Summary
Ensemble d'imagerie optique et μCT dans un modèle murin de l'infection de l'implant orthopédique, en utilisant un bioluminescente souche génétiquement de Staphylococcus aureus, à condition que la capacité de surveiller de manière non invasive et longitudinalement la dynamique de l'infection bactérienne, ainsi que de la réponse inflammatoire correspondant et modifications anatomiques dans l' os.
Abstract
imagerie multimodalité a émergé comme une approche technologique commun utilisé à la fois dans la recherche préclinique et clinique. Des techniques de pointe qui combinent l'imagerie optique et μCT vivo permettent la visualisation de phénomènes biologiques dans un contexte anatomique. Ces modalités d'imagerie peuvent être particulièrement utiles pour étudier les conditions qui ont une incidence os. En particulier, les infections d'implants orthopédiques sont un problème important dans la chirurgie orthopédique clinique. Ces infections sont difficiles à traiter car les biofilms bactériens se forment sur les matériaux implantés chirurgicalement étrangers, conduisant à une inflammation persistante, l'ostéomyélite et l'ostéolyse éventuelle de l'os entourant l'implant, qui aboutit finalement à son descellement et l'échec. Ici, un modèle de souris d'un implant orthopédique prothétique infecté a été utilisé qui a impliqué la mise en place chirurgicale d'un implant Kirschner-fil dans un canal intramédullaire du fémur, de telle façon que l'extrémité de l'implant eXTended dans l'articulation du genou. Dans ce modèle, les souris LysEGFP, une souche de souris qui a neutrophiles EGFP-fluorescentes, ont été employés en association avec une souche de Staphylococcus aureus bioluminescente, qui émet de la lumière naturelle. Les bactéries ont été inoculées dans les articulations des genoux des souris avant la fermeture du site chirurgical. Bioluminescence in vivo et l'imagerie de fluorescence a été utilisée pour quantifier la charge bactérienne et la réponse inflammatoire des neutrophiles, respectivement. En outre, l'imagerie μCT a été effectuée sur des souris de la même manière que la localisation 3D de la bioluminescence et des signaux optiques fluorescents pourrait être co-enregistré avec les images μCT anatomiques. Afin de quantifier les variations de l'os au cours du temps, le volume osseux externe des fémurs distaux ont été mesurés à des instants spécifiques en utilisant un processus de semi-automatisé à base de segmentation contour. Pris dans leur ensemble, la combinaison de vivo bioluminescente / imagerie de fluorescence dans l'imagerie μCT peut être particulièrement utile fou la surveillance non invasive de l'infection, la réponse inflammatoire et des modifications anatomiques dans l'os au cours du temps.
Introduction
Multimodalité des techniques d'imagerie préclinique qui impliquent la combinaison de l'information optique anatomique et permettent la visualisation et le contrôle des phénomènes biologiques en 3D 4.1. Depuis imagerie μCT permet la visualisation exquis de l'anatomie osseuse, en utilisant l'imagerie μCT en conjonction avec de l'imagerie optique représente une combinaison unique qui pourrait être particulièrement utile pour les processus qui impliquent la biologie osseuse 5-7 de l'enquête. Un exemple serait d'utiliser ces techniques pour étudier les infections d'implants orthopédiques, qui représentent une complication catastrophique en suivant les procédures de chirurgie orthopédique 8,9. Les bactéries forment des biofilms sur les corps étrangers implantés qui favorisent la survie des bactéries en agissant comme une barrière physique qui empêche la détection de cellules du système immunitaire de l'infection et bloque l'accès à des antibiotiques de la bactérie 10,11. L'infection chronique et persistante du tissu articulaire (arthrite septique) uned os (ostéomyélite) induit la résorption osseuse qui entraîne le relâchement de la prothèse et une éventuelle défaillance 8,9. Cette ostéolyse périprothétique résultante est associée à une augmentation de la morbidité et de la mortalité 12,13.
Dans notre travail précédent, bioluminescence in vivo et l'imagerie de fluorescence a été utilisé avec des rayons X et l'imagerie micro-tomodensitométrie (μCT) dans un modèle d'infection de prothèse orthopédique commune chez les souris de 14 à 19. Ce modèle consiste à placer un fil de Kirschner titane (K-fil) de telle sorte que l'extrémité élargie de l'implant dans l'articulation du genou à partir de fémurs de souris 14-19 de coupe. Un inoculum de Staphylococcus aureus (souche bioluminescente ou Xen29 Xen36) a ensuite été introduit à la pipette sur la surface de l'implant dans l'articulation du genou avant le site chirurgical est fermé 14 à 19. Imagerie optique in vivo a été utilisé pour détecter et quantifier les signaux bioluminescents, qui correspond à la numbre de bactéries dans le tissu infecté articulations et des os de 14 à 19. En outre, l'imagerie de fluorescence in vivo dans des souris LysEGFP, qui possèdent neutrophiles fluorescents 20, a été utilisé pour quantifier le nombre de neutrophiles qui ont émigré à l'articulation du genou infectées contenant les implants K-fil 14,19. Enfin, les modalités d'imagerie anatomiques, y compris l'imagerie haute résolution des rayons X et l'imagerie μCT, autorisés 2D respective et l'imagerie anatomique 3D de l'os affecté pendant toute la durée de l'infection chronique, qui nous arbitrairement fin généralement entre 2 et 6 semaines post-opératoires 16 , 18. En utilisant ce modèle, l'efficacité de la thérapie antimicrobienne locale et systémique, des réponses immunitaires protectrices et des changements pathologiques dans anatomiques os pourrait être évalué de 14 à 18. Dans ce manuscrit, les protocoles détaillés concernant les modalités d'imagerie optique et μCT dans ce modèle d'infection de prothèse conjointe orthopédique ont été fournis dans deux psystème pour étudier les processus biologiques dans le contexte anatomique de l'os ve. Il s'agit notamment des interventions chirurgicales pour modéliser une infection de l'articulation prothétique orthopédique chez la souris, 2D et 3D en imagerie optique in vivo (pour détecter les signaux bioluminescents bactériennes et les signaux de neutrophiles fluorescentes), l'acquisition μCT d'imagerie et d'analyse et de co-enregistrement des images optiques 3D avec la images μCT.
Protocol
Déclaration éthique: Tous les animaux ont été traités en stricte conformité avec les bonnes pratiques de l'animal tel que défini dans les règlements fédéraux tel que défini dans la Loi sur la protection des animaux (AWA), le Guide 1996 pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et de la Politique PHS pour la protection des animaux Entretien et utilisation des animaux de laboratoire et tous les travaux de l'animal a été approuvé par la Johns Hopkins de protection des animaux et l'utilisation Comité (Protocole #: MO12M465).
1. bactéries bioluminescentes Préparation de l'inoculum de mi-logarithmiques
- Streak bioluminescente S. aureus souche Xen29 (ou une autre souche de bioluminscent comme Xen36) sur des plaques de gélose de soja trypsique (bouillon de soja tryptique dans la gélose [1,5%]).
REMARQUE: S. aureus Xen29 21 est un S. génétiquement modifié aureus souche qui contient un opéron lux modifiée dérivée de Photorhabdus luminescens, qui est intégré dans un plasmide natif stable trouvé dans cette souche bactérienne. Ce moteurEred bactéries émettent constitutive lumière de cellules vivantes et métaboliquement actives. - Cultiver les colonies sur les plaques par incubation à 37 ° C pendant environ 16 heures (O / N).
- Sélectionnez UFC bactérienne unique et de la culture à secouer BST liquide (240 rpm) pendant environ 16 h (O / N).
- Effectuez une sous-culture avec 1/50 de la dilution O / N culture pour obtenir la mi-logarithmiques bactéries en phase de croissance (durée environ 2 h).
- Pellet, remettre en suspension et laver les bactéries 3x dans du PBS.
- Estimer l'inoculum bactérien (1 x 10 3 CFU dans 2 ul de PBS) par la détermination de l'absorbance de la densité optique à 600 nm.
- Vérifiez l'UFC dans l'inoculum après culture des bactéries O / N sur des plaques.
2. souris interventions chirurgicales
NOTE: Pour ces expériences, utiliser un douze semaines vieille souris mâles LysEGFP. Ces souris possèdent la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) exprimant des cellules myéloïdes (qui sont composées de mostly neutrophiles) 20. Maintenir des conditions stériles au cours de la chirurgie et après préparation chirurgicale avec de la bétadine et de 70% d'alcool en plaçant chaque souris sur un champ stérile au-dessus de l'eau d'une surface dure circulant coussin chauffant. Utilisez blouse, de gants stériles, masque et stériliser les instruments.
- Anesthésier les souris en utilisant une inhalation de 2% d'isoflurane. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse alors que sous anesthésie. Évaluer le niveau approprié de l'anesthésie en observant la fréquence respiratoire, le tonus musculaire, pincement de l'orteil, réflexe cornéen et la couleur des muqueuses. Couvrir la souris avec un drap chirurgical stérile avec un trou au niveau du site d'une intervention chirurgicale sur le genou droit. La souris doit obtenir des mesures de soutien de chauffage pour maintenir la température du corps sous anesthésie. Chaud 37 ° C de l'eau circulant dans une chemise d'eau chaude couverture ou une circulation d'eau chauffée poste de travail dur en plastique (ProStation, Patterson, scientifique) sont de bons moyens de prévenir l'hypothermie.
- Injecter buprenorphine (formulation à libération prolongée) (2,5 mg / kg) par voie sous cutanée juste avant la chirurgie. Des doses supplémentaires de la buprénorphine à libération prolongée peuvent être administrées à des intervalles de 3 jours, au besoin pour l'analgésie.
- Raser le genou opératoire et prep en utilisant trois gommages alternance à l'aide de la bétadine et 70% d'alcool.
- Effectuer une incision médiane dans la peau recouvrant l'articulation du genou droit. Elargir l'incision de la peau de sorte que l'appareil extenseur peut être bien définie.
- Effectuez une arthrotomie parapatellaire interne et subluxation du tendon extenseur du mécanisme quadriceps-patellaire latéralement par une pince Adson.
NOTE: Ce qui porte l'échancrure intercondylienne du fémur en vue. - Ramette manuellement le canal médullaire à l'aide d'une aiguille de 25 G suivie d'une aiguille 23 G.
Remarque: Pour éviter d'endommager le fémur, une plate-forme de stabilisation peut être utilisé. Ce doit être important pour la technique pour minimiser une rupture accidentelle du fémur. - Insérez un titane Kirsc de qualité médicaleHübner-fil (0,8 mm de diamètre) en utilisant une technique de press-fit, ce qui implique de pousser manuellement à l'aide d'un support d'axe, dans un sens rétrograde dans le canal médullaire.
REMARQUE: Titanium K-fils ont été utilisés comme il y avait moins d'artefacts visibles sur les images μCT avec titane K-fils par rapport à l'acier inoxydable K-fils 16. - Couper l'extrémité du fil de Kirschner-couteaux avec des broches de telle sorte que l'extrémité de la broche de Kirschner coupe s'étend à peu près 1 mm dans l'espace de l'articulation du genou.
- Utilisation d'une micro-pipette, la pipette 2 ul de 1 x 10 3 CFU de S. bioluminescente aureus Xen29 sur la pointe de l'implant dans l'espace articulaire du genou.
NOTE: Plus de volume conduit à la contamination des tissus plus large et imagerie moins discret.
NOTE: Dans les souris non infectées de contrôle, ajouter 2 pi de solution saline stérile sans bactéries. - Réduire le complexe quadriceps-patellaire retour à la ligne médiane en utilisant une pince et fermer le tissu sous-cutané sus-jacente et de la peau à l'aide absorbablesutures intradermique.
NOTE: Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète. - A la fin des expériences, tous les animaux euthanasiés en utilisant l'inhalation de dioxyde de carbone selon les soins des animaux et l'utilisation des lignes directrices du Comité de Johns Hopkins. Vérifiez la mort en observant l'animal ne parvient pas à récupérer dans les 10 minutes après la fin de l'exposition au dioxyde de carbone et la dislocation cervicale.
3. 2D imagerie optique (in vivo bioluminescentes et fluorescent Imaging)
- Anesthésier LysEGFP souris (par exemple 2% inhalation isoflurane) et les placer avec face ventrale dans une chambre d'imagerie.
- Effectuer vivo dans l'imagerie bioluminescente utilisant l'animal entier IVIS spectre optique dans le système d'imagerie in vivo. Premièrement, vérifiez luminescent et confirmer le choix d'un f ouvertsélection iltre, champ de vision (FOV) C - 13 cm, et faites défiler le temps d'exposition jusqu'à Automatique (réglage de l'exposition automatique). L'exposition automatique est automatiquement ajuster le temps d'acquisition (vitesse d'obturation), binning (binning pixel numérique), et f-stop (ouverture) de l'instrument pour optimiser l'intensité du signal, tout en évitant la saturation. Puis cliquez sur Acquérir pour capturer l'image de bioluminescence.
REMARQUE: Pour l'imagerie in vivo par bioluminescence, souris d'image entre 1 - 5 min. - Effectuer séquentielle in vivo l'imagerie de fluorescence en cochant la case à côté de fluorescent. Choisir le filtre d'excitation de 465 nm et 520 nm filtre d'émission. Faites temps d'exposition jusqu'à Auto et sélectionnez FOV C (étape 3.2.1). Puis cliquez sur Acquérir pour capturer l'image de fluorescence.
REMARQUE: Pour l'imagerie in vivo fluorescente, les souris d'image entre 0,5 sec. - Quantifier les signaux in vivo bioluminescents comme flux total (photons / s) dans une région d'intérêt (ROI) en utilisant le logiciel Surface de l'image par la première expansion de laSection ROI Outils de la palette d'outils.
- Sélectionnez l'icône de cercle et le nombre de régions d'intérêt qui correspond au nombre d'animaux soumis à l'angle de champ. Redimensionner le retour sur investissement pour englober la région d'intérêt soit le modèle de diffusion bioluminescente recueillies.
- Sélectionnez ROI Mesure de ROI outils de la palette d'outils et la fenêtre de mesure ROI apparaîtront. Les valeurs totales Radiance (photons / s) représentent la somme des pixels bioluminescentes dans le ROI généré.
- Choisissez la commande Tout et onglets de copie dans le coin en bas à droite de cette fenêtre transférer les informations à la presse-papiers et permettre à coller dans les programmes suivants pour l'analyse.
- Quantifier les signaux fluorescents in vivo que l'efficacité de rayonnement totale ([photons / s] / [uW / cm 2]) dans une région circulaire d'intérêt (ROI) en utilisant le logiciel Surface de l'image.
- Dans la fenêtre du logiciel Living Image, développez Outils de retour sur investissement dans la palette d'outils. Sélectionnerl'icône de cercle et le nombre de régions d'intérêt qui correspond au nombre d'animaux soumis à l'angle de champ.
- Redimensionner le retour sur investissement pour englober la région d'intérêt correspondant étroitement au signal de bioluminescence de l'acquisition de l'image précédente.
- Sélectionnez ROI Mesure de ROI outils de la palette d'outils et la fenêtre de mesure ROI apparaîtront.
REMARQUE: Total efficacité Radiant ([photons / s] / [uW / cm 2]) représente la somme des pixels fluorescents dans le retour sur investissement. - Sélectionnez Tous et copie onglets dans le coin inférieur droit de la fenêtre va transférer les informations à la presse-papiers et permettre à coller dans les programmes suivants pour l'analyse.
4. μCT Image Acquisition
- Placez les souris LysEGFP anesthésiés dans une chambre d'imagerie.
NOTE: Cette chambre d'imagerie est conçu pour s'adapter à la fois le système d'imagerie IVIS spectre et le Quantum FX in vivo μCT système d'imagerie pour permettreco-registration des images optiques et μCT. - Ouvrez le logiciel de CT et sélectionnez le menu prédéfini 60 mm std FOV dynamique dans le menu déroulant.
- Insérez le capuchon externe de l'alésage et le bras de serrage pour la navette de formation d'image dans l'appareil.
- Placez la navette de l'imagerie de la souris dans le bras de l'adaptateur puis poussez le bras dans le trou et fermer la porte. Activer le mode direct (le bouton yeux sur le Panneau de configuration) et positionner l'objet à la position 0 ° et 90 ° portique en utilisant l'axe X et le contrôle de l'axe Y pour centrer l'animal dans la fenêtre X de capture. Puis désactiver le mode direct en cliquant sur le bouton yeux.
- Acquérir une image dynamique de balayage avec le 60 mm FOV en cliquant sur le bouton CT Scan (à côté de la touche Mode Live). Exporter l'image acquise dans le format DICOM et ranger dans un endroit qui peut être consulté plus tard.
NOTE: La dose approximative de 26 mGy par balayage. Un champ de vision 30 mm peut être utilisé si l'on souhaite une meilleure résolution.
5.3D d'image optique acquisition, Formation et μCT Co-enregistrement
- Placez la navette insert d'imagerie de la souris dans le spectre en positionnant la navette d'imagerie contenant la souris dans cet insert et assurer la souris ne bouge pas.
- Utilisation image vivante, sélectionnez Assistant d'imagerie dans le Panneau de configuration d'acquisition pour commencer l'installation de l'assistant. Pour commencer, choisissez bioluminescence, alors DLIT, puis sélectionnez les reporters "Bactéries" dans le menu déroulant et les filtres d'émission appropriés pour le modèle sera choisi automatiquement, dans ce cas, de 500 à 620 nm.
- Cliquez sur Suivant, puis désigner les paramètres d'acquisition et les informations soumises dans la dernière fenêtre. Plus précisément, l'imagerie réserve sera Mouse, Auto Les paramètres seront sélectionnés permettant d'exposition automatique pour optimiser la qualité du signal tout en évitant la saturation et du champ de vision sera réglé sur C - 13cm.
- Cliquez sur Terminer dans la dernière fenêtre et la fenêtre de la séquence du Groupe Acquisition sera uneutomatically peuplé avec la séquence d'DLIT. Il y aura une image acquise par le filtre d'émission choisie et l'exposition automatique va choisir les paramètres optimaux à chaque longueur d'onde que par les sélections de l'Assistant de création d'image. La séquence générée comprend également une image de la lumière structurée sous réserve nécessaire pour la génération de la surface par l'intermédiaire de l'outil de topographie de surface décrit ci-dessous.
- Sélectionnez Acquire séquence d'acquérir les données de DLIT.
- Après l'acquisition de l'image est terminée, produire la topographie de la surface. Commencez par l'expansion de l'onglet Topographie de la surface sous la palette d'outils.
- Ensuite, sélectionnez l'orientation qui reflète fidèlement le côté de l'animal face à la caméra ou le haut de l'instrument SIIV. Puis cliquez sur Générer surface. Découper la zone du champ de vision qui contient l'animal.
- Ensuite, utilisez le masque pourpre de définir les limites de l'animal.
REMARQUE: L'outil de masquage utilise le contraste des couleurs pour que les animaux à fourrure sombre ou de la peau ne seront pas masquer appropriée de la stage. - Cliquez sur Terminer et la surface apparaît automatiquement. Sauvegardez le résultat sous l'onglet Topographie de la surface puis fermez l'onglet que nous n'aurons plus besoin de lui.
- Reconstruire la position de la source optique 3D en utilisant les algorithmes de reconstruction optiques diffuses mises en œuvre dans Vivre image 22 en élargissant l'onglet DLIT reconstruction 3D.
- Les images acquises pour la séquence de DLIT sont présentés.
REMARQUE: Le logiciel vérifie automatiquement la qualité des données acquises et désélectionner les images jugées trop faible ou si la saturation est présent. Sélectionnez Démarrer en bas à droite. - Si nécessaire, on peut ajuster le seuil pour chaque image de bioluminescence en double-cliquant et en utilisant le curseur de seuil sur le côté inférieur gauche.
NOTE: c'est principalement pour inclure signal de faible intensité et la prudence devrait être pratiqué lorsque seuillage plus que cela peut ajuster l'intensité globale de la source reconstruite finale.
- Les images acquises pour la séquence de DLIT sont présentés.
- Ouvrez le navigateur de DICOM en cliquant sur l'icône 3D dans la barre d'outils en haut du logiciel (troisième à gauche) et la recherche de l'image Quantum FX acquis précédemment.
- Chargez cette image dans la vue 3D onglet Salon de l'image en double-cliquant sur le fichier à importer.
NOTE: Le repère doit être détecté automatiquement et le résultat dans l'image μCT étant inscrit sur l'image optique 3D.
- Chargez cette image dans la vue 3D onglet Salon de l'image en double-cliquant sur le fichier à importer.
- Décochez la visualisation carte de la topographie de la surface en élargissant Outils optiques 3D dans la palette d'outils et décochez la case à cocher Afficher marqué Sujet surface dans l'onglet de la surface.
- Créer manuellement une table de consultation pour visualiser le squelette et l'implant K-fil qui sont visibles dans l'image μCT aide de l'histogramme sous l'onglet Volume de la 3D multi-Modalisection Outils té de la palette d'outils.
- L'histogramme représente la répartition de l'intensité des voxels des données volumétriques 3D et leur opacité de la couleur. Pour déterminer où le tissu d'intérêt particulier dans l'histogramme, utilisez l'outil de curseur pour le rendu seuil jusqu'à ce que le tissu ou la structure est visible.
- Ensuite, faites un clic droit dans l'histogramme pour générer des points et former une courbe d'isoler cette zone de l'histogramme. Cette action sera répétée pour chaque structure - squelette suivie par l'implant K-fil et peut être enregistré comme une table de référence pour les analyses futures.
- Les composants peuvent être codés par couleur si on le souhaite en double-cliquant n'importe quel point généré dans l'histogramme et en sélectionnant la couleur de votre choix dans la fenêtre pop-up.
6. μCT Visualisation et analyse d'images
- Utilisation du logiciel Quantum FX, sélectionnez l'image de l'intérêt et de lancer Viewer. Sélectionnez l'outil de rotation et de réorienter l'image pour visualize l'axe longitudinal du fémur. Sélectionnez l'outil de mesure et de mesurer la longueur du fémur.
- Lancez la visionneuse 3D pour générer des rendus 3D. Réglez le seuil de montrer les changements dans l'anatomie osseuse associés à l'infection implant.
- Appliquer plans de découpe de sorte que le rendu 3D est limitée à la section transversale souhaitée de la zone d'intérêt dans le fémur distal.
- Lancez le logiciel Analyser 11.0. Chargez le fichier * .vox qui a été utilisé pour créer le rendu 3D.
- Lancez l'outil de calcul de l'image. Utilisez l'outil «Région Pad 'pour recadrer l'image (enlever les avions qui ne comprennent pas le fémur).
- Lancez l'outil de sections Oblique. Utilisation de l'option 3 points pour trouver des points au milieu du fémur, et le grand trochanter extrémité de la broche. Faire ces points un avion oblique et générer une image avec de nouvelles tranches.
- Lancez la région de l'outil d'intérêt. Afficher les tranches transaxiales. Réglez le min et max cadres pour afficher l'os cortical. Créer contours des tranches correspondantes pendant plusieurs tranches (avec un intervalle approximatif de 5 tranches) pour les tranches qui correspondent à la partie distale 25% du fémur. Utilisez l'outil «Régions Propager» pour interpoler entre ces contours et créer une région 3D d'intérêt. Sauvegarder cette région d'intérêt comme une carte d'objet.
- Lancez l'outil «exemples Options '. Cochez la case pour voir la carte de l'objet que vous venez de créer et sélectionnez les boutons radio pour les options appropriées. Cliquez sur le bouton "Configurer le journal Statistiques de confirmer que la case à cocher 'Volume' est sélectionné. Cliquez sur le bouton 'Exemples d'images de faire les mesures réelles.
- Exporter les mesures de volume dans un programme d'analyse de données. Normaliser les volumes osseux extérieures de points de temps plus tard, le premier point de temps imagée en utilisant la formule: Volume de Δ (en%) = ([Volume (jour X) - Volume (jour 2)] / [Volume (jour 2)]) x 100 .
NOTE: Dans cette formule, la variable "X" représente le point d'intérêt de temps. Le nombre qui en résulte représente le changement de la taille du volume de l'os extérieur de la partie distale du fémur au cours du temps. - Pour visualiser la région 3D d'intérêt au-dessus de l'os, de charger l'image CT dans l'outil «Volume Render. Charger la carte de l'objet contenant la région 3D d'intérêt. Aller à «View''Objects» et réglez le 'Original' pour être 'On'. Ouvrez la fenêtre "Aperçu". Lancez le menu 'Render Types »et sélectionnez« objet compositing.
- Cliquez sur le bouton «seuil» et l'outil et ajuster les seuils d'afficher la carte de l'os et de l'objet. Utiliser le même intervalle de seuil fixe pour tous les points dans le temps. Cliquez sur le bouton «Rotation» et définir l'orientation pour être un vrai vue antérolatérale. Cliquez sur "Render" pour générer le rendu final. Enregistrer le rendu de la principale «VolumeRendu 'fenêtre.
Representative Results
Dans bioluminescente vivo et l'imagerie de fluorescence
Dans la présente étude, le protocole est décrit par le modèle publié antérieurement d'une infection de l'articulation prothétique orthopédique chez les souris 14 à 19, qui implique la mise en place chirurgicale d'un implant en titane K-fil qui s'étend à partir d'un canal intramédullaire du fémur dans le joint en espace 14-19. S. aureus souche bioluminescente Xen29 (1 x 10 3 CFU dans 2 ul de PBS) a été introduit à la pipette directement au-dessus de l'implant en titane d'extrémité dans l'articulation du genou avant la fermeture du site chirurgical 16. Pour visualiser et de quantifier le fardeau et l'influx de neutrophiles bactérienne non invasive chez les souris LysEGFP anesthésiés, toute l'imagerie optique animaux in vivo a été réalisée séquentiellement l'image des signaux bioluminescents des bactéries et les signaux EGFP fluorescentes des neutrophiles infiltrent l'aide de l'animal entier optique SIIV spectre dans vivoSystème d'imagerie à trois jours post-opératoires (par exemple, deux jours, 14 et 28). Les signaux bioluminescents Xen29 de souris infectées sont restées au-dessus des signaux de souris infectées simulées pour la durée de l'expérience (Figure 1A, C) 16 fond. Nos travaux antérieurs ont démontré que les signaux in vivo bioluminescentes estimés de près les chiffres de l'ex vivo UFC isolés du / tissu et adhérente osseuse commune aux implants 17,18. En outre, les signaux de fluorescence EGFP ont été plus élevés que les souris sham-infectées à des moments précoces mais approchés des niveaux de fond au cours de l'infection (figure 2B, C) 16.
Co-registration 3D de signaux optiques in vivo avec des images μCT
Pour visualiser les signaux optiques (c.-à-signaux, et des bactéries bioluminescentes fluorescentes EGFP) dans le contexte anatomique de l'articulation du genou post-chirurgicales in 3D, les images optiques générées à l'aide du système d'imagerie IVIS spectre ont été co-enregistrées avec les images μCT générées en utilisant le système d'imagerie Quantum FX μCT. Cette co-enregistrement peut être réalisé parce que la chambre d'imagerie de la souris peut être inséré dans la machine, soit pour faire en sorte que les souris étaient dans la même orientation exacte. Pour vérifier cette précision, les résultats ont été comparés avec une acquisition d'image effectuée à l'aide du spectre-CT in vivo système d'imagerie IVIS qui intègre à la fois des modalités dans un instrument sans nécessiter de déplacement physique de l'animal. Pour mapper les données optiques sur les images μCT en 3D, nous avons utilisé une tomographie optique algorithme de reconstruction diffuse 16. La reconstruction 3D obtenue est représentée (Film 1).
En outre, l'imagerie μCT permis la visualisation et la quantification des modifications corrélatives à la qualité et les dimensions de l'os qui a eu lieu au coursl'infection (figure 2) 16. Comme indiqué précédemment, le volume osseux externe du fémur distal sensiblement augmenté au cours du temps (figure 2A) 16. Pour quantifier ces modifications, l'analyse d'image volumétrique 3D a été réalisée sur l'extrémité distale de 25% de la surface du osseux du fémur et de l'évolution du volume de l'os au cours du temps ont été normalisés au volume initial de l'os. Le volume de l'os extérieur sensiblement augmenté chez les souris infectées, comparativement à des souris infectées simulées (figure 2B) 16. L'augmentation du volume de l'os du fémur distal externe est probablement due à des lésions osseuses causées par l'infection des tissus et des os conjointe, qui ont été observés en utilisant μCT imagerie et l'analyse histologique 16.
Figure 1: 2D in vivo bioluminescente et signaux fluorescents. S. aureus Xen29 ou pas de bactéries (non infectées) ont été inoculées dans l'articulation du genou après placement K-fil et souris LysEGFP ont été imagées en utilisant le système d'imagerie IVIS spectre 16 (A). moyenne in vivo des signaux bioluminescents, telle que mesurée par flux total (photons / s) ± sem. (B) moyenne in vivo EGFP signaux fluorescents, telle que mesurée par le nombre total d'efficacité énergétique (photons / sec) / (uW / cm 2) ± sem. (C) représentant en bioluminescence in vivo et des signaux fluorescents recouvert sur une photographie en noir et blanc l'image des souris. La limite de détection de la charge bactérienne en utilisant l'imagerie bioluminescente in vivo est comprise entre 1 x 10 2 et 1 x 10 3 CFU. * P <0,05, † p <0,01, ‡ p <0,001 de souris Xen29 infectés par rapport à des souris de faux-infectés (test t de Student [bilatéral]). S'il vous plaîtnoter qu'il s'agit d'une figure représentative qui inclut les données publiées précédemment générées à l'aide Xen29 et imagés avec le système d'imagerie IVIS Lumina XR 16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: imagerie 3D μCT. S. aureus Xen29 ou pas de bactéries (non infectées) ont été inoculées dans l'articulation du genou après placement K-fil et les souris ont été imagées en utilisant le Quantum FX in vivo du système μCT. (A) représentant les rendus 3D μCT de Xen29 souris infectée par le (panneaux supérieurs) et les souris sham-infectés (panneaux inférieurs). (B) Pourcentage de changement de volume de l'os externe (distale 25% des fémurs) normalisée à la ti initialemoi Point (moyenne ± SEM). * P <0,05, † p <0,01, ‡ p <0,001 de souris Xen29 infectés par rapport à des souris de faux-infectés (test t de Student [bilatéral]). S'il vous plaît noter que ceci est une figure représentative qui inclut les données publiées précédemment générés en utilisant la souche bioluminescente S. aureus Xen29 et imagée avec le Quantum FX in vivo μCT système d'imagerie 16. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film 1 . Représentant 3D anatomique de co-enregistrement des signaux bioluminescents Xen29 et les signaux de fluorescence EGFP-neutrophiles en combinaison avec les images μCT. Les images sont mises en rotation sur l'axe vertical.
Discussion
imagerie multimodalité tels que les techniques d'imagerie qui utilisent l'imagerie optique in vivo en association avec l'imagerie μCT fournit une nouvelle approche technologique qui permet la visualisation 3D, la quantification et le suivi longitudinal des processus biologiques dans un contexte anatomique 1-4. Les protocoles dans la présente étude fournissent des informations détaillées sur la façon in vivo de bioluminescence et l'imagerie de fluorescence peut être combiné avec l'imagerie μCT dans un modèle d'infection orthopédique prothétique d'implant chez la souris pour contrôler la charge bactérienne, une inflammation neutrophile et modifications anatomiques dans l'os de façon non invasive et longitudinalement sur temps. Pris ensemble, les informations obtenues en combinant l'imagerie optique et structurelle représente une avancée technologique majeure, qui peut être particulièrement bien adapté pour étudier les processus biologiques et les conditions pathologiques qui affectent le système musculo-squelettique.
Un intérêtconclusion tion qui doit être souligné, c'est que nous avons observé que les signaux fluorescents EGFP-neutrophiles a diminué à des niveaux de fond en 14-21 jours et sont restés à des niveaux de fond pour la durée de l'expérience, malgré la présence de bactéries bioluminescentes. Il est peu probable que l'irradiation aux rayons X impacté survie de neutrophiles comme nous avons observé une cinétique similaire des signaux de neutrophiles chez les souris non irradiées 19. Dans nos précédents travaux impliquant un modèle de S. plaies infectées aureus, l'infiltration de neutrophiles ont consisté en une combinaison de recrutement des neutrophiles de la circulation solide, la survie prolongée des neutrophiles au site d'infection et la domiciliation des cellules progénitrices de KIT + de l'abcès, où elles donnent lieu à mûrir localement neutrophiles 23. Il est probable que des procédés similaires ont contribué à l'infiltration de neutrophiles dans l'implant orthopédique S. modèle d'infection aureus. Bien qu'il ne sait pas pourquoi les signaux de neutrophiles a diminué dans le Orthopmodèle d'infection aedic, il se pourrait que la réponse immunitaire a changé au fil du temps que cette infection a progressé d'un aigu à l'infection chronique et c'est un sujet de recherches futures.
Il ya des limites à ce modèle de souris de l'infection articulation prothétique orthopédique et la multimodalité vivo imagerie qui devrait être noté. Tout d'abord, ce modèle de souris est une simplification des procédures réelles et les matériaux utilisés en chirurgie orthopédique chez l'homme 24. Néanmoins, ce modèle fait récapituler l'infection chronique et l'inflammation qui s'ensuit dans l'os et les tissus des articulations que l'on voit dans les infections d'implants orthopédiques droits de 8,9. En outre, pour obtenir les images μCT, des doses relativement faibles d'irradiation aux rayons X ont été utilisées pour minimiser tout effet néfaste sur la santé des animaux au cours de l'infection. Pour une meilleure résolution de l'os, des doses plus élevées de rayonnement de rayons X peuvent être utilisés pour l'imagerie μCT sur un euthanasiésNIMAUX. Cependant, cela éliminerait la possibilité de surveiller de manière non invasive et longitudinalement les modifications de l'os au cours de la durée des expériences.
En conclusion, l'imagerie multimodalité impliquant la combinaison de l'ensemble de l'imagerie optique in vivo animaux à l'imagerie anatomique μCT a permis une information plus complète sur l'infection et la réponse inflammatoire. En outre, ces techniques ont permis l'évaluation des conséquences de l'infection et de l'inflammation de l'os et du tissu articulaire. Les travaux futurs pourraient profiter de l'imagerie multimodalité pour évaluer l'efficacité des thérapies antimicrobiennes, les réponses immunitaires, pathogenèse de la maladie et les changements réactifs dans l'os comme nous avons commencé à enquêter 14-18. En outre, l'imagerie multimodale peut évaluer des sondes et des traceurs pour diagnostiquer la présence d'une infection, comme décrit précédemment dans des modèles animaux d'infection de la cuisse, une endocardite, infecter pulmonaireions et les infections biomatériaux 25-28. Enfin, l'utilisation de l'imagerie multimodalité pourrait être étendu au-delà des maladies infectieuses et utilisé dans toutes les disciplines, y compris l'orthopédie, la rhumatologie et l'oncologie, pour enquêter sur d'autres conditions qui affectent le système musculo-squelettique, comme le cancer du squelette, la maladie métastatique, les fractures et l'arthrite 5-7 .
Disclosures
JAM, BNT, EL, NZ, KPF sont employés de PerkinElmer, qui fabrique des instruments d'imagerie payé, à condition que le Xen29 bioluminescente S. souche aureus, et payé les frais de publication de cette vidéo-article. Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par un programme de H & M Lee de recherche des résidents chirurgicale Scholars (à JAN), un AO Foundation Start-Up subvention S-12-03M (à LSM) et les Instituts nationaux de la santé subvention R01-AI078910 (à LSM) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain | PerkinElmer | Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient | |
| Tryptic soy broth | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 211825 | |
| Bacto Soy Agar | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 214010 | |
| LysEGFP knockin mouse strain | Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene | ||
| Betadine | Purdue Products, Stamford, CT | ||
| Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter) | Synthes, West Chester, PA | 492.08 | |
| Wire Cutter - Duracut T.C. | H&H Company, Ontario, Canada | 83-7002 | |
| Isoflurane | Baxter, Deerfield, IL | 118718 | |
| Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting) | Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International. | 95056-936 | |
| Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml) | Zoopharm, Windsor, CO | analgesic | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | optical in vivo imaging system | |
| Quantum FX in vivo µCT system | PerkinElmer, Hopkinton, MA | µCT in vivo imaging system | |
| IVIS SpectrumCT Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | combined optical and µCT in vivo imaging system | |
| Living Image Software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Image analysis software for in vivo optical imaging |
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