Summary
Staphylococcus aureus bir biyolojik olarak ışık veren mühendislik suşu kullanılarak, ortopedik protez enfeksiyonun bir fare modelinde, optik ve uCT görüntüleme birlikte, invaziv olmayan uzunlamasına ve bakteriyel enfeksiyonun dinamikleri, hem de karşılık gelen enflamatuar yanıtı ve anatomik değişiklikleri izlemek için bir kapasite sağlamadığı Kemik.
Abstract
Multimodalite görüntüleme hem klinik öncesi ve klinik araştırmalarda kullanılan ortak bir teknolojik yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. In vivo optik ve uCT görüntüleme birleştiren gelişmiş teknikleri, anatomik bir bağlamda biyolojik olayların görselleştirme izin. Bu görüntüleme yöntemleri koşulları etkileyen kemik incelemek için özellikle yararlı olabilir. Özellikle, ortopedik implant infeksiyonları klinik ortopedik cerrahide önemli bir sorun vardır. Bu enfeksiyonlar, bakteriyel biyofilm yabancı ameliyatla takılan bir malzeme üzerinde oluşan nedeniyle kalıcı enflamasyon, osteomiyelit ve sonuçta, implantın gevşemesine ve başarısızlıkla sonuçlanan implant çevreleyen kemik nihai kemik erimesine yol, tedavi etmek zordur. Burada, enfeksiyonlu bir ortopedik protez implant bir fare modelinde bir şekilde femurda bir kemik iliği kanalına Kirschner teli implantın ameliyat yerleştirme ile ilgili olduğu kullanıldığı implant e sonudiz eklemi içine Xtended. Bu modelde, fareler LysEGFP, EGFP gibi floresan nötrofiller sahip olan bir fare türünde olarak, doğal olarak ışık yayan bir biyoluminesan Staphylococcus aureus suşu ile bağlantılı olarak kullanılmıştır. Bakteriler. Önce cerrahi alan kapatma için farelerin diz eklemlerine aşılanır in vivo biyolojik olarak ışık veren ve floresan görüntü sırasıyla bakteri yükü ve nötrofil enflamatuar yanıtı ölçmek için kullanılmıştır edildi. Biyolüminesans ve floresan ışık sinyalleri 3B konum anatomik uCT görüntü ile birlikte kaydedilebilir böylece ek olarak, uCT görüntüleme aynı fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Zaman kemik değişiklikleri ölçmek için, uzak femur dış kemik hacmi, yarı otomatik bir kontur dayalı bölütleme işlemi kullanılarak belirli bir zaman noktalarında ölçülmüştür. UCT görüntüleme ile, in vivo biyo-lüminesan / flüoresan görüntüleme kombinasyonu F özellikle faydalı olabilir Birlikte ele alındığında,veya enfeksiyon, inflamatuvar yanıt ve zamanla kemiğin anatomik değişikliklerin noninvaziv izlenmesi.
Introduction
Optik ve anatomik bilgi kombinasyonunu içeren Multimodalite klinik öncesi görüntüleme teknikleri görselleştirme ve 3D 1-4 biyolojik olayların izlenmesini sağlar. UCT görüntüleme optik görüntüleme, kemik biyolojisi 5-7 içeren süreçleri araştırmak için özellikle yararlı olabilir benzersiz bir bileşimini temsil ile birlikte birlikte uCT görüntüleme kullanarak kemik anatomi nefis görselleştirme, izin beri. Bir örnek ortopedik cerrahi işlemler 8,9 izleyen bir felaket komplikasyon temsil ortopedik implant enfeksiyonları, incelemek için bu teknikleri kullanmak olacaktır. Bakteriler biyofilm bakterileri 10,11 erişmesini enfeksiyon ve bloklar antibiyotik algılama bağışıklık hücreleri engeller, fiziksel bir bariyer görevi görerek bakterilerin hayatta kalmasını teşvik implante yabancı nesneler üzerinde oluştururlar. Eklem dokusu (septik artrit) an bölgesinin kronik ve inatçı enfeksiyond kemik (osteomyelit) protez ve nihai başarısızlık 8,9 gevşemesine yol açar kemik erimesini neden olur. Bu oluşan Periprostetik osteolizis artmış morbidite ve mortalite 12,13 ile ilişkilidir.
Bizim önceki çalışmada, in vivo biyolüminesans ve floresan görüntüleme fareler 14-19 bir ortopedik protez eklem enfeksiyonu modeli X-ışınları ve mikro-bilgisayarlı tomografi görüntüleme (uCT) ile birlikte kullanıldı. Bu model, bir şekilde, titanyum Kirschner teli-(K-teli) konulmasını içerir farelerde 14-19 arasında uyluk kemiklerinden diz ekleminin uzatılmış implantın kesilmiş ucundan. Cerrahi alan 14-19 kapatılmasından önce Staphylococcus aureus (Bio-ışıldar soy Xen29 veya Xen36) bir aşılama malzemesi daha sonra. Diz ekleminde implantın yüzeyi üzerine pipetlendi in vivo optik görüntüleme, biyolüminesans sinyallerini algılamak ve ölçmek için kullanıldı Nu geldienfekte eklem ve kemik dokusunda 14-19 bakteri mber. Buna ek olarak, floresan nötrofiller 20 sahip LysEGFP farelerde, in vivo görüntüleme floresan, K teli ihtiva eden implantları 14,19 enfekte diz eklemleri göç nötrofillerin sayısını hesaplamak için kullanıldı. Son olarak, yüksek çözünürlüklü X-ışını görüntüleme ve uCT görüntüleme dahil olmak üzere anatomik görüntüleme yöntemleri, biz keyfi 2 ve 6 hafta sonrasına 16 arasında genellikle biteceğini kronik enfeksiyonun tüm süresi üzerinde etkilenen kemiğin ilgili 2D ve 3D anatomik görüntüleme izin , 18. Bu modeli kullanarak, lokal ve sistemik tedavi antimikrobiyal koruyucu bağışıklık tepkilerinin ve kemikte patolojik anatomik bir etkinliği 14-18 değerlendirilebilir. Bu yazıda, bu ortopedik protez eklem enfeksiyonu modelinde optik ve uCT görüntüleme yöntemleri için ayrıntılı protokoller bir representati olarak sağlandıkemiğin anatomik bağlamında biyolojik süreçleri incelemek için sistem ettik. Bu farelerde bir ortopedik protez eklem enfeksiyonu modellemek için cerrahi prosedürler vardır, 2D ve in vivo optik görüntüleme prosedürleri 3D (bakteriyel biyolüminesens sinyalleri ve floresan nötrofil sinyalleri algılamak için) ile 3D optik görüntülerin, uCT görüntüleme toplama ve analizi ve co-kayıt uCT görüntüler.
Protocol
Etik bildirimi: Bütün hayvanlar Hayvan Refahı Yasası (AWA) belirtildiği şekilde, federal düzenlemelerde tanımlandığı gibi iyi hayvan uygulama ile sıkı göre ele alınmıştır, Humane için Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım ve PHS Politikası 1996 Kılavuzu Bakım ve Laboratuvar Hayvanları ve tüm hayvan çalışmalarının kullanılması Johns Hopkins Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Protokol #: MO12M465) tarafından onaylandı.
1. inokulum hazırlanması Mid-logaritmik biyoluminesen Bakteri
- Streak Bioluminescent S. triptik soya agar plakaları üzerine aureus suşu Xen29 (ya da başka bir Xen36 bioluminscent suşu) (ağar [% 1.5] olarak triptik soya suyu).
NOT: S. aureus, Xen29 21, genetik olarak S olduğu Bu bakteri soyu içinde bulunan bir sabit yerli plazmid içine entegre edilmiştir, Photorhabdus luminescens, türetilmiş bir tadil edilmiş, lux operon'u aureus suşu içerir. Bu motorri bakteri yapısal olarak canlı ve metabolik olarak aktif hücrelerden ışık yayarlar. - Yaklaşık 16 saat (O / N), 37 ° C'de kuluçka ile plakalar üzerinde koloniler büyütün.
- Yaklaşık 16 saat (O / N) için sıvı TSB (240 rpm) sallayarak tek bakteriyel CFU ve kültürünü seçin.
- Orta-logaritmik büyüme fazı bakteriler (yaklaşık olarak 2 saat süre) elde edilmesi için O / N 1/50 kültür seyreltme ile bir alt-kültür gerçekleştirin.
- Pelet, tekrar süspansiyon ve yıkama bakteri PBS 3x.
- 600 nm'de optik yoğunluk emiciliğin saptanmasıyla (2 ul PBS içinde 1 x 10 3 CFU) ve bakteriyel inokulum tahmin.
- Plakalar üzerinde bakteri O / N kültürleme sonra inokulum CFU doğrulayın.
2. Fare Cerrahi İşlemleri
Not: Bu deney için, on iki haftalık erkek fareler LysEGFP kullanın. Bu fareler m oluşur miyeloid hücreleri (ifade yeşil floresan proteininin (EGFP) geliştirilmiş sahiptirlerostly nötrofiller) 20. Ameliyat sırasında ve ısıtma pedi dolaşan bir sert yüzey su üstünde bir steril örtü her fare koyarak Betadin ve% 70 alkol ile cerrahi hazırlık sonrası steril koşullar koruyun. Cüppe, steril eldiven, maske kullanın ve aletleri sterilize.
- Izofluran% 2 inhalasyon kullanmadan fare anestezisi. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözlerin veteriner merhem kullanın. , Kas tonusu, ayak tutam, kornea refleksi ve mukoza rengini solunum hızını gözlemleyerek anestezi uygun seviyede değerlendirin. Sağ diz ameliyatı yerinde bir delik steril cerrahi örtü ile fareler örtün. Fare anestezi altında iken vücut ısısını korumak için destekleyici ısıtma tedbirleri almalısınız. Sıcak su ceketli bir battaniye veya sert plastik ısıtmalı iş istasyonu (ProStation Patterson, Scientific) dolaşan bir su dolaşan sıcak 37 ° C su hipotermi önlemek için iyi bir yoldur.
- Buprenorph enjekte-piridin (sürekli olarak bırakılan formülasyon) (2.5 mg / kg) deri altından ameliyattan hemen önce. Analjezi için ihtiyaç duyulan uzun süreli salınımlı Ek dozda buprenorfin 3 günlük aralıklarla uygulanabilir.
- Operatif diz Tıraş ve betadin ve% 70 alkol kullanarak üç alternatif önlük kullanarak hazırlayalım.
- Sağ diz eklemi örten deride bir ensizyon gerçekleştirin. Ekstansör mekanizma iyi tanımlanmış böylece deri kesisi uzatın.
- Bir dizkapağı artrotomisi gerçekleştirin ve Adson forseps ile yanal kuadriseps-patellar tendon ekstansör mekanizması sublux.
NOT: Bu ova görünümünde içine femur interkondiler çentik getiriyor. - Elle 23 G iğne ile izlenen bir 25 G iğne kullanılarak intramedüller kanalı oyun.
Not: femur hasar görmesini önlemek için, bir istikrar platformu kullanılabilir. Bu femur kazayla kırığı en aza indirmek için tekniğin için önemli olabilir. - Bir tıbbi sınıf titanyum Kirsc takınelle intramedüller kanala retrograd yönde, bir iğne tutucu kullanarak iterek gerektirir bir basın-fit tekniği kullanarak Schachner-tel (0,8 mm çap).
NOT: paslanmaz çelik K-teli 16 ile karşılaştırıldığında titanyum K-telleri ile uCT görüntülerinde görülen az eserler vardı olarak Titanyum K-telleri kullanılmıştır. - K-telinin kesik ucu yaklaşık 1 mm diz eklem uzaya yayılır böylece pim kesiciler ile Kirschner-teli ucunu kesin.
- Bir mikropipet, pipet biyolüminesens S. 1 x 10 3 CFU 2 ul kullanma diz eklem alanı içinde implant ucuna aureus Xen29.
NOT: Daha fazla hacim, daha geniş doku kirlenme ve daha az ayrık görüntüleme yol açar.
NOT: Kontrol bulaşmamış farelerde, herhangi bir bakteri olmadan steril tuzlu su 2 ul ekleyin. - Forseps kullanarak orta hatta geri kuadriseps-patellar kompleksi azaltın ve örten deri altı dokusu ve cilt emilebilir kullanarak kapatınsubkutiküler dikişler.
NOT: sternum yatma korumak için yeterli bilince kavuşana kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. - Deneylerin sonunda, Johns Hopkins Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Prensiplerine uygun olarak karbon dioksit inhalasyonu ile ötenazi tüm hayvanları. Hayvan gözlemleyerek ölüm doğrulayın karbondioksit pozlama uçları ve servikal dislokasyon sonraki 10 dakika içinde kurtarmak için başarısız olur.
3. 2D Optik Görüntüleme (in vivo biyoluminesen ve Floresan Görüntüleme)
- LysEGFP fareler (örneğin% 2 inhalasyon izofluran) anestezisi ve bir görüntüleme odasına kadar ventral yüzü koyun.
- In vivo görüntüleme sistemi IVIS Spektrum optik bütün hayvan kullanan in vivo biyolüminesens görüntüleme gerçekleştirin. Birincisi, Lüminesans kontrol ve açık bir f seçimi onaylamakilter seçimi, görünümü (FOV) C alan - 13 cm, ve aşağı Auto (seçerler ayar) pozlama süresini ilerleyin. Otomatik pozlama otomatik olarak doygunluk kaçınarak sinyal yoğunluğunu optimize etmek edinimi süresi (enstantane hızı), kutulamanın (dijital pixel binning), ve cihazın f-stop (diyafram) ayarlayacaktır. Sonra biyoluminesan görüntü yakalamak için Al'ı tıklatın.
NOT: in vivo bioluminescent görüntüleme için görüntü farenin 1 arası - 5 dakika. - Floresan yanındaki kutuyu işaretleyerek vivo floresan görüntüleme sıralı gerçekleştirin. 465 nm eksitasyon filtresi ve 520 nm emisyon filtresi seçin. Aşağı Auto pozlama süresini ilerleyin ve FOV C (Adım 3.2.1) seçin. Sonra floresan görüntü yakalamak için Al'ı tıklatın.
NOT: in vivo floresan görüntüleme, 0.5 sn arasındaki görüntü fareler için. - İlk genişleterek Living Image yazılımı kullanılarak faiz (ROI) bir bölgede in vivo bioluminescent sinyalleri toplam akı olarak (fotonlar / sn) niceliğiniAracı Paleti ROI Araçları bölümünde.
- FOV konusu hayvanların sayısına tekabül Çember Simge ve İB'nin sayısını seçin. Faiz ie bölgesini kapsayacak şekilde ROI yeniden boyutlandırma, biyolüminesans difüzyon modeli toplandı.
- Araç Paleti ve ROI Ölçüm Penceresinde ROI Araçlar Seçin Tedbir ROI görünecektir. Toplam Radiance (fotonlar / sn) değerleri oluşturulan ROI içinde biyoluminesan piksel toplamını temsil eder.
- SELECT ALL seçin ve bu pencerenin sağ alt köşesinde KOPYA sekmeler analiz için sonraki programlarına yapıştırarak panoya bilgileri aktarmak ve sağlayacaktır.
- Yaşayan Image yazılımı kullanılarak faiz (ROI) dairesel bir bölge içinde toplam ışıma verimliliği gibi in vivo floresan sinyalleri ([fotonlar / sn] / [μW / cm 2]) niceliğini.
- Yaşayan Image yazılımı penceresi içinde, Aracı Paleti ROI Araçları'nı genişletin. SeçinizÇember Simge ve FOV denek hayvanların sayısına karşılık gelen İB'nin sayısı.
- Önceki resim alımından bioluminescent sinyal yakından gelen ilgi bölgeyi kapsayacak şekilde ROI yeniden boyutlandırma.
- Araç Paleti ve ROI Ölçüm Penceresinde ROI Araçlar Seçin Tedbir ROI görünecektir.
NOT: Toplam Radiant Verimlilik ([fotonlar / s] / [μW / cm 2]) ROI içinde floresan piksel meblağlar temsil eder. - Analiz için sonraki programlarına yapıştırarak panoya bilgileri aktarmak ve sağlayacak bu pencerenin sağ alt köşedeki Tüm ve Kopyala sekmelerini seçin.
4. uCT Görüntü Alma
- Bir görüntüleme odasına anestezi LysEGFP fareler yerleştirin.
NOT: Bu görüntüleme odası izin IVIS Spektrum görüntüleme sistemi ve Kuantum FX in vivo uCT görüntüleme sistemi hem de uyacak şekilde tasarlanmıştırOptik ve uCT görüntülerin co-kayıt. - BT yazılımını açın ve açılan menüden dinamik menü önceden ayarlanmış 60 mm FOV std seçin.
- Geniş çaplı kapağı ve aracı haline görüntüleme servisi için adaptör kolunu takın.
- Sonra deliğin içine kolunu itin adaptör koluna fare görüntüleme mekik yerleştirin ve kapağını kapatın. Canlı Mod (Kontrol Paneli'nde Göz Düğme) açın ve X yakalama penceresinde hayvan ortalamak için X ekseni ve Y ekseni kontrollerini kullanarak 0 ° ve 90 ° portal konumunda konuyu yerleştirin. Sonra Göz Düğmesine tıklayarak Canlı Modu kapatın.
- (Sonraki Canlı Mod Button) CT Scan butonuna tıklayarak 60 mm FOV ile dinamik bir tarama görüntü kazanır. Daha sonra erişilebilir bir yerde DICOM formatında ve mağaza alınan görüntü aktarın.
NOT: ortalama doz tarama başına 26 mGy olacaktır. Daha iyi bir çözünürlük isteniyorsa, 30 mm'lik FOV kullanılabilir.
5.3D Optik Görüntü Alma, Oluşumu ve uCT Co-kayıt
- Bu ekin içine fare içeren görüntüleme mekik konumlandırma tarafından Spectrum içine fare görüntüleme mekik koyunuz ve fare hareket etmez emin olun.
- Yaşam Image kullanarak, sihirbaz kurulumunu başlatmak için Toplama Denetim Masası'ndaki Görüntüleme Sihirbazı'nı seçin. Başlatmak için, biyolüminesensin, ardından DLIT seçin, ve daha sonra, bu durumda, otomatik olarak 500 seçilecektir açılır menü ve model için uygun emisyon filtrelerden muhabir "Bakteriler" seçeneğini - 620 nm.
- İleri'yi seçin, sonra toplama parametreleri ve son pencerede konu bilgilerini belirler. Özellikle, Görüntüleme Konu Fare olacak, Otomatik ayarlar doygunluğu kaçınarak sinyal kalitesini en üst düzeye çıkarmak seçerler sağlayan seçilmiş olacaktır ve Field of View C ayarlanır - 13cm.
- Seçin son penceresinde Finish ve Toplama Paneli dizisi penceresi olacakutomatically DLIT dizisi ile doldurulur. Görüntü Sihirbazı seçimleri başı olarak her dalga boyunda emisyon seçilmiş filtre ve optimal ayarları seçecektir seçerler başına kazanılmış bir görüntü olacaktır. Oluşturulan sıra ayrıca aşağıda ayrıntılı Yüzey Topografyası aracıyla konusu yüzey üretimi için gerekli olan bir yapısal ışık görüntüsünü içerir.
- DLIT veri elde etmek Edinme sırası seçin.
- Görüntü elde etme işlemi tamamlandıktan sonra, yüzey topografisinin oluşturur. Aracı Paleti altında Yüzey Topografyası sekmesini genişleterek başlayın.
- Sonra, doğru IVIS cihazın kamera veya üst bakan hayvanın tarafını yansıtan yönünü seçin. Ardından Yüzey Oluştur seçeneğini tıklatın. Hayvan içeren FOV bölgeyi kırpın.
- Daha sonra hayvanın sınırlarını tanımlamak için mor maske kullanımı.
NOT: Koyu kürk ya da deri ile hayvan s den uygun maske olmayacak şekilde maskeleme aracı renk kontrastı kullanırbir avantajdır. - Son'u seçin ve yüzey otomatik olarak görünecektir. Artık ihtiyacınız olacak gibi sonra sekmeyi kapatmak Yüzey Topografyası sekmesi altında sonucunu kaydedin.
- DLIT 3D İmar sekmesini genişleterek Resmi 22 Living uygulanan yaygın optik rekonstrüksiyon algoritmaları kullanarak 3D optik kaynak konumunu yeniden yapılandırma.
- DLIT dizisi için satın Görüntüler gösterilmiştir.
NOT: Yazılım otomatik olarak elde edilen verilerin kalitesini denetler ve görüntüler çok loş kabul veya doygunluğu mevcut olduğu seçimini iptal edebilirsiniz. Sağ alt tarafta Başlat seçin. - Gerekirse, bir çift tıklayarak her biyoluminesan görüntü için eşik ayarlamak ve sol alt taraftaki eşikleme kaydırma çubuğunu kullanarak yapabilirsiniz.
Not: bu son yeniden kaynağının genel yoğunluğunu ayarlamak olabilir gibi yüksek eşikleyerek zaman uygulanmalıdır düşük yoğunlukta sinyal ve dikkatli dahil esas olarak.
- DLIT dizisi için satın Görüntüler gösterilmiştir.
- (Soldan üçüncü) yazılımın üstündeki Aracı Bar'da 3D simgesini tıklatarak DICOM tarayıcınızı açın ve daha önce edinilmiş Kuantum FX görüntüsünü aramak.
- Ithalat için dosyanın üzerine çift tıklayarak Yaşayan Resim 3D Görünüm sekmesinde bu resmi yükleyin.
NOT: yanlılık otomatik olarak algılanır ve uCT görüntüye neden edilmelidir 3D optik görüntü kaydediliyor.
- Ithalat için dosyanın üzerine çift tıklayarak Yaşayan Resim 3D Görünüm sekmesinde bu resmi yükleyin.
- Yüzey sekmesinde onay kutusu işaretli Ekran Konu Surface Araç Paleti 3D Optik Aletler genişletilmesi ve seçimi kaldırarak yüzey topografyası görselleştirme haritası kaldırın.
- Elle 3D Multi-Modali bir Birim sekmesi altında histogram kullanılarak uCT görüntüde görünür iskeleti ve K-teli implant görselleştirmek için bir arama tablosu oluşturmakAracı Paleti ty Araçları bölümünde.
- Histogram 3B hacimsel veriler ve renk opasitesi voksel yoğunluklarının dağılımını temsil etmektedir. Ilgi belirli doku Histogramda olduğu belirlemek için, dokuya kadar eşiğine render kaydırıcı aracını kullanın veya yapısı görülebilir.
- Sonra sağ noktaları oluşturmak ve histogram o bölgeyi izole etmek için bir eğri oluşturmak için Histogramda tıklayın. K-teli implant ardından iskeleti ve gelecek için bir arama tablosu analizleri olarak kaydedilebilir - Bu, her yapı için tekrar edilecektir.
- Bileşenler yüzden çift tıklayarak Histogramda herhangi üretilen noktasını istenen ve açılır pencereden istediğiniz rengi seçerek eğer renk kodlu olabilir.
6. uCT Görüntü Görüntüleme ve Analiz
- Kuantum FX yazılımını kullanarak, ilgi görüntüyü seçin ve Görüntüleyici başlatmak. Döndürme aracını seçin ve visuali için görüntüyü yeniden yönlendirmekfemur uzunlamasına ekseni ze. Ölçme aracını seçin ve femur uzunluğunu ölçmek.
- 3D render oluşturmak için 3D Viewer başlatın. İmplant enfeksiyonu ile ilişkili kemik anatomi değişiklikleri göstermek için eşik ayarlayın.
- 3D gösterilmesi distal femurda ilgi alanının istenen enine kesit bölümüne sınırlı olacak şekilde uçak kırpma uygulanır.
- Çözümle 11.0 yazılım paketi başlatın. 3D render oluşturmak için kullanılan * .VOX dosya yükleyin.
- Görüntü Hesaplama aracını başlatın. (Femur dahil değildir uçakları kaldırmak) görüntüyü kırpmak için 'Bölge Pad' aracını kullanın.
- Eğik Bölümler aracını başlatın. Femur, büyük trokanter ve pimin ucunun ortasında noktalarını bulmak için 3 puan seçeneğini kullanın. Bu noktaları bir eğik düzlem yapın ve yeni dilimleri ile bir görüntü oluşturur.
- Faiz aracı Region başlatın. Transaksiyel dilimleri görüntüler. Min ve max ayarını ayarlayıns kortikal kemiği görüntülemek için. Femurun distal% 25'ine tekabül eden dilimler (5 dilimlik yaklaşık arayla) bir dilim için karşılık gelen çok sayıda dilim hatlarını oluşturur. Bu kontür arasındaki değeri ve ilgi 3D bölge oluşturmak için 'Propagate Bölgelerindeki aracını kullanın. Bir nesne haritası olarak ilgi bu bölgeyi kaydedin.
- 'Örnek Seçenekler' aracını başlatın. Yeni oluşturulan nesne harita için onay kutusunu seçin ve uygun seçenekleri için radyo düğmelerini seçin. 'Ses' onay kutusunun seçili olduğunu onaylamak için 'yapılandır Günlüğü İstatistikleri' düğmesine tıklayın. Gerçek ölçümler yapmak için 'Örnek Görüntüler' düğmesine tıklayın.
- Bir veri analizi programına hacmi ölçümleri ihracat. Formülü kullanarak ilk görüntülü zaman noktasına sonra zaman noktalarından dış kemik hacimleri normalize: Δ Hacim (%) = ([Hacmi (gün X) - Hacim (2 gün)] / [Ses (2 gün)]) x 100 .
NOT: Bu formülde, değişken "X", ilgi konusu zaman noktasını temsil eder. Elde edilen sayısı, zaman içinde uzak femurun kemik hacmi dış ölçülerine değişimi temsil eder. - Kemik üstüne faiz 3D bölgesini görselleştirmek için, 'Ses Render' aracı BT resim yüklemek. Ilgi 3D bölgesini içeren nesne haritayı yükleyin. 'View''Objects' gidin ve 'Original' On 'olarak belirlendi. 'Preview' penceresini açın. 'Render Türleri' menüsünü açın ve 'Nesne birleştirme' seçeneğini seçin.
- 'Eşik' düğmesine ve aracını tıklayın ve kemik ve nesne haritası göstermek için eşik ayarlayın. Tüm zaman noktaları için aynı sabit eşik aralığı kullanın. 'Rotation' düğmesini tıklayın ve gerçek bir anterolateralden görünümü olması için yönünü ayarlamak. Son render oluşturmak için 'Render' tıklayın. Ana 'Volume render kaydedin'Penceresini Render.
Representative Results
In vivo Bioluminescent ve fluoresan görüntülemede
Bu çalışmada, protokol, eklem içine femurda bir kemik iliği kanalına uzanan bir titanyum K-teli implantın ameliyat yerleştirilmesinden ibarettir farelerde 14-19 bir ortopedik protez eklem iltihabı, bu daha önce yayınlanmış model için açıklanan uzay 14-19. S. aureus biyoluminesan suşu Xen29 (2 ul PBS içinde 1 x 10 3 CFU) müşterek önce cerrahi sitesi 16 kapatma diz sonu titanyum implantın üstüne doğrudan pipetlendi. Görselleştirmek ve anestezi altındaki farelerin LysEGFP invaziv olmayan bir bakteri yükü ve nötrofil akışını ölçmek için, in vivo olarak, bütün hayvanlar optik görüntüleme görüntü arka arkaya uygulandı IVIS Spektrumu optik bütün hayvan kullanılan infiltre nötrofillerden bakterilerden biyoluminesan sinyal ve EGFP: flüoresan sinyalleri in vivoÜç postoperatif gün (yani gün 2, 14 ve 28) üzerinde görüntüleme sistemi. Xen29 ile enfekte edilmiş farelerin biyo-lüminesan sinyalleri, deney (Şekil 1A, C), 16 süresi için sahte enfekte edilmiş farelerin arka plan sinyalleri üzerinde kalmıştır. Daha önceki çalışmalar, in vivo biyo-lüminesan sinyalleri yakından implant 17,18 için ortak / kemik dokusu ve yapışık izole eks vivo CFU numaraları yaklaşık gösterdi. Buna ek olarak, EGFP: flüoresan sinyalleri, erken zaman noktalarında, sahte enfekte edilmiş farelere göre daha yüksek olan, ancak enfeksiyonu esnasında (Şekil 2B, C), 16 sırasında arka plan seviyelerine yaklaşmıştır.
UCT görüntüleri ile in vivo optik sinyallerin 3D co-kayıt
Ameliyat sonrası diz eklemlerinin anatomik bağlamında optik sinyalleri (örneğin, bakteriyel biyoluminesan ve EGFP: flüoresan sinyalleri) görselleştirmek için In 3D, IVIS Spektrum görüntüleme sistemi kullanılarak oluşturulan optik görüntülerin eş kayıtlı Kuantum FX uCT görüntüleme sistemi kullanılarak oluşturulan uCT görüntüleri ile idi. Fare görüntüleme odası farenin aynı yönde olmasını sağlamak ya makineye takılı olabilir çünkü bu co-kayıt gerçekleştirilebilir. Bir görüntü elde etme hayvanın fiziksel tehcir gerektirmeden tek bir cihazda hem modaliteleri entegre IVIS Spektrum-CT in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilen bu doğruluğunu doğrulamak için, sonuçlar karşılaştırıldı. 3D uCT görüntüleri üzerine optik veri eşleştirmek için, biz bir yaygın optik tomografi rekonstrüksiyon algoritması 16 kullanılmıştır. Oluşan 3D rekonstrüksiyon (Film 1) gösterilmiştir.
Buna ek olarak, uCT görüntüleme sırasında oluşan kemiğin kalitesi sonuç olarak ortaya çıkan değişiklikler ve boyutları Görselleştirme ve evcilenfeksiyonu (Şekil 2) 16. Daha önce bildirildiği gibi, distal femur dış kemik hacmi önemli ölçüde zaman (Şekil 2A) 16 artmıştır. Bu değişiklikleri ölçmek için, 3B hacimsel görüntü analiz femur kemikli yüzeyinin uzak% 25 üzerinde gerçekleştirildi ve zaman içinde kemik hacmindeki değişiklikler başlangıç kemik hacmi normalize edildi. Dış kemik hacmi esas olarak sahte enfekte edilmiş fareler (Şekil 2B) 16 ile karşılaştırıldığında enfekte edilen farelerde artmıştır. Distal femur dış kemik hacmi içinde artışın uCT görüntüleme ve histolojik analiz 16 kullanılarak gözlenmiştir eklem doku ve kemik, enfeksiyon sonucu kemik hasarı olasılığı oldu.
Şekil 1. 2D in vivo biyoluminesan ve floresan sinyaller. S. aureus Xen29 veya bakteri (enfekte edilmemiş) K-teli yerleştirilmesi ve LysEGFP farenin IVIS Spektrum görüntüleme sistemi 16 kullanılarak görüntülendi sonra diz ekleminin içine aşılandı. (A), in vivo olarak biyolojik olarak ışık veren ortalama toplam sinyalleri akışı (foton / saniye) ile ölçüldüğü haliyle ortalama ± SEM. (B) ortalama in vivo olarak EGFP flüoresan sinyal toplam radyant verimi (foton / saniye) ile ölçüldüğü haliyle, bir siyah-beyaz fotoğraf üzerine bindirilmiş vivo bioluminescent ve floresan sinyalleri sem. (C) Temsilcisi ± / (μW / cm2) Farelerin görüntüsü. İn vivo biyolojik olarak ışık veren görüntülemesi kullanılarak bakteri yükünün tespit limiti 3 10 x 10 x 2 1 ile 1 CFU olduğu. * P <0.05, † p <0.01, ‡ p <sahte enfekte edilmiş farelere göre 0,001 ile enfekte edilmiş farenin Xen29 (Student t-testi [iki kuyruklu]). LütfenBu Xen29 kullanılarak üretilen ve IVIS Lumina XR görüntüleme sistemi 16 ile görüntülendi önceden yayınlanmış verileri içeren temsili bir rakam olduğunu unutmayın. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Xen29 Şekil 2. 3D uCT görüntüleme. S. aureus Xen29 veya bakteri (bulaşmamış) K-teli yerleştirildikten sonra diz ekleminin içine aşılandı ve farenin Kuantum FX in vivo uCT sistem kullanılarak görüntülendi. (A) Temsilcisi 3D uCT kaplamalar ile enfekte olan fareler (üst panel) ve sahte enfekte edilmiş farenin (alt paneller). başlangıç ti normalize dış kemik hacmi değişim (femur distal% 25) (B) YüzdeBana (ortalama ± SEM) point. * P <0.05, † p <0.01, ‡ p <sahte enfekte edilmiş farelere göre 0,001 ile enfekte edilmiş farenin Xen29 (Student t-testi [iki kuyruklu]). Bu bioluminescent suşu S. kullanılarak oluşturulan önceden yayınlanmış verileri içeren temsili bir rakam olduğunu unutmayınız aureus Xen29 ve Kuantum FX in vivo uCT görüntüleme sistemi 16 ile görüntülenmiş. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Film 1 . Örnek 3B uCT görüntüler ile kombinasyon halinde Xen29 biyoluminesan sinyaller ve EGFP-nötrofil floresan sinyalleri anatomik eş tarihi. Görüntüler, dikey eksende döndürülür.
Discussion
Böyle uCT görüntüleme ile birlikte in vivo optik görüntüleme istifade görüntüleme teknikleri gibi multimodalite görüntüleme anatomik bir bağlamda 1-4 3D görselleştirme, ölçümlerini ve biyolojik süreçlerin boyuna izlenmesine olanak sağlayan yeni teknolojik yaklaşım sağlar. Bu çalışmada invaziv olmayan protokoller ve uzunlamasına üzerinde kemik bakteri yükü, nötrofilik enflamasyon ve anatomik değişiklikleri izlemek için farelerde bir ortopedik protez implantı enfeksiyon modelinde uCT görüntüleme ile birleştirilebilir nasıl in vivo biyolojik olarak ışık veren ve floresan görüntü ayrıntılı bilgi sağlar süresi. Birlikte ele alındığında, optik ve yapısal görüntüleme birleştirerek elde edilen bilgi, özellikle kas-iskelet sistemini etkileyen biyolojik süreçleri ve patolojik durumları incelemek için çok uygundur olabilir büyük bir teknolojik ilerleme temsil eder.
Bir faizişaret edilmelidir ing bulgu EGFP-nötrofil flüoresan sinyalleri 14-21 gün daha düzeylere düşmüştür ve biyolojik olarak ışık veren bakterilerin varlığına rağmen deney süresi boyunca arka seviyede kalmıştır ki söz konusu olmasıdır. Biz ışınlanmamış farelerde 19 nötrofil sinyallerin benzer kinetiğini görüldüğü gibi, X-ışını ışınlama nötrofil hayatta kalmasını etkilediğini mümkün değildir. Daha önceki çalışmada S. modeli içeren aureus enfekte yaralar, nötrofil infiltrasyonu enfeksiyon yerinde ve yerel olarak nötrofiller 23 olgun doğuran apse, için KIT + progenitör hücrelerin hominginde de dolaşımdan sağlam nötrofil göçünü, uzamış nötrofil hayatta bir arada çıkıyor. Benzer süreçler ortopedik implant S. nötrofil infiltrasyonu katkıda olasıdır Aureus enfeksiyon modeli. Bilinmese de nötrofil sinyalleri Orthop azaldı nedenaedic enfeksiyon modeli, bu enfeksiyonu kronik enfeksiyona akut ilerledikçe ve bu gelecekte soruşturma konusu olarak bağışıklık tepkisi zamanla değişmiş olması olabilir.
Ortopedik protez eklem enfeksiyonu bu fare modeli ve not edilmelidir in vivo modaliteli görüntüleme ile sınırlamaları vardır. Birincisi, bu fare modeli insanlarda 24 ortopedik cerrahide kullanılan gerçek süreçleri ve malzemelerin bir basitleştirme olduğunu. Bununla birlikte, bu model insan ortopedik implant enfeksiyonlarının 8,9 görülür kemik ve eklem dokusunda kronik enfeksiyonu ve ardından gelen iltihabı özetlemek yapar. Buna ek olarak, uCT görüntüler elde etmek için, X-ışını ışınlama nispeten düşük doz enfeksiyonun seyri sırasında hayvanların sağlığına olumsuz etkileri en aza indirmek için kullanılmıştır. UCT görüntüleme için kullanılabilecek kemik iyi çözünürlük, X-ışını radyasyon yüksek dozlar ötenazi birnimals. Bununla birlikte, bu, invaziv olmayan ve boylamasına deney süresi boyunca kemik değişiklikleri izleme kabiliyeti ortadan kaldıracaktır.
Sonuç olarak, anatomik uCT görüntüleme ile canlıda bütün hayvan optik görüntüleme kombinasyonunu içeren multimodalite görüntüleme enfeksiyon ve inflamatuvar yanıt hakkında daha kapsamlı bilgi izin vermiştir. Buna ek olarak, bu teknikler, kemik ve eklem doku üzerindeki enfeksiyon ve iltihaplanma sonucu değerlendirmeyi mümkün hale gelmiştir. Biz 14-18 araştırmaya başlamışlardır olarak gelecekteki çalışma antimikrobiyal tedavilerin, bağışıklık tepkilerinin, hastalığın patogenezi ve kemik reaktif değişikliklerin etkinliğini değerlendirmek için multimodalite görüntüleme yararlanabilir. Daha önce, bir hayvan modelinde uyluk enfeksiyon, endokardit, akciğer Infect Buna ek olarak, çok modelli görüntüleme bir enfeksiyon varlığını teşhis etmek için sondalar ve izleyiciler değerlendirmek olabiliriyonları ve biyomalzeme enfeksiyonlar 25-28. Son olarak, multimodalite görüntülemenin kullanımı gibi iskelet kanser, metastatik hastalık, kırıkların ve artrit 5-7 gibi, bu impact diğer koşulları kas-iskelet sistemini araştırmak için bulaşıcı hastalıkların ötesinde genişledi ve ortopedi, romatoloji ve onkoloji gibi disiplinlerden genelinde kullanılan olabilir .
Disclosures
REÇEL, BNT, EL, NZ, KPF Xen29 biyolüminesens S. sağlanan, görüntüleme cihazları üretmektedir Perkin Elmer, çalışanları ödenir aureus suşu, ve bu video-makale yayın masrafları için ödenen. Kalan Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma (JAN) bir H & H Lee Cerrahi Resident Araştırma Scholars Program tarafından desteklenen bir AO Vakfı Start-Up hibe S-12-03M (LSM) ve (LSM) Sağlık hibe R01-AI078910 bir National Institutes .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain | PerkinElmer | Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient | |
| Tryptic soy broth | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 211825 | |
| Bacto Soy Agar | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 214010 | |
| LysEGFP knockin mouse strain | Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene | ||
| Betadine | Purdue Products, Stamford, CT | ||
| Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter) | Synthes, West Chester, PA | 492.08 | |
| Wire Cutter - Duracut T.C. | H&H Company, Ontario, Canada | 83-7002 | |
| Isoflurane | Baxter, Deerfield, IL | 118718 | |
| Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting) | Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International. | 95056-936 | |
| Sustained-release Buprenorphine (5 ml - 1 mg/ml) | Zoopharm, Windsor, CO | analgesic | |
| IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | optical in vivo imaging system | |
| Quantum FX in vivo µCT system | PerkinElmer, Hopkinton, MA | µCT in vivo imaging system | |
| IVIS SpectrumCT Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | combined optical and µCT in vivo imaging system | |
| Living Image Software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Image analysis software for in vivo optical imaging |
References
- Dothager, R. S., et al. Advances in bioluminescence imaging of live animal models. Curr Opin Biotechnol. 20, 45-53 (2009).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging progress and applications. Trends Biotechnol. 29, 624-633 (2011).
- Luker, G. D., Luker, K. E. Optical imaging current applications and future directions. J Nucl Med. 49, 1-4 (2008).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23, 313-320 (2005).
- Reumann, M. K., Weiser, M. C., Mayer-Kuckuk, P. Musculoskeletal molecular imaging a comprehensive overview. Trends Biotechnol. 28, 93-101 (2010).
- Snoeks, T. J., Khmelinskii, A., Lelieveldt, B. P., Kaijzel, E. L., Lowik, C. W. Optical advances in skeletal imaging applied to bone metastases. Bone. 48, 106-114 (2011).
- Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
- Del Pozo, J. L., Patel, R. Clinical practice. Infection associated with prosthetic joints. N Engl J Med. 361, 787-794 (2009).
- Parvizi, J., Adeli, B., Zmistowski, B., Restrepo, C., Greenwald, A. S. Management of periprosthetic joint infection the current knowledge AAOS exhibit selection. J Bone Joint Surg Am. 94, e104 (2012).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Speziale, P., Montanaro, L., Costerton, J. W. Biofilm formation in Staphylococcus implant infections. A review of molecular mechanisms and implications for biofilm-resistant materials. Biomaterials. 33, 5967-5982 (2012).
- Zimmerli, W., Moser, C. Pathogenesis and treatment concepts of orthopaedic biofilm infections. FEMS Immunol Med Microbiol. 65, 158-168 (2012).
- Cram, P., et al. Total knee arthroplasty volume utilization and outcomes among Medicare beneficiaries 1991-2010. JAMA. 308, 1227-1236 (2012).
- Wolf, B. R., Lu, X., Li, Y., Callaghan, J. J., Cram, P. Adverse outcomes in hip arthroplasty long-term trends. J Bone Joint Surg Am. 94, (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5, (2010).
- Bernthal, N. M., et al. Protective role of IL-1beta against post-arthroplasty Staphylococcus aureus infection. J Orthop Res. 29, DOI. 1621-1626 (2011).
- Niska, J. A., et al. Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and µCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice. PLoS ONE. 7, e47397 (2012).
- Niska, J. A., et al. Daptomycin and tigecycline have broader effective dose ranges than vancomycin as prophylaxis against a Staphylococcus aureus surgical implant infection in mice. Antimicrob Agents Chemother. 56, 2590-2597 (2012).
- Niska, J. A., et al. Vancomycin-Rifampin Combination Therapy has Enhanced Efficacy Against an Experimental Staphylococcus aureus Prosthetic Joint Infection. Antimicrob Agents Chemother. 57, 5080-5086 (2013).
- Pribaz, J. R., et al. Mouse model of chronic post-arthroplasty infection noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study. J Orthop Res. 30, 335-340 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Direct continuous method for monitoring biofilm infection in a mouse model. Infect Immun. 71, 882-890 (2003).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007 (2007).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117, 3343-3352 (2011).
- Deirmengian, C. A., Lonner, J. H. What's new in adult reconstructive knee surgery. J Bone Joint Surg Am. 94, 182-188 (2012).
- Ning, X., et al. Maltodextrin-based imaging probes detect bacteria in vivo with high sensitivity and specificity. Nat Mater. 10, 602-607 (2011).
- Panizzi, P., et al. In vivo detection of Staphylococcus aureus endocarditis by targeting pathogen-specific prothrombin activation. Nat Med. 17, 1142-1146 (2011).
- van Oosten, M., et al. Realtime in vivo imaging of invasive and biomaterial associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nat Commun. 4, 2584 (2013).
- Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous beta lactamase reporter enzyme fluorescence in live mice. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 12239-12244 (2010).
