유 아세포없는 상피 난소 암 (EOC) 세포를 얻기 위해 소화 효소를 실시하고 있습니다.
Abstract
난소 암의 개시 및 진행을 조사하는 신뢰할 수있는 도구가 절실히 필요합니다. 난소 암 세포주의 사용이 난소 암을 이해하기위한 유용한 도구가 남아 있지만, 이들의 사용은 많은 제한이있다. 이러한 이질성의 부족 및 확장 체외 계대과 관련된 유전 변경의 과다 있습니다. 여기에서 우리는 기본 난소 암 세포의 빠른 구축을 허용하는 방법은 수술시에 수집 된 고체 임상 검체를 형성 기술한다. 상기 방법은 30 분 동안 효소 소화에 임상 검체를 행하여 이루어져있다. 격리 된 세포 현탁액을 성장시킨다 및 약물 스크리닝 하류 애플리케이션에 사용될 수있다. 설립 난소 암 세포주 이상의 일차 난소 암 세포주의 이점은 그들이 유래되고 다른 사이트 여부로부터 유도 될 수있는 일본어 특정 임상 검체의 대표 점이다 프리마공예 또는 전이성 난소 암.
Introduction
상대적으로 낮은 발병률에도 불구하고, 난소 암은 부인과 질환과 여성, 2 중 암 사망의 다섯 번째 주요 원인의 치명적인입니다. 이 충실히 질병 3의 개시 및 진행을 요점을 되풀이 신뢰할 수있는 도구와 모델의 부족에 주로 기인한다. 난소 암에 대한 우리의 지식 오늘날 대부분 ascitic 유체 4-7로부터 회수 불멸화 난소 표면 상피 세포 (잃었 지), 난소 암 세포주 및 일차 난소 암 세포의 사용을 통해 가능했습니다. 불행히도, 그들의 사용은 불멸화 과정 또는 체외 통로에 관련된 유전자와 표현형의 변화의 수와 ascitic 유체 준비로 인한 인구의 이질성 등 여러 가지 제한 사항이 있습니다.
따라서 난소 암의 식별과 특정한 고체 시료 유래 차 난소 암세포 UNIQU을 나타내는난소 암의 진행을 연구하는 전자 도구입니다.
획득이 악성 세포에 관련된 주요 문제는 생존의 손실이 EOC 세포의 배양에서 증식 능력의 조기 부족과 함께 간질 세포 또는 섬유 아세포의 증식에 기인한다. 고형 종양에서 단일 세포 현탁액을 만들 수있는 몇 가지 방법은 현재 기계적인 방법 또는 효소 분해를 통해, 그러나 특정 기술을 선호하는 결과 8의 큰 금액을 산출 존재한다. 여기, 우리는 표시가 가능한, 섬유 아세포 무료 EOC 세포의 효과적인 복구 디스 파제 II 결과에 소화 효소. 이렇게 얻어진 EOC의 문화 유전자 조작에 매우 민감하고 또한 약물 선별 검사에 유용하다, 이러한 EOC 문화가 다양한 다운 스트림 애플리케이션에 적합하다는 것을 나타낸다.
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Protocol
윤리 정책
난소 암의 고체 시료는 기관 심사위원회위원회 후 미네소타 대학의 조직 조달 시설 (TPF)으로 하였다 : 인간의 제목위원회 (IRB)의 승인을.
1. 시약 설치
- 10 % FBS, 100 단위 페니실린 - 스트렙토 마이신과 DMEM을 보완하여 완전한 DMEM 매체를 준비합니다. 4 ° C에서 미디어를 저장하고 따뜻한 37 ° C는 사용하기 전에.
- 다수의 동결을 방지하기 위해 5 ~ 10 ㎖를 별도의 볼륨으로 나누어지는 디스 파제 II는 nonfrost없는 냉동고에 -20 ° C에서 해동 및 저장.
2. 조직 컬렉션
- 거시적으로 병리학 자에 의해 암으로 확인 된 지역에서 수술시 난소 암 (크기 ~ 5의 g)의 고체 시료를 수집합니다. 임상 표본 드 식별 및 기관 프로토콜에 따라 등록됩니다.
- 멸균, 사우스 캐롤라이나에있는 표본을 배치REW 뚜껑, 폴리 프로필렌은 빙냉 PBS 30 ㎖로 채워진 용기 표본. 시험편 컬렉션에서 30 분 (그림 1) 내에서, 얼음 처리를 위해 연구소에 외과 병리 실험실에서 시료를 수송한다.
3. 조직 처리
- 멸균 조건 하에서 작동하는 페트리 접시 위에 시료 (60mm X 60mm) 신선 빙냉 PBS 10 ㎖를 함유하고 추가로 (2 ㎜ 이하)가 가능한 작은 조각으로 잘라 멸균 면도날을 사용하여 (전송 도 2a 및도 2 B).
- DMEM에 디스 파제 II (2.4 U / ㎖) (30 분 37 ° C) 데워진 10 ㎖를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 다진 조직을 전송하고 30 분 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다. 표본의 최적의 소화를 보장하기 위해, 수동으로 세포 슬러리마다 5 분을 선동.
- 30 분 배양, 전송 (사용 후10 ㎖의 혈청 피펫) 셀 스트레이너 (70 μM 메쉬) 상으로 세포 슬러리를 50 ㎖ 원추형 튜브의 상단에 배치하고 시린지 플런저를 사용하여 메시에 대해 완만 한 압력을 적용 할 수있다. (메쉬의 상단에 남아있는) 모든 해리되지 않은 조직을 무시하고 50 ㎖ 멸균 원뿔 관에서 얻은 세포 현탁액을 수집합니다. 4 ° C에서 7 분 (그림 3)에 대한 320 XG에 원심 분리기.
- 상층 액을 버리고 10 % FBS를 함유하는 DMEM으로 10 ㎖ 중에 세포 펠렛을 재현 탁.
- 셀 5 % CO 2에서 배양 접시에있는 서스펜션과 37 ° C (그림 4)을 품어.
- 초기 도금에서 24 시간 후 매체를 변경합니다. 이 세포 파편의 제거 및 문화에 존재하는 적혈구의 대부분을 수 있습니다.
- 매체에게 차 EOC의 문화가 다운 스트림 애플리케이션을위한 준비가 된 후 다음 두 주 동안 매 3 일, 변경합니다.
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Representative Results
난소 암의 임상 검체는 신선한 (도 1)는 수술 후 수거하고, 세포 슬러리를 구성하는 작은 조각 (도 2a 및 2b)에서 절단된다. 이 효소 치료에 대한 표본의 최적의 노출을 할 수 있습니다. 셀룰라 슬러리 소화 효소에 노출하고, 30 분간 37 ℃에서 배양된다. 배양 시간 동안 슬러리 (특히 각 교반 후) 점차 구름이되고이 조직 세분화의 표시이다. 배양 시간의 끝에서, 슬러리는 임의의 해리되지 않은 조직 (도 3)로부터 EOC 세포를 분리하는 세포 고사에 전사된다. 회수 된 세포 현탁액은 5 % CO 2와 37 ° C (F의 igure 4)에 배치됩니다. 이 단계에서 세포 배양의 형태는 단일 세포 현탁액과 같은 작은 덩어리 모두 EOC 세포의 존재를 드러낸다. 이 시점에서 문화는 또한 프리젠 밝혀 적혈구 및도 5에 도시 된 바와 같이 작은 파편의 세륨. EOC는 천천히 (1 ~ 3 일의 기간 동안) 플라스틱, 적혈구 세포 파편을 준수합니다 중요한 동안하지 않으며 그들은 결국 점진적으로 "문화에서 사라질 것이다". 초기 판에서 3 일으로, EOC의 문화가 부착 EOC 세포 클러스터와 그림 6과 같이 점진적으로 적은 적혈구와 파편을 증가합니다. 일 6-7함으로써, EOC 세포는 소용돌이 형상의 도형 (화살표)을 형성하고,도 7에 도시 된 바와 같이 EOC 세포의 전형적인 조약돌 형태 선도 다세포 큰 응집체를 형성하기 위해 플라스틱으로 확산하기 시작한다. 하루 (14)에 의해, EOC 세포는 일반적으로 합류 (그림 8)가 현재 다운 스트림 테스트 및 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다.
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임상 검체의 그림 1. 컬렉션. 난소 암의 고체 시료는 수술시 수집하고 얼음처럼 차가운 PBS의 30 ML 가득 살균, 나사 뚜껑, 폴리 프로필렌 시료 용기에 배치됩니다.
임상 검체의 그림 2. 처리. A) 신선 빙냉 PBS 1X. B 10 mL를 함유하는 페트리 접시에 전사 단단한 시험편) 임상 검체 더 크기 약 2mm로 절단.
해리되지 않은 조직에서 EOC 셀의도 3. 분리. 효소 소화에 따라, 임상 검체는 세포 고사에 전사하고 부드러운 압력이 시린지 플런저를 사용하여 소화 임상 검체에인가된다. 이것은 결합 조직 및 EOC 세포의 회복 EOC의 기계적 박리 수 있습니다.
도 4. EOC 세포 현탁액을 결과의 도금. 해리되지 않은 임의의 조직을 제거한 후, 세포 현탁액을 원심 분리하여 DMEM (CONT)에 10 ㎖에 재현 탁aining 10 % FBS와 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양 접시에서 배양
즉시 즉시 도금 후 처리. 세포 현탁액 후 EOC 세포 배양의 그림 5. 형태론은 단일 세포 현탁액으로 EOC를 보여줍니다 덩어리 (모두 화살표로 표시)에, 적혈구 세포의 파편은 아직이 단계에 풍부하다. 원본 확대, 20X.
3 일에 EOC 세포 배양의 그림 6. 형태론 도금 반 부착 EOC의 C를 표시 한 후 3 일에서. EOC 세포 배양을 도금 한 후(화살표로 나타낸) ELL 클러스터 이하 적혈구 오염. 원본 확대, 20X.
그림 7. 초기 도금 후 1 주일. EOC 세포 배양 도금에서 일주일 후 설립 EOC 문화는 조직 배양 플라스틱에 확산 세포의 소용돌이 모양의 클러스터를 보여줍니다. 원본 확대, 20X.
그림 8. 합류 EOC 문화. 문화에서 14 일 후에 일반적인 상피 조약돌 형태를 보여주는 EOC 세포의 플루 단층.
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Discussion
난소 암의 병인학 및 개발의 더 나은 이해가이 파괴적인 질환에 의해 영향을 여성의 결과를 개선하기 위해 매우 중요하다. 이러한 상황에서의 사용은 설립 "시판되는"난소 암 세포주는 의심 할 여지없이 대단히 유용왔다. 그러나 오늘 우리는 암 세포 라인들은 이성 9,10의 부족 등 많은 측면에서 시작된 인간의 종양을 반영하지 않고 있다는 것도 알고있다.
여기, 우리는 직접 수술 표본 격리의 30 분 이내에 난소 암의 임상 검체에서 분리 및 기본 난소 암 세포의 배양을위한 신속하고 신뢰할 수있는 방법을보고합니다.
일차 전지는 복수의 유체 대 고체 시료로부터 분리되어 있기 때문에,이 종래 복수 유체 형성이 발생 시간으로 질병의 초기 단계에서 세포를 분리하는 장점을 갖는다. 이 기술은 또한 ADV가 여기특정 사이트에서 일차 난소 암 세포를 단리 ANTAGE. 이 프로토콜을 이용하여 실행 가능한 기본 난소 암 세포를 얻는데 성공 샘플은 수술 후 처리 될 수있는 방법을 빨리에 크게 의존한다. 최상의 결과를 위해, 표본은 수술에서 30 분 이내에 접수해야한다. 이것이 가능하지 않으면, 시편을 밤새 (PBS에서) 4 ℃에서 보관하고 그 다음날 처리한다. 우리의 경험에서 하룻밤 저장 다음 샘플의 처리는 수율을 감소시킨다. 이상 30 분 디스 파제 II에 대한 노출은 또한 세포 생존 능력을 감소시키고 수행 할 수 없습니다. II 치료를 디스 파제에 대한 대안은 콜라게나 또는 히알루로 치료 될 수 있습니다. 그러나, 이는 감소 수율 8 초래한다. 다른 사람에 비해 때문에 임상 검체에서 큰 변화의 일부는 큰 적혈구의 오염이있을 수 있습니다. 그런 경우, 우리는 "세탁"다진 조직 (단계 제안3.1) PBS로 이전 소화 효소에 노출. 이 제제에서 적혈구의 수를 감소시키고, 궁극적으로 일차 상피 세포의 부착을 용이하게 할 것이다.
임상 표본 (그들이 빨리 그들이 외과 병리학 실험실에 도착 불임을 잃게) 멸균되지 않기 때문에 엄격히 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행하는 것이 중요하다. 문화의 오염이 가능하지만, 일반적으로 그것은 케이스의 10 % 미만으로 발생한다. 위의 프로토콜은 임상 시료의 일관성과 함께 이용 될 수있다.
이 프로토콜의 주요 제한은 각 샘플에서 회수 된 세포의 수는 제공된 표본의 크기에 크게 의존한다는 것이다. 전형적인 표본의 크기는 약 3 센티미터 × 3 cm입니다. 또 다른 한계는 사실에 의해 표현되는 일차 난소 암 세포는 시험관 내에서 최대 10 개의 통로 (따라서 provi에 대해 지수 적으로 증가하면서딩 가능한 주식을 할 수있는 기회) 그들은 궁극적으로 senesce 죽어, 따라서 하나의 기증자의 세포의 가용성을 제한. 우리는 섬유 아세포에서의 종양 세포의 분리를 수행하지 않지만, 우리는 공정 전반에 걸쳐 혈청의 비교적 높은 (10 %)의 농도가 난소 암 세포에게 아세포 이상의 생존 이점을 줄 수 있다는 가설을 세웠다. 또한 간질 실 (섬유 아세포)에서 분리 적은 경향이 세포가 해리하는 수 없습니다 및 분리시 필터에 남아있을 가능성이 높습니다.
이 프로토콜을 사용하여 얻은 세포는 난소 암의 개시 및 개발로 이어지는 프로세스를 이해하는 것을 목표로 연구를 포함하여 미래의 애플리케이션에 매우 적합하다. 미래의 응용 프로그램은 체외 이러한 일차 전지를 사용하고 난소 암뿐만 아니라 조기 발견을위한 바이오 마커에 대한 새로운 화학 요법 제의 생체 내 시험에 있습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 환자의 조직 샘플 수집에 대한 지원은 미네소타 대학의 조직 조달 시설의 직원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 MB에 미네소타 난소 암 얼라이언스와 MB의 부인과 종양학 부서 기금에 의해, 랜디 면도기 암 연구 및 MB에 커뮤니티 기금, 국방부의 난소 암 연구 프로그램 (OCRP) MB에 OC093424에 의해 지원되었다. 출자자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 게시 할 수있는 결정 또는 원고의 준비에 역할을했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
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