Summary
Kombineret optisk og μCT billeddannelse i en musemodel af ortopædisk implantat infektion ved anvendelse af en bioluminescerende manipuleret stamme af Staphylococcus aureus, forudsat at evnen til ikke-invasivt og i længderetningen overvåge dynamik bakteriel infektion, såvel som den tilsvarende inflammatoriske respons og anatomiske ændringer i knogle.
Abstract
Multimodalitet imaging er opstået som en fælles teknologisk fremgangsmåde, der anvendes i både præklinisk og klinisk forskning. Avancerede teknikker, der kombinerer in vivo optiske og μCT billeddannelse tillader visualisering af biologiske fænomener i en anatomisk sammenhæng. Disse billeddannende modaliteter kan være særligt nyttigt at undersøge forhold, der påvirker knogle. Navnlig ortopædiske implantat infektioner er et stort problem i klinisk ortopædisk kirurgi. Disse infektioner er vanskelige at behandle, fordi bakterielle biofilm dannes på de udenlandske kirurgisk implanterede materialer, hvilket fører til vedvarende inflammation, osteomyelitis og eventuel osteolyse af knoglen omkring implantatet, hvilket i sidste ende resulterer i implantatet løsner og fiasko. Her blev en musemodel for en inficeret ortopædisk proteseimplantat anvendes der involverede den kirurgiske placering af en Kirschner-tråd implantatet i en intramedullær kanal i lårbensknoglen på en sådan måde, at den ende af implantatet eXtended i knæleddet. I denne model, LysEGFP mus, en muse-stamme, der har EGFP-fluorescerende neutrofiler, blev anvendt i forbindelse med en bioluminescerende Staphylococcus aureus stamme, der naturligt udsender lys. Bakterierne blev inokuleret i knæleddene fra musene forud for lukning af operationsstedet. In vivo bioluminescerende og fluorescerende billeddannelse blev anvendt til at kvantificere den bakterielle belastning og neutrofil inflammatorisk respons hhv. Desuden blev μCT billeddannelse udført på den samme mus, så at 3D placeringen af bioluminescerende og fluorescerende optiske signaler kunne co-registreret med de anatomiske μCT billeder. For at kvantificere ændringerne i knoglen over tid, blev den ydre knogle volumen af den distale lårben, målt ved specifikke tidspunkter ved hjælp af en semi-automatisk kontur baseret segmentering proces. Taget sammen, kombinationen af in vivo bioluminiscente / fluorescerende billeddannelse med μCT billeddiagnostik kan være særligt nyttigt feller ikke-invasiv overvågning af infektion, inflammatorisk respons og anatomiske ændringer i knoglen over tid.
Introduction
Multimodalitet præklinisk billeddannende teknikker, der inddrager en kombination af optiske og anatomiske oplysninger tillader visualisering og overvågning af biologiske fænomener i 3D 1-4. Da μCT billeddannelse tillader udsøgte visualisering af knogle anatomi ved hjælp μCT billeddannelse i konjunktion med optisk afbildning repræsenterer en unik kombination, der kan være særligt nyttigt for at undersøge processer, der involverer knoglebiologien 5-7. Et eksempel kunne være at bruge disse teknikker til at studere ortopædiske implantat infektioner, som repræsenterer en katastrofal komplikation efter ortopædiske kirurgiske procedurer 8,9. Bakterier biofilm dannes på de implanterede fremmedlegemer, der fremmer overlevelse af bakterierne ved at fungere som en fysisk barriere, der forhindrer immunceller fra sensing infektion og blokerer antibiotika i at få adgang bakterierne 10,11. Den kroniske og vedvarende infektion af den fælles væv (septisk arthritis) end knogle (osteomyelitis) inducerer knogleresorption, der fører til at løsne af protesen og eventuel fiasko 8,9. Det resulterende omkring protesen osteolyse er forbundet med øget sygelighed og dødelighed 12,13.
I vores tidligere arbejde, blev in vivo selvlysende og fluorescerende billeddannelse anvendes sammen med X-ray og mikro-computertomografi imaging (μCT) i en ortopædisk protese fælles infektion model i mus 14-19. Involverede Denne model placerer en titanium Kirschner-tråd (K-tråd) på en sådan måde, at den afskårne ende af implantatet udvides i knæleddet fra lårben af mus 14-19. Et inoculum af Staphylococcus aureus (bioluminescerende stamme Xen29 eller Xen36) blev derefter pipetteret på overfladen af implantatet i knæleddet før det kirurgiske sted blev lukket 14-19. In vivo optisk billeddannelse blev anvendt til at detektere og kvantificere de bioluminescerende signaler, som svarede til number af bakterier i den inficerede led og knoglevæv 14-19. Desuden in vivo fluorescensimagografi af LysEGFP mus, som besidder fluorescerende neutrofiler 20, blev anvendt til at kvantificere antallet af neutrofiler, som udvandrede til de inficerede knæled indeholdende K-wire implantater 14,19. Endelig anatomiske billeddiagnostiske metoder, herunder høj opløsning røntgenbilleder og μCT billedbehandling, tilladte respektive 2D og 3D anatomisk billeddannelse i den berørte knogle over hele varigheden af kronisk infektion, som vi vilkårligt ville ende typisk mellem 2 og 6 postoperative uger 16 18. Ved hjælp af denne model, kan effekten af lokal og systemisk antimikrobiel terapi, beskyttende immunrespons og patologiske anatomiske forandringer i knogle evalueres 14-18. I dette manuskript blev de detaljerede protokoller for de optiske og μCT afbildningsmodaliteter i denne ortopædisk protese fælles infektion modellen som en representative system til at studere de biologiske processer i den anatomiske sammenhæng af knoglen. Disse omfatter de kirurgiske procedurer til at modellere en ortopædisk protese fælles infektion i mus, 2D og 3D i vivo optisk billeddiagnostiske procedurer (for at påvise bakterielle bioluminiscerende signaler og fluorescerende neutrofile signaler), μCT billedbehandling erhvervelse og analyse, og co-registrering af 3D optiske billeder med μCT billeder.
Protocol
Etik erklæring: Alle dyr blev behandlet i nøje overensstemmelse med god dyr praksis som defineret i de føderale lovgivning som fastsat i dyreværnsloven (AWA), 1996 Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr og PHS politik for Humane Pleje og anvendelse af forsøgsdyr og alt animalsk arbejde blev godkendt af Johns Hopkins Animal Care og brug Udvalg (Protokol #: MO12M465).
1. Forberedelse inokulum af Mid-logaritmiske Bioluminescent Bakterier
- Streak bioluminiscerende S. aureus stamme Xen29 (eller en anden bioluminscent stamme såsom Xen36) på tryptisk soja-agarplader (tryptisk sojavæske i agar [1,5%]).
BEMÆRK: S. aureus Xen29 21 er en gensplejset S. aureus-stamme, der indeholder en modificeret lux operon afledt Photorhabdus luminescens, som er integreret i en stabil native plasmid, som findes i denne bakteriestamme. Disse motordækkede bakterier konstitutivt udsender lys fra levende og metabolisk aktive celler. - Dyrke kolonier på pladerne ved at inkubere dem ved 37 ° C i cirka 16 timer (O / N).
- Vælg enkelt bakteriel CFU og kultur i ryste flydende TSB (240 rpm) i cirka 16 timer (O / N).
- Udfør en subkultur med 1/50 fortynding af O / N-kulturen for at få midt-logaritmiske vækstfase bakterier (ca. 2 timers varighed).
- Træpiller, resuspender og vaske bakterierne 3x i PBS.
- Vurdere den bakterielle podestoffer (1 x 10 3 CFU i 2 pi PBS) ved at bestemme den optiske tæthed absorbans ved 600 nm.
- Kontroller, at CFU i inokulum efter dyrkning af bakterierne O / N på plader.
2. Mus Kirurgiske Procedurer
BEMÆRK: For disse eksperiment, skal du bruge en tolv uger gamle mandlige LysEGFP mus. Disse mus har forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), der udtrykker myeloide celler (som består af mostly neutrofiler) 20. Oprethold sterile betingelser under operationen og efter kirurgisk prep med betadin og 70% alkohol ved at placere hver mus på et sterilt afdækningsstykke oven på en hård overflade cirkulerende varmepude vand. Brug kjole, sterile handsker, maske og sterilisere instrumenter.
- Bedøve mus ved hjælp af en inhalation 2% isofluran. Brug dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Vurdere det passende niveau af anæstesi ved at observere respirationsfrekvens, muskeltonus, tå knibe, hornhinderefleks og farve af slimhinderne. Dæk mus med et sterilt kirurgisk afdækningsstykke med et hul på operationsstedet på højre knæ. Musen bør få understøttende opvarmning foranstaltninger til opretholdelse af kropstemperatur, mens under anæstesi. Varm 37 ° C varmt vand cirkulerer i et varmt vand kappe tæppe eller en vand cirkulerer hård plast opvarmet arbejdsstation (ProStation, Patterson, scientific) er gode måder at forhindre hypotermi.
- Injicere buprenorphine (sustained release-formulering) (2,5 mg / kg) subkutant lige før kirurgi. Yderligere doser af sustained-release-buprenorphin kan administreres til 3 dages intervaller som er nødvendig for analgesi.
- Barbere den operative knæ og prep hjælp af tre alternerende scrubs anvender betadine og 70% alkohol.
- Udfør en midtlinjeincision i huden overliggende højre knæled. Forlæng hudincision så extensor mekanisme kan være veldefineret.
- Udfør en medial parapatellar artrotomi og sublux quadriceps-patellarsenen extensor mekanisme sideværts med en Adson pincet.
BEMÆRK: Dette bringer interkondylære hak på lårbenet i almindelig visning. - Manuelt ream den intramedullære kanal ved hjælp af en 25 G kanyle efterfulgt af en 23 G nål.
Bemærk: For at undgå skader på lårben, kan bruges en stabiliserende platform. Dette bør være vigtigt for teknikken for at minimere en utilsigtet brud på lårbenet. - Indsæt en medicinsk-grade titanium Kirschner-tråd (diameter 0,8 mm) ved hjælp af en presse-fit teknik, som indebærer manuelt at skubbe det med en nål indehaver, i en retrograd retning i den intramedullære kanal.
BEMÆRK: Titanium K-tråde blev brugt som der var færre artefakter ses på μCT billeder med titanium K-tråde sammenlignet med rustfrit stål K-tråde 16. - Skær enden af Kirschner-tråd med pin fræsere, således at den afskårne ende af K-tråd strækker sig cirka 1 mm i knæleddet plads.
- Med en mikropipette pipette 2 pi 1 x 10 3 CFU bioluminiscerende S. aureus Xen29 på spidsen af implantatet i knæleddet plads.
BEMÆRK: Mere volumen fører til bredere væv forurening og mindre diskrete billeddannelse.
BEMÆRK: I kontrol-inficerede mus, tilsættes 2 ul sterilt saltvand uden bakterier. - Reducer quadriceps-patellar kompleks tilbage til midterlinjen ved hjælp af pincet og lukke overliggende subkutane væv og huden ved hjælp af absorberbarsubkutikulær suturer.
BEMÆRK: Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Må ikke returnere et dyr, der har gennemgået kirurgi til selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt. - Ved afslutningen af forsøgene, aflivet alle dyr ved hjælp af kuldioxid indånding ifølge Johns Hopkins Animal Care og brug Udvalg retningslinjer. Kontroller døden ved at observere dyret ikke komme inden for 10 min efter kuldioxid eksponering ender og halsdislokation.
3. 2D Optical Imaging (in vivo selvlysende og fluorescerende Imaging)
- Bedøve LysEGFP mus (fx 2% indånding isofluran) og placere dem med ventrale side op i et billeddannende kammer.
- Udfør in vivo bioluminiscerende billeddannelse ved hjælp IVIS Spectrum optisk hele dyr in vivo imaging system. Kontroller først, Selvlysende og bekræft valget af en åben Filter udvælgelse, synsfelt (FOV) C - 13 cm, og rul eksponeringstid ned til Auto (AE indstilling). AE justerer automatisk erhvervelse tid (lukkertid), udsmidningen (digital pixelsammenfletning) og f-stop (blænde) af instrumentet for at optimere signal intensitet og samtidig undgå mætning. Klik derefter på Acquire at fange bioluminescerende billede.
BEMÆRK: Til in vivo bioluminiscerende billeddannelse, billed-mus på mellem 1 - 5 min. - Udfør sekventiel in vivo fluorescerende billeddannelse ved at markere feltet ved siden af Fluorescent. Vælg 465 nm excitationsfilter og 520 nm emission filter. Rul eksponeringstid ned til Auto, og vælg FOV K (trin 3.2.1). Klik derefter på Acquire at fange fluorescensbillede.
BEMÆRK: Til in vivo fluorescerende billeddannelse, billed mus mellem 0,5 sek. - Kvantificere de in vivo selvlysende signaler som total flux (fotoner / sek) i et område af interesse (ROI) ved hjælp af Living Billede softwaren ved først at udvideROI Værktøj del af værktøjskassen.
- Vælg cirkelikon og antallet af ROI'er der svarer til antallet af emner dyr i FOV. Resize ROI til at omfatte området af interesse dvs bioluminescerende spredningsbillede indsamles.
- Vælg Mål ROI'er i ROI Tools i værktøjspaletten og ROI måling vises. Total Radiance (fotoner / s) værdier repræsenterer summen af bioluminiscerende pixel i den genererede investeringsafkast.
- Vælg SELECT ALL og kopiere fanerne i nederste højre hjørne af dette vindue vil overføre oplysningerne til klippebordet og tillade indsætte i efterfølgende programmer til analyse.
- Kvantificere de in vivo fluorescerende signaler totalt strålende effektivitet ([fotoner / sek] / [uW / cm 2]) i et cirkulært område af interesse (ROI) ved hjælp Living Billede software.
- Inden Living Billede softwaren vinduet udvide ROI Tools i værktøjskassen. VælgCircle ikon og antallet af ROI'er der svarer til antallet af emner dyr i FOV.
- Resize ROI til at omfatte området af interesse, der svarer nøje til bioluminescerende signal fra det tidligere billede erhvervelse.
- Vælg Mål ROI'er i ROI Tools i værktøjspaletten og ROI måling vises.
BEMÆRK: Samlet Radiant Effektivitet ([fotoner / s] / [uW / cm 2]) repræsenterer summen af fluorescerende pixel i ROI. - Vælg alle og kopiere fanerne i nederste højre hjørne af dette vindue vil overføre oplysningerne til klippebordet og tillade indsætte i efterfølgende programmer til analyse.
4. μCT Image Acquisition
- Placer bedøvede LysEGFP mus ind i et billeddannende kammer.
BEMÆRK: Denne billeddannelse kammer er designet til at passe i både IVIS Spectrum imaging system og Quantum FX in vivo μCT imaging system til at tilladeco-registrering af de optiske og μCT billeder. - Åbn CT-softwaren og vælg menuen indstillede 60 mm FOV std dynamisk fra dropdown.
- Sæt den store boring dæksel og adapteren arm til den billeddannende rumfærgen i instrumentet.
- Placer musen imaging rumfærgen ind i adapteren armen skub armen ind i boringen, og luk døren. Tænd Live-tilstand (Eye-knappen på Kontrolpanel), og placer motivet på 0 ° og 90 ° portalkran position ved hjælp af X-aksen og Y-akse kontrol for at centrere dyret i X capture vinduet. Derefter slukke Live-tilstand ved at klikke på Eye-knappen.
- Anskaf en dynamisk scanning billede med 60 mm FOV ved at klikke på knappen CT scanning (ved siden Live Mode). Eksportere erhvervede billede i DICOM format og opbevar det på et sted, der kan tilgås senere.
Bemærk: Den omtrentlige dosis være 26 mGy pr scanning. En 30 mm FOV kan anvendes, hvis der ønskes en bedre opløsning.
5.3D Optical Image Acquisition, Dannelse og μCT co-registrering
- Placer musen imaging rumfærgen indsatsen ind i Spectrum ved at placere den billeddannende rumfærgen indeholder muse ind i denne indsats og sikre, at musen bevæger sig ikke.
- Brug Living Billede vælge Imaging Wizard i Acquisition Kontrolpanel for at starte installationsguiden. For at starte, skal du vælge Bioluminescens, så DLIT, og vælg derefter de reporter "bakterier" fra rullemenuen og de relevante emissionsfiltre for modellen vil blive valgt automatisk, i dette tilfælde, 500 til 620 nm.
- Vælg Næste, og derefter udpege erhvervelse parametre og emneinformation i det sidste vindue. Konkret vil Imaging Emne være musen, vil Auto Indstillingerne vælges tillader autoeksponering at maksimere signal kvalitet og samtidig undgå mætning og synsfelt, vil blive indstillet til C - 13cm.
- Vælg Udfør i det sidste vindue og sekvensen vindue Akkvisitionen panelet vil være enutomatically befolket med DLIT sekvens. Der vil være et billede erhvervet pr emissionsfilter valgt, og AE vil vælge de optimale indstillinger ved hver bølgelængde som pr Imaging Wizard markeringer. Den genererede sekvens omfatter også en struktureret lys billede nødvendig for emnet overflade generering via overfladetopografi værktøj beskrevet nedenfor.
- Vælg Acquire Sequence at erhverve de DLIT data.
- Efter købet af billedet er færdig, genererer overfladen topografi. Start med at udvide fanen overfladetopografien under værktøjskassen.
- Dernæst skal du vælge den retning, der nøjagtigt afspejler den side af dyret vender kameraet eller toppen af IVIS instrumentet. Klik derefter på Generer overflade. Crop region FOV, der indeholder dyr.
- Derefter bruger lilla maske til at definere grænserne for dyret.
BEMÆRK: maskering værktøj bruger farve kontrast, så dyr med mørk pels eller hud ikke vil maskere hensigtsmæssigt fra STage. - Vælg Afslut og overfladen vises automatisk. Gem resultatet under fanen overfladetopografien derefter lukke fanen, som vi ikke længere behøver det.
- Rekonstruere 3D optisk kilde position med de diffuse optiske rekonstruktionsalgoritmer implementeret i Living Billede 22 ved at udvide fanen DLIT 3D-rekonstruktion.
- Billeder, der er erhvervet til DLIT sekvens er vist.
BEMÆRK: Softwaren automatisk kontrollerer kvaliteten af de indsamlede data og vil fravælge billeder, anses for svagt, eller hvor mætning er til stede. Vælg Start nederst på højre side. - Hvis det ønskes, kan man justere tærsklen for hver bioluminescerende billede ved at dobbeltklikke og bruge tærskelværdibehandlingsproces skyderen nederst til venstre side.
BEMÆRK: Dette er først og fremmest at omfatte lavere intensitet signal og forsigtighed bør praktiseres, når tærsklingsrutine højere, da dette kan justere samlede intensitet af det endelige rekonstruerede kilde.
- Billeder, der er erhvervet til DLIT sekvens er vist.
- Åbn DICOM browser ved at klikke på ikonet 3D i værktøjslinjen øverst i softwaren (tredje fra venstre) og søger efter Quantum FX billedet tidligere erhvervet.
- Indlæs dette billede til Living Billede 3D-visning fane ved at dobbeltklikke på filen til import.
BEMÆRK: fiducial skal registreres automatisk, og resultere i μCT billede, der er registreret med 3D optisk billedstabilisering.
- Indlæs dette billede til Living Billede 3D-visning fane ved at dobbeltklikke på filen til import.
- Fravælg overfladetopografien visualisering kort ved at udvide 3D Optiske værktøjer i værktøjskassen og fravælge afkrydsningsfeltet som hedder Vis Emne Overflade i fanebladet flade.
- Manuelt oprette en opslagstabel at visualisere skelet og K-wire implantat, der er synlige i μCT billedet ved hjælp af histogram under fanen 3D Multi-Modali Volumety Værktøj del af værktøjskassen.
- Histogrammet repræsenterer fordelingen af voxel intensiteter i 3D volumetriske data og deres farve opacitet. At afgøre, hvor særligt væv af interesse er i histogrammet, skal du bruge skyderen værktøj til at tærsklen rendering, indtil vævet eller strukturen er synlig.
- Derefter højreklikke i histogrammet for at generere point og en kurve for at isolere det område af histogrammet. Dette vil blive gentaget for hver struktur - skelet efterfulgt af K-leder implantatet og kan gemmes som en opslagstabel for fremtidige analyser.
- Komponenter kan være farvekodede, hvis det ønskes ved at dobbeltklikke enhver genererede punkt i histogrammet og vælge den ønskede farve i pop op-vinduet.
6. μCT Billede Visualisering og analyse
- Brug af Quantum FX-softwaren, skal du vælge billedet af interesse og lancere Viewer. Vælg værktøjet Rotation og vende billedet til visualize længdeakse lårbenet. Vælg værktøjet måling og måle lårbenet længde.
- Start 3D Viewer til at generere 3D-gengivelser. Indstil tærsklen for at vise ændringerne i knogle anatomi forbundet med implantat infektion.
- Anvend klipning fly så at 3D rendering er begrænset til det ønskede tværsnit del af området af interesse i den distale femur.
- Start Analyser 11.0 softwarepakke. Indlæs * .VOX fil, der blev brugt til at oprette 3D-rendering.
- Start Billede Calculator værktøj. Anvende »regionen Pad 'værktøj til at beskære billedet (fjern fly, der ikke omfatter lårbenet).
- Start Oblique Sektioner værktøj. Brug 3 point mulighed for at finde punkter i midten af lårbenet, større trochanter og enden af stiften. Gør disse punkter et skråt plan og generere et billede med nye skiver.
- Start med interesseområdet værktøj. Visning af de transaksiale skiver. Juster min og max indstillings at vise barkbenet. Opret konturer for de skiver, der svarer til en flere skiver (med en omtrentlig interval på fem skiver) for de skiver, der svarer til den distale 25% af lårbenet. Bruge 'forplante Regionsudvalgets værktøj til at interpolere mellem disse konturer og skabe en 3D område af interesse. Gem denne region af interesse som et objekt kort.
- Start 'Sample Indstillinger "værktøj. Vælg afkrydsningsfeltet for det objekt kort, der lige er oprettet, og vælg alternativknapperne for de relevante indstillinger. Klik 'Konfigurer Log Stats' knappen for at bekræfte, at afkrydsningsfeltet 'Lydstyrke' er valgt. Klik på knappen 'Sample Images' for at gøre det faktiske målinger.
- Eksporter målingerne volumen i en dataanalyse program. Normalisere ydre knogle mængder fra senere tidspunkter til det første filmede tidspunkt ved hjælp af formlen: Δ Volumen (%) = ([Lydstyrke (dag X) - Volumen (dag 2)] / [Lydstyrke (dag 2)]) x 100 .
BEMÆRK: I denne formel, variablen "X" repræsenterer tidspunkt af interesse. Den resulterende tal repræsenterer ændring i størrelsen af det ydre knogle volumen af den distale lårbensknogle over tid. - At visualisere 3D-regionen af interesse på toppen af knoglen, indlæse CT-billede i 'Lydstyrke Render "værktøj. Indlæse objektet kort med 3D-regionen af interesse. Gå til 'View''Objects' og sæt 'Original' for at være 'On'. Åbn 'Preview' vindue. Start "Render typer 'i menuen og vælg' Objekt sammensætning«.
- Klik på knappen 'Threshold' knappen og værktøj og justere de tærskelværdier for at vise knoglen og objekt kort. Brug den samme faste tærskel interval for alle tidspunkter. Klik på knappen 'Rotation' knappen og indstil retningen at være en sand anterolateral udsigt. Klik på 'Render' for at generere den endelige rendering. Gem gengivelse fra de vigtigste 'LydstyrkeRender 'vindue.
Representative Results
In vivo bioluminescerende og fluorescerende billeddannelse
I den foreliggende undersøgelse, er protokollen beskrevet for denne tidligere offentliggjorte model af en ortopædisk proteseled infektion i mus 14-19, hvilket indebærer kirurgisk placering af en titanium K-wire implantat, der strækker sig fra en marvkanalen i lårbenet i det fælles plads 14-19. S. aureus bioluminescerende stamme Xen29 (1 x 10 3 CFU i 2 pi PBS) blev pipetteret direkte på toppen af enden titanimplantatet i knæleddet før lukning af operationsstedet 16. For at visualisere og kvantificere den bakterielle belastning og neutrofil indstrømning invasivt i bedøvede LysEGFP mus blev in vivo hele dyret optisk billeddannelse udført sekventielt billede bioluminescerende signaler fra bakterierne og EGFP fluorescerende signaler fra infiltrerende neutrofiler hjælp IVIS Spectrum optisk hele dyr vivoimaging system på tre postoperative dage (dvs. dag 2, 14 og 28). Bioluminescerende signaler Xen29-inficerede mus forblev over baggrunden signaler af skin-inficerede mus for varigheden af forsøget (figur 1A, C) 16. Vores tidligere arbejde viste, at in vivo bioluminescerende signaler tilnærmes antallet af ex vivo CFU isoleret fra den fælles / knoglevæv og klæbende til implantaterne 17,18. Desuden EGFP fluorescerende signaler var højere end sham-inficerede mus ved tidlige tidspunkter, men nærmede baggrundsniveauer under infektion (figur 2B, C) 16.
3D co-registrering af in vivo optiske signaler med μCT billeder
Til at visualisere de optiske signaler (dvs. bakteriel bioluminiscerende og EGFP fluorescerende signaler) i den anatomiske sammenhæng med de postoperative knæled jegn 3D, de optiske billeder, der dannes ved hjælp af IVIS Spectrum imaging system var co-registreret med μCT billeder, der dannes ved hjælp af Quantum FX μCT imaging system. Denne co-registrering kunne opnås, fordi mus billeddannelse kammer kan indsættes i enten maskinen for at sikre, at musene var i nøjagtig samme retning. For at verificere denne nøjagtighed, blev resultaterne sammenlignet med et billede erhvervelse udføres ved hjælp IVIS Spectrum-CT in vivo imaging system, der integrerer begge modaliteter i ét instrument uden at kræve fysisk flytning af dyret. At kortlægge de optiske data på μCT billeder i 3D, vi udnyttet en diffus optisk tomografi rekonstruktionsalgoritme 16. Den resulterende 3D-rekonstruktion er vist (film 1).
Desuden μCT billedbehandling tillod visualisering og kvantificering af de betydningsfulde ændringer i kvaliteten og dimensioner af knoglen, der fandt sted i løbet afinfektion (figur 2) 16. Som tidligere rapporteret, den ydre knogle volumen af den distale lårbensknogle væsentligt forøget over tid (figur 2A) 16. For at kvantificere disse ændringer blev 3D volumetrisk billede analyse udført på den distale 25% af boney overflade af femur og ændringerne i knoglen volumen over tid blev normaliseret til den oprindelige knogle volumen. Den ydre knogle volumen steget betydeligt i inficerede mus sammenlignet med sham-inficerede mus (figur 2B) 16. Stigningen i distale femur ydre knogle volumen var sandsynligvis på grund af knogle skader forårsaget af infektion i fælles væv og knogler, der blev observeret ved hjælp μCT billedbehandling og histologisk analyse 16.
Figur 1. 2D in vivo bioluminescerende og fluorescerende signaler. S. aureus Xen29 eller ingen bakterier (ikke-inficerede) blev podet i knæleddet efter K-leder placering og LysEGFP mus blev filmede med IVIS Spectrum billeddannende system. 16 (A) Gennemsnitlig in vivo selvlysende signaler målt som total flux (fotoner / sek) ± sem. (B) Middel in vivo EGFP fluorescerende signaler målt som total strålende effektivitet (fotoner / s) / (uW / cm2) ± sem. (C) Repræsentativ in vivo bioluminescerende og fluorescerende signaler overlejret på et sort og hvidt fotografisk billede af musene. Grænsen for påvisning af bakterielle byrde hjælp in vivo selvlysende billeddannelse er mellem 1 x 10 2 og 1 x 10 3 CFU. * P <0,05, † p <0,01, ‡ p <0.001 Xen29-inficerede mus versus sham-inficerede mus (Student t-test [tosidede]). VenligstBemærk dette er et repræsentativt tal, der omfatter tidligere offentliggjorte data genereret med Xen29 og afbildet med IVIS Lumina XR billedbehandlingssystem 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. 3D μCT billedbehandling. S. aureus Xen29 eller ingen bakterier (ikke-inficerede) blev podet i knæleddet efter K-leder placering og mus blev filmede med Quantum FX in vivo μCT systemet. (A) Repræsentant 3D μCT gengivelser af Xen29 -inficerede mus (øverste paneler) og sham-inficerede mus (nederste paneler). (B) Procentdel af ydre knogle volumen ændring (distale 25% af lårben) normaliseret til den oprindelige TImig punkt (gennemsnit ± SEM). * P <0,05, † p <0,01, ‡ p <0.001 Xen29-inficerede mus versus sham-inficerede mus (Student t-test [tosidede]). Bemærk venligst at dette er et repræsentativt tal, der omfatter tidligere offentliggjorte data genereret ved hjælp af selvlysende stamme S. aureus Xen29 og filmede med Quantum FX in vivo μCT billeddannende system 16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1 . Repræsentant 3D anatomisk co-registrering af Xen29 selvlysende signaler og EGFP-neutrofil fluorescerende signaler i kombination med de μCT billeder. Billederne roteres på den lodrette akse.
Discussion
Multimodalitet billeddannelse som billeddannende teknikker, der udnytter in vivo optisk billeddannelse i forbindelse med μCT billedbehandling giver en ny teknologisk tilgang, der gør det muligt for 3D-visualisering, kvantificering og langsgående overvågning af biologiske processer i en anatomisk sammenhæng 1-4. Protokollerne i denne undersøgelse giver detaljerede oplysninger om, hvordan in vivo selvlysende og fluorescerende billeddannelse kan kombineres med μCT billeddannelse i et ortopædisk proteseimplantat infektion model i mus til at overvåge den bakterielle byrde, neutrofil inflammation og anatomiske forandringer i knoglen ikke-invasivt og langs over tid. Tilsammen oplysninger indhentet ved at kombinere optisk og strukturel billeddannelse repræsenterer et stort teknologisk fremskridt, som kan være særligt velegnet til at studere biologiske processer og patologiske tilstande, der påvirker bevægeapparatet.
En interesseing konstatering af, at skal påpeges, er, at vi observeret, at EGFP-neutrofil fluorescerende signaler faldt til baggrundsniveauer af 14-21 dage og forblev på baggrundsniveauer for varigheden af forsøget på trods af tilstedeværelsen af selvlysende bakterier. Det er usandsynligt, at røntgenbestråling påvirket neutrofil overlevelse som vi bemærkede lignende kinetik neutrofile signaler i ikke-bestrålede mus 19. I vores tidligere arbejde, der involverer en model af S. aureus inficerede sår, neutrofil infiltration er en kombination af en robust neutrofilrekruttering fra kredsløbet, langvarig neutrofil overlevelse på stedet for infektion og målsøgning af KIT + progenitorceller til absces, hvor de lokalt giver anledning til modne neutrofiler 23. Det er sandsynligt, at lignende processer bidrog til neutrofil infiltration i det ortopædiske implantat S. aureus infektion model. Selv om det er ukendt, hvorfor de neutrofile signaler faldt i Orthopaedic infektion model, kan det være, at immunresponset ændres over tid, da denne infektion har udviklet sig fra en akut til kronisk infektion, og dette er en genstand for fremtidig undersøgelse.
Der er begrænsninger med denne musemodel af ortopædiske proteser fælles infektion og in vivo multimodale billeddannelse, der bør bemærkes. Først denne musemodel er en oversimplificering af de faktiske procedurer og materialer i ortopædisk kirurgi i mennesker 24. Ikke desto mindre, denne model gør rekapitulere kronisk infektion og efterfølgende betændelse i knoglen og fælles væv, der er set i menneskelige ortopædiske implantat infektioner 8,9. Hertil kommer, at opnå de μCT billeder, var relativt lave doser af røntgenstråling til at minimere eventuelle negative virkninger på sundheden hos de dyr i løbet af infektionen. For bedre opløsning af ben, højere doser af røntgenstråling kunne anvendes til μCT billeddannelse på aflivet ennimals. Men det ville fjerne evnen til ikke-invasivt og i længderetningen overvåge knogleforandringer over varigheden af forsøgene.
Sammenfattende har multimodalitet billeddannelse involverer kombinationen af in vivo hele dyret optisk billeddannelse med anatomisk μCT billeddannelse tilladt mere omfattende information om den infektion og inflammatorisk reaktion. Desuden har disse teknikker tillader evaluering af følgerne af infektion og betændelse i knogler og led væv. Det fremtidige arbejde vil kunne drage fordel af multimodalitet billeddannelse at evaluere effekten af antimikrobielle behandlinger, immunreaktioner, patogenese af sygdomme og de reaktive forandringer i knoglen, som vi er begyndt at undersøge 14-18. Desuden kunne multimodale billeddannelse evaluere prober og sporstoffer til at diagnosticere tilstedeværelsen af en infektion som tidligere beskrevet i dyremodeller låret infektion, endocarditis, pulmonal inficererioner og biomateriale infektioner 25-28. Endelig kan brugen af multimodale billeddannelse udvides ud over smitsomme sygdomme og anvendes på tværs af discipliner, herunder ortopædi, reumatologi og onkologi, for at undersøge andre forhold, der påvirker bevægeapparatet, såsom skelet kræft, metastatisk sygdom, knoglebrud og gigt 5-7 .
Disclosures
JAM, BNT, EL, NZ, KPF betales medarbejdere PerkinElmer, der fremstiller afbildningsinstrumenterne, forudsat at Xen29 bioluminiscente S. aureus stamme, og betalt for omkostningerne ved denne video-artikel publikation. De resterende Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en H & H Lee Kirurgisk Resident Research Scholars Program (til JAN), en AO Foundation starttilskud S-12-03M (til LSM) og et National Institutes of Health tilskud R01-AI078910 (til LSM) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain | PerkinElmer | Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient | |
| Tryptic soy broth | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 211825 | |
| Bacto Soy Agar | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 214010 | |
| LysEGFP knockin mouse strain | Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene | ||
| Betadine | Purdue Products, Stamford, CT | ||
| Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter) | Synthes, West Chester, PA | 492.08 | |
| Wire Cutter - Duracut T.C. | H&H Company, Ontario, Canada | 83-7002 | |
| Isoflurane | Baxter, Deerfield, IL | 118718 | |
| Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting) | Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International. | 95056-936 | |
| Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml) | Zoopharm, Windsor, CO | analgesic | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | optical in vivo imaging system | |
| Quantum FX in vivo µCT system | PerkinElmer, Hopkinton, MA | µCT in vivo imaging system | |
| IVIS SpectrumCT Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | combined optical and µCT in vivo imaging system | |
| Living Image Software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Image analysis software for in vivo optical imaging |
References
- Dothager, R. S., et al. Advances in bioluminescence imaging of live animal models. Curr Opin Biotechnol. 20, 45-53 (2009).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging progress and applications. Trends Biotechnol. 29, 624-633 (2011).
- Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging current applications and future directions. J Nucl Med. 49, 1-4 (2008).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- Reumann, M. K., Weiser, M. C., Mayer-Kuckuk, P. Musculoskeletal molecular imaging a comprehensive overview. Trends Biotechnol. 28, 93-101 (2010).
- Snoeks, T. J., Khmelinskii, A., Lelieveldt, B. P., Kaijzel, E. L., Lowik, C. W. Optical advances in skeletal imaging applied to bone metastases. Bone. 48, 106-114 (2011).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Del Pozo, J. L., Patel, R. Clinical practice. Infection associated with prosthetic joints. N Engl J Med. 361, 787-794 (2009).
- Parvizi, J., Adeli, B., Zmistowski, B., Restrepo, C., Greenwald, A. S. Management of periprosthetic joint infection the current knowledge AAOS exhibit selection. J Bone Joint Surg Am. 94, e104 (2012).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Speziale, P., Montanaro, L., Costerton, J. W. Biofilm formation in Staphylococcus implant infections. A review of molecular mechanisms and implications for biofilm-resistant materials. Biomaterials. 33, 5967-5982 (2012).
- Zimmerli, W., Moser, C. Pathogenesis and treatment concepts of orthopaedic biofilm infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 158-168 (2012).
- Cram, P., et al. Total knee arthroplasty volume utilization and outcomes among Medicare beneficiaries 1991-2010. JAMA. 308, 1227-1236 (2012).
- Wolf, B. R., Lu, X., Li, Y., Callaghan, J. J., Cram, P. Adverse outcomes in hip arthroplasty long-term trends. J Bone Joint Surg Am. 94, (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5, (2010).
- Bernthal, N. M., et al. Protective role of IL-1beta against post-arthroplasty Staphylococcus aureus infection. J Orthop Res. 29, DOI. 1621-1626 (2011).
- Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and µCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS ONE. 7, e47397 (2012).
- Niska, J. A., et al. Daptomycin and tigecycline have broader effective dose ranges than vancomycin as prophylaxis against a Staphylococcus aureus surgical implant infection in mice. Antimicrob Agents Chemother. 56, 2590-2597 (2012).
- Niska, J. A., et al. Vancomycin-Rifampin Combination Therapy has Enhanced Efficacy Against an Experimental Staphylococcus aureus Prosthetic Joint Infection. Antimicrob Agents Chemother. 57, 5080-5086 (2013).
- Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. J Orthop Res. 30, 335-340 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Direct continuous method for monitoring biofilm infection in a mouse model. Infect Immun. 71, 882-890 (2003).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007 (2007).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117, 3343-3352 (2011).
- Deirmengian, C. A., Lonner, J. H. What's new in adult reconstructive knee surgery. J Bone Joint Surg Am. 94, 182-188 (2012).
- Ning, X., et al. Maltodextrin-based imaging probes detect bacteria in vivo with high sensitivity and specificity. Nat Mater. 10, 602-607 (2011).
- Panizzi, P., et al. In vivo detection of Staphylococcus aureus endocarditis by targeting pathogen-specific prothrombin activation. Nat Med. 17, 1142-1146 (2011).
- van Oosten, M., et al. Realtime in vivo imaging of invasive and biomaterial associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nat Commun. 4, 2584 (2013).
- Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous beta lactamase reporter enzyme fluorescence in live mice. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 12239-12244 (2010).
