Summary
Este estudio describe un método detallado para el aislamiento y caracterización de células de cáncer de ovario primarios de muestras clínicas sólidos. Especímenes clínicos sobre el cáncer de ovario son sometidas a digestión enzimática para obtener, fibroblastos-epitelial libre de cáncer de ovario de células viables (EOC) muy adecuada para aplicaciones posteriores.
Abstract
Se necesitan con urgencia herramientas fiables para la investigación de cáncer de ovario iniciación y progresión. Mientras que el uso de líneas celulares de cáncer de ovario sigue siendo una herramienta valiosa para comprender el cáncer de ovario, su uso tiene muchas limitaciones. Estos incluyen la falta de heterogeneidad y la plétora de alteraciones genéticas asociadas con pases prolongado in vitro. Aquí se describe un método que permite la rápida creación de células de cáncer de ovario primarios forman especímenes clínicos sólidos recogidos en el momento de la cirugía. El método consiste en someter las muestras clínicas a la digestión enzimática durante 30 min. Se deja que la suspensión de células aisladas a crecer y se puede utilizar para la aplicación aguas abajo incluyendo la detección de drogas. La ventaja de líneas celulares de cáncer de ovario primarios más de líneas celulares de cáncer de ovario establecidas es que son representativas de las muestras clínicas originales específicas que se derivan de y pueden ser derivados de diferentes sitios si a simplecáncer de ovario RY o metastásico.
Introduction
A pesar de su relativamente baja incidencia, el cáncer de ovario es el más mortal de las enfermedades ginecológicas y la quinta causa principal de muerte por cáncer entre las mujeres 1,2. Esto se debe principalmente a la falta de herramientas fiables y modelos que recapitulan fielmente la iniciación y progresión de la enfermedad 3. La mayor parte de nuestro conocimiento hoy en día sobre el cáncer de ovario ha sido posible mediante el uso de células inmortalizadas de ovario epiteliales superficiales (IOSes), líneas celulares de cáncer de ovario y células de cáncer de ovario primarios recuperados de fluido ascítico 4-7. Desafortunadamente, su uso tiene varias limitaciones, incluyendo un número de cambios genéticos y fenotípicos asociados con proceso de inmortalización o en pasajes in vitro y la heterogeneidad de la población resultante de la preparación de fluido ascítico.
Por lo tanto, las células de cáncer de ovario primarios derivados de muestras sólidas identificables y específicos de cáncer de ovario representan una unique herramienta para el estudio de la progresión del cáncer de ovario.
Las principales dificultades de las que obtienen estas células malignas se deben a un crecimiento excesivo de las células del estroma o fibroblastos junto con la pérdida de la viabilidad y la falta prematura de la capacidad proliferativa en el cultivo de estas células EOC. Actualmente, existen diversos métodos para crear suspensiones de una sola célula de tumores sólidos, a través de medios mecánicos o disociación enzimática, sin embargo ciertas técnicas producen una mayor cantidad de la solución preferida 8. Aquí, mostramos que la digestión enzimática con dispasa II resulta en una recuperación efectiva de células EOC-fibroblastos libre viables. Los cultivos de EOC así obtenidos son altamente susceptibles a la manipulación genética y también son útiles en pruebas de detección de drogas, lo que indica que estos cultivos EOC son adecuados para muchas aplicaciones posteriores.
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Protocol
Declaración de Ética
Muestras sólidas de cáncer de ovario se obtuvieron del Servicio de Adquisiciones de Tejidos de la Universidad de Minnesota (TPF), después de Comité de la Junta de Revisión Institucional: Sujeto Humano Board (IRB).
1. Configuración Reactivo
- Preparar medio DMEM completo completándolo DMEM con FBS al 10%, y 100 unidades de penicilina-estreptomicina. Almacenar el medio a 4 º C y se calienta a 37 ° C antes de su uso.
- Alícuota dispasa II en volúmenes separados de 5-10 ml para evitar la congelación múltiple se descongela y se almacenan a -20 ° C en un congelador-nonfrost libre.
2. Tissue Collection
- Obtener muestras de sólidos de cáncer de ovario (~ 5 g de tamaño) en el momento de la cirugía de las zonas macroscópicamente identificados como cáncer por un patólogo. Las muestras clínicas son de-identificados y registrados de acuerdo con protocolos institucionales.
- Coloque las muestras en un recipiente estéril, sctapa Rew, polipropileno especímenes recipiente lleno con 30 ml de PBS enfriado en hielo. Transportar las muestras del laboratorio de patología quirúrgica para el laboratorio de investigación para el procesamiento en el hielo, y en 30 minutos desde la recogida de muestras (Figura 1).
3. Procesamiento de tejidos
- Trabajar en condiciones estériles, transferir las muestras en una placa de Petri (60 mm x 60 mm) que contenían 10 ml de fresca, helado de PBS y el uso de una hoja de afeitar estéril, más cortado en los pedazos más pequeños posibles (2 mm o menos) ( Las Figuras 2A y 2 B).
- Transferir los tejidos picados en un tubo cónico de 15 ml que contiene 10 ml de precalentado (37 ° C durante 30 min) dispasa II (2,4 U / ml) en DMEM y se incuba a 5% de CO 2 y 37 ° C durante 30 min. Para garantizar una digestión óptima de los especímenes, agitar manualmente la suspensión de células cada 5 min.
- Después de 30 min de incubación, la transferencia (utilizandouna pipeta serológica de 10 ml) de la suspensión de células en un filtro de células (70 micras de malla) colocado en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml y se aplica una presión suave contra la malla usando un émbolo de la jeringa. Descarte cualquier tejido no disociado (que queda en la parte superior de la malla) y recoger la suspensión de células obtenida en el tubo cónico estéril de 50 ml. Centrifugar a 320 xg durante 7 min a 4 ° C (Figura 3).
- Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 10 ml de DMEM que contiene 10% de FBS.
- Incubar la suspensión de células en una placa de Petri en 5% de CO 2 y 37 ° C (Figura 4).
- Cambie el medio después de 24 horas a partir de la placa inicial. Esto permite la eliminación de los desechos celulares y la mayoría de los eritrocitos presentes en la cultura.
- Cambie el medio cada tres días para las dos semanas siguientes, después de lo cual las culturas de EOC primaria están listos para aplicaciones posteriores.
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Representative Results
Muestras clínicas frescas de cáncer de ovario se recogen después de la cirugía (Figura 1) y se cortan en trozos pequeños (Figuras 2A y 2B) que constituyen la suspensión celular. Esto permite una exposición óptima de las muestras que el tratamiento enzimático. Suspensión de la célula se expone a la digestión enzimática y se incubó a 37 ° C durante 30 min. Durante el tiempo de incubación de la suspensión se vuelve cada vez más nublado (especialmente después de cada agitación) y esto es una señal de desagregación tisular. Al final del tiempo de incubación, la suspensión se transfiere a un filtro de células para separar las células EOC de cualquier tejido no disociado (Figura 3). La suspensión de células recuperado se coloca en 5% de CO 2 y 37 ° C (F igura 4). En esta etapa la morfología de los cultivos de células revela la presencia de ambas células EOC como una suspensión de células individuales y en pequeños grupos. La cultura en este punto también revela la presen CE de los eritrocitos y los desechos pequeños, como se muestra en la Figura 5. Es importante destacar que, mientras que el EOC lentamente (durante un período de 1-3 días) se adhieren al plástico, eritrocitos y los restos celulares no, y que a la larga y progresiva "desaparecerá de la cultura". Por día 3 de cultivo inicial, las culturas EOC muestran cada vez más agrupaciones de células adherentes EOC y progresivamente menos de eritrocitos y los residuos, como se muestra en la Figura 6. Por días 6-7, células EOC forman formas tipo remolino (flecha) y comienzan a propagarse al plástico para formar agregados multicelulares más grandes que conducen a la morfología de adoquín típica de células EOC como se muestra en la Figura 7. En el día 14, las células EOC normalmente se hacen confluentes (Figura 8) y ahora están listos para la prueba y las aplicaciones posteriores.
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Figura 1. Colección de muestras clínicas. Muestras sólidas de cáncer de ovario se recogen en el momento de la cirugía y se coloca en una, la tapa de tornillo, recipiente estéril muestra de polipropileno relleno con 30 ml de PBS enfriado en hielo.
Figura 2. Procesamiento de las muestras clínicas. A) muestra sólidos se transfirieron a una placa de Petri que contiene 10 ml de fresco, enfriado con hielo 1x PBS. B) Las muestras clínicas nuevo recorte en trozos de unos 2 mm de tamaño.
Figura 3. Separación de las células de los tejidos de EOC no disociadas. Después de la digestión enzimática, las muestras clínicas se transfieren a un filtro de células y una suave presión se aplica sobre los especímenes clínicos digeridos mediante el uso de un émbolo de la jeringa. Esto permite la separación mecánica de EOC de los tejidos y la recuperación de las células EOC conectivos.
Figura 4. Plating resultante de EOC células suspensión. Después de la eliminación de cualquier tejido no disociado, la suspensión celular se centrifugó y se resuspendió en 10 ml de DMEM CONTaining 10% de FBS y se incubaron en una placa de Petri en 5% de CO 2 y 37 ° C.
Figura 5. Morfología de cultivos de células EOC inmediatamente después de la suspensión de procesamiento. Célula inmediatamente después de la siembra muestra EOC como un solo suspensiones de células y en grupos (tanto indicada por las flechas), los eritrocitos y los restos celulares todavía abundan en esta etapa. Ampliación original, 20X.
Figura 6. Morfología de los cultivos celulares de EOC en el día 3 después de la siembra del cultivo celular. EOC en el día 3 después de la siembra muestra semi-adherente EOC cclúster ELL (indicada por la flecha) y menos contaminación de eritrocitos. Ampliación original, 20X.
Figura 7. Culturas EOC establecido después de una semana de chapado cultura. Células EOC una semana después del cultivo inicial muestra racimos tipo remolino de las células se extienden en el plástico de cultivo de tejidos. Ampliación original, 20X.
Figura 8. Los cultivos confluentes de EOC. Confluent monocapa de células EOC que muestran la típica morfología de adoquines epitelial después de 14 días de cultivo.
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Discussion
Una mejor comprensión de la etiología del cáncer de ovario y el desarrollo es crucial para mejorar el resultado de las mujeres afectadas por esta enfermedad devastadora. En este contexto, el uso de establecida y "comercialmente disponible" línea celular de cáncer de ovario, sin duda, ha sido tremendamente útil. Sin embargo, hoy sabemos que las líneas celulares de cáncer no son representativos del tumor humano se originaron en muchos aspectos, incluyendo la falta de heterogeneidad 9,10.
Aquí, se presenta un método rápido y fiable para el aislamiento y cultivo de células de cáncer de ovario primarios directamente de muestras clínicas de cáncer de ovario en 30 min de aislamiento de la pieza quirúrgica.
Debido a que las células primarias se aisló de una muestra de sólidos en comparación con fluido de ascitis, esto tiene la ventaja de aislar las células a partir de las primeras etapas de la enfermedad antes de la hora cuando se produce la formación de fluido de ascitis. Esta técnica también tiene la advantage de aislar las células de cáncer de ovario primario desde un sitio específico. El éxito en la obtención de células de cáncer de ovario primarios viables usando este protocolo depende en gran medida de la rapidez con la muestra puede ser procesada después de la cirugía. Para obtener los mejores resultados, las muestras deben ser recibidos dentro de 30 minutos de cirugía. Si esto no es posible, la muestra debe mantenerse a 4 ° C (en PBS) durante la noche y se procesan al día siguiente. En nuestra experiencia, el procesamiento de las muestras después de almacenamiento durante la noche disminuye el rendimiento. La exposición a dispasa II durante más de 30 min también reduce la viabilidad celular y no se debe realizar. Una alternativa al tratamiento dispasa II puede ser el tratamiento con colagenasa o hialuronidasa. Sin embargo, esto resulta en la disminución de rendimiento 8. Debido a la gran variabilidad en las muestras clínicas, algunos pueden tener mayor contaminación de células rojas de la sangre, en comparación con los demás. Si ese es el caso, le sugerimos el "lavado" de los tejidos picados (paso3.1) con PBS antes de exponerlos a la digestión enzimática. Esto reducirá el número de células rojas de la sangre en la preparación y en última instancia, facilitar la adhesión de las células epiteliales primarias.
Debido a que las muestras clínicas no son estériles (pierden esterilidad tan pronto como llegan al laboratorio de patología quirúrgica), es fundamental para llevar a cabo todos los pasos en condiciones estrictamente estériles. Mientras contaminación del cultivo es posible, por lo general se produce en menos de 10% de los casos. El protocolo anterior puede ser utilizado con cualquier consistencia de muestra clínica.
La limitación principal de este protocolo es que el número de células recuperadas de cada muestra es altamente dependiente del tamaño de las muestras proporcionadas. El tamaño de un ejemplar típico es de unos 3 cm x 3 cm. Otra limitación está representada por el hecho de que mientras que las células de cáncer de ovario primarios crecen exponencialmente durante un máximo de 10 pasajes in vitro (por lo tanto, disposicionesDing la oportunidad de hacer reservas viables) que en última instancia envejecen y mueren, lo que limita la disponibilidad de las células de un único donante. Si bien no realizamos ninguna separación de las células tumorales de los fibroblastos, que postula que la relativamente alta (10%) de la concentración sérica durante todo el proceso puede dar células de cáncer de ovario una ventaja de supervivencia sobre los fibroblastos. También es probable que las células que son menos propensos a la separación del compartimiento del estroma (fibroblastos) pueden no desagregar y permanecerán en el filtro durante la separación.
Las células obtenidas con este protocolo son muy adecuados para aplicaciones futuras incluidas las investigaciones encaminadas a comprender los procesos que conducen a la iniciación del cáncer de ovario y el desarrollo. Las futuras aplicaciones también incluyen el uso de estas células primarias para in vitro y en ensayos in vivo de nuevos agentes de quimioterapia para el cáncer de ovario, así como biomarcadores para la detección temprana.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias al personal del Servicio de Adquisiciones de Tejidos de la Universidad de Minnesota para obtener ayuda con la recolección de muestras de tejido de pacientes. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa de los Programa de Investigación de Cáncer de ovario (OCRP) OC093424 a MB, por la máquina de afeitar de la Investigación del Cáncer y el Fondo Randy Comunidad MB, por el ovario Cancer Alliance Minnesota para MB y por el fondo de Oncología Ginecológica Departamental de MB. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, sterile | Invitrogen | 14190-144 | |
| Screw lid, polypropylene specimen container, sterile | Thermo Scientific | 02 1090 | |
| DMEM medium, sterile | Invitrogen | 11995-065 | |
| Fetal bovine serum, sterile | Thermo Scientific Hyclone | SH30396.03 | |
| 100x Penicillin-streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | |
| Dispase II, sterile | Roche | 04942 078 001 | |
| Small fine-tip forceps and scalpel blade, sterile | Fisher Scientific | forceps: 08-953E, blades: 08-927-5D | |
| Small dissecting scissors, sterile | Fisher Scientific | 08-945 | |
| 15 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml Conical capped tubes, sterile | BD Falcon | 352027 | |
| 10 ml Serological pipette, sterile | Corning | 13-678-11E | |
| 6 ml Syringe plunger, sterile | Tyco Healthcare | 8881516911 | |
| Nylon filter (70 μm ) cell strainer, sterile | BD Falcon | 352350 | |
| 5 cm Petri dish, sterile | Corning | 430166 | |
| 10 cm Petri dish, sterile | Corning | 430167 |
References
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