Summary
Это исследование описывает подробный способ выделения и характеристики первичных клеток рака яичников от твердых клинических образцов. Рак яичников клинические образцы подвергаются ферментативного расщепления, чтобы получить жизнеспособную, фибробластов без эпителиального рака яичников (EOC) клеток высоко подходящий для последующих применений.
Abstract
Надежные инструменты для исследования яичников инициацию и прогрессирование рака срочно необходимы. Хотя использование яичников линий раковых клеток остается ценным инструментом для понимания рака яичников, их использование имеет много ограничений. К ним относятся отсутствие неоднородности и множество генетических изменений, связанных с расширенной пассажей в пробирке. Здесь мы опишем метод, который позволяет быстро созданию первичных клеток рака яичников образуют твердые клинические образцы, собранные во время операции. Метод состоит в воздействии клинических образцов для ферментативного расщепления в течение 30 мин. Выделенный клеточной суспензии дают расти и могут быть использованы для последующей приложений, включая скрининга лекарственных средств. Преимущество первичных яичников линий раковых клеток более установленных яичников линий раковых клеток является то, что они являются представителями оригинальных конкретных клинических образцов они являются производными от и могут быть получены из различных сайтах будь примары или метастатическим раком яичников.
Introduction
Несмотря на относительно низкий уровень заболеваемости, рак яичников является самой опасной из гинекологических заболеваний и пятой ведущей причиной смерти от рака среди женщин 1,2. В основном это связано с отсутствием надежных инструментов и моделей, которые верой и правдой резюмировать возникновение и прогрессирование заболевания 3. Большинство наших знаний сегодня о раке яичников стало возможным за счет использования увековечены яичников поверхности эпителиальных клеток (IOSEs), рак яичников клеточных линий и первичных клеток рака яичников, извлеченных из асцитической жидкости 4-7. К сожалению, их использование имеет ряд ограничений в том числе ряд генетических и фенотипических изменений, связанных с процессом Иммортализация или в проходах пробирке и неоднородности населения в результате асцитической жидкости препарата.
Таким образом, первичные рака яичников клетки, полученные из идентифицируемых и конкретных твердых образцов рака яичников представляют собой Uniquэ инструментом для изучения яичника прогрессирование рака.
Основные трудности, связанные с получение этих злокачественных клеток обусловлены разрастанием стромальных клеток или фибробластов вместе с потере жизнеспособности и преждевременной отсутствия пролиферативной способностью в культуре этих EOC клеток. Существует несколько методов для создания одного клеточные суспензии из твердых опухолей существуют в настоящее время, с помощью механических средств или ферментативной диссоциации, однако некоторые методы дают большее количество предпочтительного результата 8. Здесь мы показываем, что ферментативное расщепление с диспаза II приводит к эффективной восстановление жизнеспособных, фибробластов без EOC клеток. Полученные таким образом культуры EOC очень восприимчивы к генетической манипуляции и могут быть также использованы в тестах скрининга лекарственных средств, указывая, что эти EOC культур подходят для многих последующих применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике
Твердые образцы рака яичников были получены из университета Миннесоты ткани закупок фонда (ТПФ) после Экспертный совет организации Комитета: Human Тема Комиссия (IRB) одобрение.
1. Настройка Реагент
- Подготовить всю DMEM среду, дополняя DMEM с 10% FBS, и 100 единиц пенициллина-стрептомицина. Хранить среды при 4 ° С и теплой до 37 ° C перед использованием.
- Алиготе диспаза II на отдельные тома 5-10 мл, чтобы избежать многократного замораживания оттаивает и хранить при температуре -20 ° С в nonfrost без морозильной камеры.
2. Ткань Коллекция
- Сбор твердых образцов рака яичников (~ 5 г в размере) на момент операции из районов макроскопически определены как рак патологоанатом. Клинические образцы де-идентифицированы и зарегистрированы в соответствии с институциональными протоколов.
- Поместите образцы в стерильной, SCREW крышка, полипропилен образцов контейнер, наполненный 30 мл охлажденного льдом PBS. Транспорт образцы из хирургической лаборатории патологии в научно-исследовательской лаборатории для обработки на льду, и в течение 30 мин от сбора образцов (рис. 1).
3. Обработка ткани
- Работа в стерильных условиях, передавать образцы на чашке Петри (60 мм х 60 мм), содержащей 10 мл свежей, охлажденной льдом PBS и с помощью стерильного лезвие, дальнейшее сокращение в мельчайшие кусочки возможных (2 мм или меньше) ( фиг.2А и 2 B).
- Передача фарш ткани в 15 мл конической пробирке, содержащей 10 мл предварительно нагретого (37оС в течение 30 мин) диспазы II (2,4 U / мл) в DMEM и инкубировали в 5% CO 2 и 37 ° С в течение 30 мин. Для обеспечения оптимального переваривания образцов, вручную агитировать клеточной суспензии каждые 5 минут.
- После 30 мин инкубации, передачи (с использованием10 мл серологической пипеткой) Клеточную суспензию на клеточный фильтр (70 мкм меш) помещают сверху в 50 мл коническую пробирку и применить мягкое давление на сетке с помощью шприца. Отменить любые недиссоциированного ткани (оставшийся на верхней части меш) и собирают полученной суспензии клеток в 50 мл стерильные конические пробирки. Центрифуга при 320 мкг в течение 7 мин при 4 ° С (рис. 3).
- Жидкость над осадком сливают и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл среды DMEM, содержащей 10% FBS.
- Выдержите клеточной суспензии в чашку Петри на 5% CO 2 и 37 ° C (рисунок 4).
- Изменение среды после 24 часов от первоначального посева. Это позволяет для удаления клеточных остатков и большинство эритроцитов, присутствующих в культуре.
- Изменение среды каждые три дня в течение следующих двух недель, после которых культуры первичной EOC готовы для последовательных применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Свежие клинические образцы рака яичников собраны после операции (рис. 1) и сократить на мелкие кусочки (рис. 2А и 2В), составляющих суспензии клеток. Это позволяет для оптимальной экспозиции образцов в ферментативной обработки. Клеточную суспензию подвергают ферментативному перевариванию и инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин. Во время инкубационного суспензия становится все более ясно (особенно после каждого агитации), и это является признаком ткани разукрупнения. В конце инкубационного периода суспензию переносили на клеточный фильтр, чтобы отделить клетки от EOC любой недиссоциированной ткани (рис. 3). Извлеченный клеточную суспензию помещают в 5% CO 2 и 37 ° C (F На рис 4). На данном этапе морфология клеточных культур показывает присутствие обоих EOC клеток как суспензии отдельных клеток и в небольшие пряди. Культура в этом пункте также показывает изложе се эритроцитов и мелкого мусора, как показано на рисунке 5. Важно то время как КРВ будет медленно (в течение 1-3 дней) придерживаться пластика, эритроцитов и клеточного дебриса не будет, и они будут в конечном счете и постепенно "исчезают из культуры». По 3-й день от первоначального посева, культуры EOC показывают увеличение прилипшие клетки кластеров EOC и постепенно меньше эритроцитов и мусора, как показано на рисунке 6. Днем 6-7, EOC клетки образуют вихревые, похожие по форме (стрелка) и начать распространяться на пластик в более крупные многоклеточные агрегаты, ведущие к типичной булыжной морфологии EOC клеток, как показано на рисунке 7. По 14-й день, EOC клетки обычно сливаться (рис. 8) и теперь готовы для последующей проверки и приложений.
pload/51581/51581fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Сбор клинических образцов. Твердые образцы рака яичников собраны во время операции и помещают в стерильную, винт крышки, полипропилен образца контейнера, заполненного 30 мл ледяной PBS.
Рисунок 2. Обработка клинических образцов. А) Твердые образцы переносили на чашку Петри, содержащую 10 мл свежей, охлажденной льдом 1x PBS. B) Клинические образцы дополнительно разрезать на куски примерно 2 мм в размере.
Рисунок 3. Разделение EOC клеток из недиссоциированной тканей. После ферментативного расщепления клинические образцы передаются на клеточный фильтр и нежный давление применяется на расщепленных клинических образцов с помощью шприца. Это позволит для механического отряда EOC из соединительной ткани и восстановления EOC клеток.
Рисунок 4. Покрытие из EOC в результате суспензии клеток. После удаления любых недиссоциированные ткани, клеточную суспензию центрифугировали и ресуспендировали в 10 мл DMEM ContAining 10% FBS и инкубировали в чашке Петри на 5% CO 2 и 37 ° C.
Рисунок 5. Морфология клеточных культур EOC немедленно после обработки. Клеточную суспензию немедленно после посева показывает КРВ как одноклеточных суспензий и в сгустки (как показано стрелками), эритроциты и клеточный дебрис еще имеются в большом количестве на данном этапе. Оригинальный увеличение, 20X.
Рисунок 6. Морфология клеточных культурах EOC на 3-й день после посева культуры. EOC клеток при 3-й день после посева показывает полу-адгезией EOC грлокоть кластера (указано стрелкой) и менее загрязнение эритроцитов. Оригинальный увеличение, 20X.
Рисунок 7. Штатные культуры EOC после недели от обшивки. EOC культуры клеток через неделю после первоначального посева показывает вихревые, как скопления клеток, распространяющихся на культуре ткани пластика. Оригинальный увеличение, 20X.
Рисунок 8. Сливной EOC культуры. Сливной монослой EOC клеток с типичной эпителиальных булыжником морфологии после 14 дней в культуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Лучшее понимание яичников этиологии рака и развития имеет решающее значение для улучшения результатов женщин, пострадавших от этой разрушительной болезни. В этом контексте использование создан и "продаже" яичников линии раковых клеток, несомненно, было чрезвычайно полезно. Тем не менее, сегодня мы знаем, что рак клеточные линии не являются репрезентативными для человеческого опухоли они произошли от во многом в том числе отсутствие гетерогенности 9,10.
Здесь мы сообщаем быстрый и надежный способ для изоляции и культивирования первичных клеток рака яичников непосредственно из клинических образцов рака яичников в течение 30 мин хирургического изоляции образца.
Поскольку первичные клетки выделяют из твердого образца по сравнению с асцитной жидкости, это имеет то преимущество, изолирующий клетки от ранних стадиях заболевания до того времени, когда происходит асцит пластового флюида. Этот метод также имеет ADVantage выделения первичных клеток рака яичников с определенного сайта. Успех в получении жизнеспособных первичных клеток рака яичников с помощью этого протокола в значительной степени зависит от того, как быстро образец могут быть обработаны после операции. Для достижения наилучших результатов, образцы должны быть получены в течение 30 мин после операции. Если это невозможно, то образец следует хранить при температуре 4 ° С (в PBS) в течение ночи и обрабатываются на следующий день. По нашему опыту, обработки образцов следующее ночного хранения уменьшает выход. Воздействие диспазы II дольше, чем 30 мин также уменьшает жизнеспособность клеток и не должны быть выполнены. Альтернативой диспаза II лечение может быть лечение с коллагеназы или гиалуронидазы. Однако это приводит к снижению урожайности 8. Из-за большой изменчивостью в клинических образцах, некоторые могут иметь больший загрязнения красных кровяных клеток по сравнению с другими. Если это так, то мы предлагаем "стиральная" фарш тканей (шаг3.1) с PBS до подвергая их ферментативного расщепления. Это уменьшит количество красных кровяных клеток в подготовке и в конечном итоге способствовать адгезии первичных эпителиальных клеток.
Поскольку клинические образцы не стерильные (они теряют стерильность, как только они прибывают в хирургической лаборатории патологии), очень важно, чтобы выполнить все шаги в строго стерильных условиях. В то время как загрязнение культуры можно, как правило, это происходит в менее чем 10% случаев. Данный протокол может быть использован с любой последовательностью клинического образца.
Основным недостатком этого протокола является то, что число клеток извлекали из каждой образцов сильно зависит от размера образцов, предусмотренных. Размер типичной особи составляет около 3 см х 3 см. Другим ограничением представлена на то, что в то время как первичные яичников раковые клетки растут в геометрической прогрессии в течение 10 пассажей в пробирке (поэтому полодинь возможность сделать жизнеспособных запасов) они в конечном счете стареют и умирают, что сокращает наличие клеток из одного донора. В то время как мы не выполнили ни разделение опухолевых клеток из фибробластов, мы предполагаем, что относительно высокая (10%) концентрация сыворотки в течение всего процесса может дать клеток рака яичников преимущество выживания над фибробластов. Вероятно также, что клетки, которые в меньшей степени подвержены отделения от стромы отсека (фибробластов) не может детализировать и останется на фильтре в процессе разделения.
Клетки, полученные с этим протоколом очень подходит для будущих приложений, включая исследований, направленных понять процессы, приводящие к яичников зарождения и развития рака. Будущие приложения включают также использование этих первичных клеток для в пробирке и в естественных условиях тестирования новых химиотерапевтических агентов для рака яичников, а в качестве биомаркеров для раннего выявления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить сотрудников ткани закупок фонда университета Миннесоты за помощь в сборе образцов пациентов ткани. Эта работа была поддержана Министерством обороны яичников исследований рака программы (ОГОС) OC093424 в МБ, по Рэнди бритвы исследованию рака и общественного фонда к МБ, Миннесоты яичников Альянса рака в Мб и фондом Онкогинекология Ведомственные к МБ. Доноры не участвовал в разработке дизайна исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
- Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
- Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
- Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
- Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
- Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
- Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
- Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
- Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
- Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).
