Summary
שלפוחית תאית לשחק תפקידים חשובים בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים, כוללים קרישה, תגובות חיסוניות, וסרטן או סוכנים טיפוליים פוטנציאליים כמו במשלוח סמים או רפואת רגנרטיבית. פרוטוקול זה מציג שיטות לאפיון כימות וגודל של שלפוחית תאית מבודדת ולא מבודדת בנוזלים שונים תוך שימוש בחישת דופק resistive מתכונן.
Abstract
שלפוחית תאית (EVS), הכוללים 'microvesicles' ו 'exosomes', נמצא בשפע רב בנוזלי גוף. בשנים האחרונות חלו גידול עצום בעניין בכלי רכב חשמלי. כלי רכב חשמליים הוכחו לשחק תפקידים חשובים בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים שונים, כוללים קרישה, תגובות חיסוניות, וסרטן. בנוסף, כלי רכב חשמליים יש פוטנציאל כסוכנים טיפוליים, למשל ככלי רכב משלוח סמים או כרפואת רגנרטיבית. בגלל הגודל הקטן שלהם (50 ל1,000 ננומטר) כימות מדויק ואפיון גודל של כלי רכב חשמלי הוא מאתגר מבחינה טכנית.
פרוטוקול זה מתאר טכנולוגיה איך מתכונן חישת דופק התנגדות (tRPS), שימוש במערכת qNano, ניתן להשתמש בם כדי לקבוע את הריכוז וגודל של כלי רכב חשמליים. השיטה, הנשענת על זיהוי של כלי רכב חשמליים עם ההעברה שלהם דרך נקבובית בגודל ננו, היא מהירה יחסית, די בשימוש באמצעי אחסון מדגם קטן ואינה דורשת PURification וריכוז של כלי רכב חשמליים. הדגימות הבאה לפרוטוקול פעולה הרגיל גישה חלופית היא באמצעות תיארה ממוסמרות עם חרוזי פוליסטירן בגודל ידוע וריכוז. בזמן אמת זה טכניקת כיול יכול לשמש כדי להתגבר על מכשולים טכניים נתקל במדידת כלי רכב חשמלי באופן ישיר בנוזלים ביולוגיים.
Introduction
שלפוחית ממוצא סלולארי הן נרחבת ביותר בנוזלי גוף 1. שלפוחית אלה שנקראים תאי (EVS) (50 - 1,000 ננומטר בגודל) נוצרות על ידי שני ההיתוך של גופים רב לפוחי עם קרום התא או על ידי ניצנים החוצה ישירים של קרום התא. בשנים האחרונות, עניין מדעי בכלי רכב החשמלי גדל מאוד, וכתוצאה מכך שפע של פרסומים ממוקדים EV, שבו פונקציות ומאפיינים של כלי רכב חשמליים חדשות מתוארים 1. כלי רכב חשמליים נמצאים כעת האמינו להיות מעורב במגוון רחב של תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים כגון העברת אותות, רגולציה חיסונית, וקרישת דם 1-4. בסרטן, כלי רכב חשמליים נראים לשחק תפקיד בהיווצרות של נישות premetastatic 5,6, העברת פרו סרטני תוכן 7,8 וגירוי של אנגיוגנזה 8. חוץ מזה, כלי רכב חשמליים נחקרים כסוכני משלוח של סוכנים טיפוליים 9.
למרות דה אלהvelopments, כימות אמין של כלי רכב חשמלי נותר מאתגר. באופן מסורתי, שיטות כימות עקיפות משמשות, אשר מסתמכות על כימות של תכולת חלבון כוללת או חלבונים ספציפיים. למרות שימוש נרחב, הטכניקות הללו אינן מסבירות הבדלי חלבון לכל EV, ואינה מבחינות בין זיהום אגרגטים חלבון וחלבונים בכלי רכב חשמלי. יתר על כן, טכניקות אלה דורשות בידוד של כלי רכב חשמליים, אשר במקרים רבים הופך את ההשוואה של ריכוזי EV בדגימות ביולוגיות בלתי אפשרית.
לכן, מאמצים נעשים כדי לפתח שיטות חדשניות המאפשרות לEV יותר המדויק וישיר מדידה 10. דו"ח זה מתאר את השימוש בחישה מתכונן דופק התנגדות (tRPS) לכימות אמין ואפיון גודל של כלי רכב חשמליים.
נכון לעכשיו, qNano מכשיר (איור 1 א) היא הפלטפורמה היחידה זמינה מסחרי עבור tRPS. בtRPS, קרום אלסטי שאינו מוליך מנוקד wiה נקבובית בגודל ננו הוא מפריד בין שני תאי נוזל. אחד מתאי נוזל מלא במדגם של עניין, ואילו התאים האחרים מלאים באלקטרוליט ללא חלקיקים. באמצעות הפעלת זרם, זרימה / זרם חשמלי יוני היא הוקם, אשר שינתה עם העברת החלקיקים דרך הנקבובית (איור 1b). סדר הגודל של מצור הנוכחי ("דופק התנגדות") הוא פרופורציונאלי להיקף 11 (איור 1 ג) החלקיקים. משך המצור ניתן להשתמש כדי להעריך את zeta-הפוטנציאל של חלקיקים, אשר מסתמך על מאפייני חלקיקים כגון תשלום או לעצב 12. פרופיל גודל של חלקיקים ידועים יכול להתבצע על ידי השוואת פולסים ההתנגדות נגרמים על ידי חלקיקים לא ידועים עם פולסים ההתנגדות נגרמים על ידי חלקיקי כיול בקוטר ידוע. חוץ מזה סדר הגודל של אירוע מצור, ששיעורה אלה מתרחשים נמדד. רלי קצב ספירה זוes בריכוז החלקיקים. מאז הריכוז ושיעור החסימות הם באופן ליניארי יחסיים 13, באמצעות מדגם כיול יחיד עם חלקיקים של ריכוז ידוע וגודל חלקיקים מאפשר למדידת הריכוז 14 והתפלגות גודל 11 של מדגם לא ידוע.
התנועה של חלקיקים דרך nanopore נקבעה על ידי אלקטרו kinetic- כוחות (electrophoretic ואלקטרו האוסמוטי) וfluidic 15. על ידי שימוש במודול הלחץ משתנה (VPM) הבדל בלחץ בין תאי הנוזל יכול להיגרם ככוח נוסף. הפעלת לחץ חיובי מגדילה את קצב הזרימה של חלקיקים, אשר עשוי להועיל כאשר ריכוז החלקיקים הוא נמוך. כמו כן, יכול להיות מיושם בלחץ כדי להפחית את ההשפעה של כוחות אלקטרו קינטית. זה חשוב במיוחד בעת השימוש בnanopores עם נקבוביות בקוטר קטן יחסית (NP100, NP150 ואולי NP200) לעתים קרובות משמש לזיהוי של כלי רכב חשמלי.לnanopores אלה, גם כאשר הפעלת לחץ משמעותי, כוחות אלקטרו הקינטית יכולים, בהתאם למטען משטח חלקיקים, להישאר nonnegligible 16. על ידי מדידת שיעור החלקיקים בלחצים מרובים, אלקטרו kinetically מתוקן, ולכן יותר מדויק, ניתן לחשב ריכוז EV.
הנה, פרוטוקולים מפורטים מסופקים כדי לקבוע את התפלגות הגודל וריכוז של כלי רכב חשמליים. בסמוך לפרוטוקול הפעולה הרגיל, גישה חלופית מתוארת בי דגימות ממוסמרות עם חרוזי פוליסטירן בגודל ידוע וריכוז 17. טכניקת כיול בזמן אמת זה יכול לשמש כדי להתגבר על כמה מהאתגרים הטכניים נתקלו במדידת כלי רכב חשמלי באופן ישיר בנוזלים ביולוגיים, דוגמת שתן, פלזמה וsupernatant תרבית תאים, או כאשר יציבות של nanopore על פני תקופה של זמן מדידה ארוכה לא יכולה להיות הבטיח.
Protocol
.1 Standard Operating פרוטוקול
1.1 התקנת מכשיר והכנת דוגמאות
- חבר את המכשיר למחשב עם תוכנת Izon בקרת Suite המותקנת.
- בחר את גודל nanopore לשימוש: לגודל וריכוז מדידה של כלי רכב חשמליים NP150 (גודל טווח יעד 85-300 ננומטר) או NP200 (גודל טווח יעד 100-400 ננומטר) משמש לרוב. כאשר עובדים עם כלי רכב חשמליים שהיה מבודדים באמצעות פרוטוקול שכלל הסרה של כלי רכב חשמליים גדולים יותר, למשל על ידי העברת הדגימה דרך פילטר 220 ננומטר, נקבובית NP100 (גודל טווח יעד 70-200 ננומטר) ניתן להשתמש. כאשר עובדים עם כלי רכב חשמליים במדגם ביולוגי או כלי רכב חשמליים המבודדים באמצעות פרוטוקול שונה, ניתן להשתמש NP200, כפי שהוא מתאבן בתדירות נמוכה יותר. nanopores אחר כגון NP300 (יעד גודל 150-600 ננומטר) או NP400 (גודל טווח היעד 200-800 ננומטר), או nanopores הגדול עוד יותר, ניתן להשתמש בם לסוגים רבים יותר של כלי רכב חשמליים.
- בחר calibr הקלקרחלקיקי ation המשלימים את nanopore בחר בשלב 1.1.2. לNP100, NP150 וnanopore NP200 להשתמש CPC100, חלקיקי CP100 וCPC200, בהתאמה. להערכת גודל מדויקת, לוודא שיש לי חלקיקי כיול גודל דומה כחלקיקים ידועים.
- כדי להבטיח אחידות של חלקיקי הכיול, בקצרה מערבולת (30 שניות). לחלופין, להחיל sonication כדי להסיר אגרגטים.
- לדלל את חלקיקי הכיול בPBS לריכוז היעד בהיקף של לפחות 40 μl. הערה: ריכוז היעד משתנה בהתאם לnanopore בחר בשלב 1.1.2. ריכוזי יעד מסופקים עם nanopores.
- החל וישירות להסיר 78 μl של PBS על תא הנוזל נמוך יותר; הרטבה זו של התא נמוך יותר נוזל מפחיתה את הסיכון להיווצרות בועת האוויר מתחת לnanopore בעת החלת אלקטרוליט לתא הנוזל נמוך יותר כאשר nanopore הוא בעמדה.
- הנח את nanopore על 4 זרועותיו של המכשיר. שימושמחוגה הדיגיטלית כדי למדוד את המרחק בין שתי זרועות הפוכות ולהזין את המרחק במ"מ בשדה הקלט "למתוח" ולחץ על "לכייל מתיחה" כדי לכייל את מתיחת nanopore.
- למתוח את nanopore ל47 מ"מ, על ידי סיבוב גלגל הצד ובכך להגדיל את המרחק בין זרועות היריבה של המכשיר, לפני שתגיש בקשת 78 μl PBS לתא הנוזל נמוך יותר.
הערה: הפרעות חשמליים יכולות באופן משמעותי להשפיע על האיכות של מדידות. בעת השימוש במחשב נייד כדי להפעיל את תוכנת Izon בקרת Suite, לוודא את המחשב הנייד מחובר לרשת החשמל באמצעות שקע ותקע מוארקים. טלפונים ניידים כל הזמן קרוב למכשיר גם יכול להיות מקור להפרעה חשמלית. הפרעות חשמליות הוא ציין כמו פסגות חוזרות ונשנות ללא הרף בתחילת המחקר הנוכחי, לעתים קרובות עם שורש ממוצע רבוע (RMS) רעש> 10 הרשות הפלסטינית.
הערה: כמעט כל חיץ ניתן להשתמש כדי לדלל חלקיקי כיול וכלי רכב חשמליים לcharacteri tRPSzation. נוכחותם של מלחים היא תנאי הכרחי להקמתה של זרם חשמלי. למדידות EV להשתמש PBS כחיץ. חלקיקי כיול תמיד צריכים להיות מדוללים באותו החיץ ככלי הרכב החשמלי על מנת להבטיח מדידות מדויקות.
1.2. לקבוע את הגדרות אופטימליות למדידה
הערה: לפני ההקלטה, חשוב לקביעת הגדרות מדידה אופטימליות. גודל המצור הנגרם על ידי חלקיקים עוברים דרך nanopore תלוי במתיחה שיושמה והמתח מיושם. למדידות אמינות רעש RMS צריך להיות <10 הרשות הפלסטינית ואת גודל מצור המצב צריכה להיות> 0.1 Na.
- הנח את תא הנוזל העליון וכלוב מגן על nanopore ולהציג 40 μl של חלקיקי כיול בדילול מלאים בתא העליון הנוזל. השתמש בVPM להפעיל לחץ חיובי kPa ≥0.8.
- להפחית את המתיחה מיושמת באיטיות לכיוון 44 מ"מ תוך ניתוח אירועי המצור שנגרמו על ידי הכיולחלקיקים. הערה: כאשר צמצום הקוטר הנקבובית התנועה של חלקיקים דרך nanopore יהיה פחות ובכך שיעור החלקיקים יקטן. עם זאת, בשל מצור יחסי מוגבר של נקבובית אירוע מצור גדול יתרחש וכתוצאה מכך יחס אות לרעש משופר. הגדלת המתח עשויה להגביר עוד יותר את גודל המצור אלא גם יכול להגדיל את רעש RMS.
- להפחית את המתיחה עד אירועים מתאימים מצור (איור 1 ג) הם נצפו בפנל "האיתותים Trace". (> 0.1 Na המצב) ושיעור החלקיקים המקביל הוא> 100 / דקה. הערה: שיעור החלקיקים הוא חתך פחות קפדן, אולם כמדידות של לפחות 500 חלקיקים הן אידיאליים, שיעורי חלקיקים של <100 / min יגרמו הקלטת משכי זמן של לפחות 5 דקות. שיעורי חלקיקים גבוהים יותר מאשר 2,000 / דקה יכולים לגרום למדידות פחות מדויקות (אם קיימים, דילול מדגם צריכה להתבצע).
1.3 מדידת הכיולחלקיקים, כביסה של תא נוזל uper ומדידה לדוגמא
- בכלי רכב חשמליים סעיף זה מsupernatant תרבית תאים של הקו הסלולרי U87-MG / EGFRvIII multiforme גליובלסטומה מאופיין. הבידוד וההכנה של כלי רכב חשמליים אלה בעבר תיארו ומדמיינים 18.
- מניחים את חלקיקי הכיול בתא העליון הנוזל. החל לחץ (למשל 0.8 kPa) באמצעות VPM ושיא> 500 חלקיקים.
- אם ביצוע מדידה רב בלחץ, להגביר את הלחץ המופעל (לדוגמא ל1.0 kPa) ולהקליט קובץ כיול שני. הערה: מינימום של 0.2 הבדל kPa נדרש.
- הסר את מדגם הכיול מהתא העליון הנוזל. שטוף את התא העליון נוזל 3 פעמים עם 100 μl PBS להסיר חלקיקים שיורית. לפני כניסתה של הדגימה לתוך התא העליון הנוזל, להשתמש רקמה נטולת מוך כדי להסיר כל PBS שנותר בתא העליון הנוזל.
- להציג את המדגם לתא העליון הנוזל. ודא הנוכחי הבסיסית הוא בתוך 3% מהזרם הבסיסי שנצפה בעת מדידת חלקיקי הכיול. אם לא בתוך 3%, ליישם את האסטרטגיה שתתואר להלן על מנת לייצב את הזרם בנקודת ההתחלה. החל הלחצים המדויקים כפי שהוחל על חלקיקי הכיול ולהקליט קבצי הדוגמא.
הערה: עלילת שיעור החלקיקים צריכה להציג גילוי מתמיד של חלקיקים (איור 2 א). במקרה של הפסקה הפתאומית של גילוי חלקיקים, ירידה פתאומית בתחילת מחקר הנוכחית, או עלייה פתאומית ברעש RMS, הנקבובית עלולים להיות סתום; וכך, להשהות את ההקלטה. על מנת לשחזר את נקודת ההתחלה, ברז או מסובבים את מכסה המיגון, להחיל את הבוכנה, או להסיר לחלוטין nanopore ולשטוף אותו עם מים ללא יונים ולהחליף אותו במכשיר.
הערה: לחלופין, להגדיל את מתיחת nanopore ל47 מ"מ בשילוב עם לחץ מקסימאלי מVPM למשך כ 5 דקות.
ניתוח 1.4 נתונים
- לחץ על "; לנתח כרטיסיית נתונים "כדי להיכנס לסעיף הניתוח של התוכנה. לעבד את קבצי מדגם הכיול ועל ידי לחיצה ימנית ובחירה באפשרות "לא מעובד קבצים" "תהליך הקבצים".
- לחץ על תיבת הסימון לצד המדגם בטור "המכויל" לזוג קבצי דוגמא להקלטות הכיול. בחר קבצי דוגמא וכיול המתאימים ולחץ על "אישור". הערה: כאשר משתמשים באפשרות הכיול רב לחץ בחר בכרטיסייה "כיול Multi-לחץ" בצד השמאל לכמה דגימות מרובות לקבצי כיול מרובים.
- ברגע שהצלחה בשילוב, תוכנת Izon הבקרה לחתן תציג מאפייני מדגם שונים כגון גודל הפצה (איור 2b), משכי זמן תחילת המחקר, מחצית מרבי רוחב מלא (FWHM) וניתוח ריכוז. לחלופין: לכל דגימה, ניתן לייצא נקודות נתונים בודדות כמופרדים בפסיקים קובץ.
.2lternative פרוטוקול - להזליף דוגמאות עם חרוזים כיול
הערה: באופן כללי, נוהל העבודה הרגיל יכול לשמש בעת עבודה עם כלי רכב חשמליים מבודדים. כאשר עובד עם כלי רכב חשמליים שאינם מבודדים בדגימות ביולוגיות, או תכשירי EV מבודדים מזוהמים באגרגטים חלבון גדולים, הפעלת המכשיר יכולה להיות מאתגרת. אתגרים אלה כוללים בעיקר שיעור גבוה של חסימת nanopore (ירידה פתאומית בתחילת מחקר הנוכחית), חוסר היכולת לשחזר את הזרמים בסיסיים בתוך 3% מכיול מכשיר מדידה או הבדלים משמעותיים בשיעורי חלקיקים בין דגימות זהות (איור 3 א). לקבלת דוגמיות מוצגות קשיים אלה פרוטוקול חלופי לכמת כלי רכב חשמליים פותח 17. מתודולוגיה זו מסתמכת על החדרת חרוזים כיול קלקר גדולים יותר לתוך המדגם של עניין (איור 3 ב). נוהל מפורט לפרוטוקול חלופה זו נדון בהמשך.
2.1. לדוגמאהכנה
הערה: בעת הכנת דגימות באמצעות השיטה החלופית, זה רצוי להקים יחס EV-to-חרוז של כ .1 כמו כן, הוא חיוני כדי לכלול 'חרוז כיול רק "מדגם, כדי לאפשר לgating' מדויק של חרוזים וכיול כדי לקבוע את מספר חלקיקי רקע (לדוגמא אגרגטים חלבון) שבמאגר.
- של supernatant תרבית תאי צנטריפוגה 100 μl ל7 דקות ב XG 300
- הוסף 20 μl של supernatant ל20 μl של PBS ו10 μl של 75 פעמים בדילול 335 חרוזי פוליסטירן ננומטר (7e10 / מ"ל מלאי).
2.2. מדידת מדגם
- השתמש באסטרטגיה שתוארה בסעיף 1.2 כדי לקבוע את הגדרות מכשיר אופטימליות.
- מדוד את 'חרוז הכיול רק "מדגם ראשון. ודא שזיהוי הרקע של חלקיקים שאינם חרוז קטנים הוא נמוך ככל האפשר (<10% מהחרוזים).
- למדוד כל sa הבודדmple פעם אחת לפני ההקלטה משכפל כדי להפיץ תנודות בתנאי nanopore אופן שווה על פני המדגמים השונים. למדוד לפחות 3 חזרות של כל דגימה.
- למדוד מחדש את 'חרוז הכיול רק "מדגם לאחר שסיים את ההקלטה של כל הדגימות.
2.3. ניתוח נתונים
הערה: כאשר משתמשים בפרוטוקול החלופי, השימוש בלעדי של תוכנת Izon הבקרה לחתן לא יספיק לחישוב ריכוז. תוכנת גיליון אלקטרוני נוסף נדרשת. טבלת 1 מצביעה על דוגמא של חישוב הריכוז של הדגימות מתוארות באיור 3.
- פתח את 'חרוז הכיול רק "דוגמא וקבצי דגימה אחת או יותר.
- לקבוע איזה מצור אירוע גודל (בNa) יכול לשמש כחתך להבחנה בין כלי רכב חשמליים וחרוזים קלקר. קביעת שווי המצור (Na) המקביל לבסיס השמאלי של אוכלוסיית חרוזי פוליסטירן (
- אחזר את הערכים בסך הכל ספירת חלקיקים לכל דגימה על ידי לחיצה על כרטיסיית "סיכום החלקיקים ניתוח" של המדגם.
- סנן את ערכות נתונים באמצעות רמת החתך שנקבעה בשלב 2.3.2. על ידי בחירה "נתונים הסינון" מוקפץ. תצוגת חלקיקים קטנה יותר מהחתך בלבד.
- אחזר את הערכים של ספירת הערך הגלום לכל דגימה מ" סיכום החלקיקים ניתוח ".
- הפחת את כמות כלי הרכב חשמלית מהחלקיקים הכולל כדי לקבוע את הכמות של חרוזים כיול.
- לקבוע את יחס EV-to-חרוז על ידי חלוקת ספירת EV על ידי ספירת חרוז כיול.
- לקבוע את יחס רקע הממוצע על ידי חישוב ממוצע היחסים שנקבעו לכל &# 8220; חרוז רק "מדגם כיול. לחסר ערך זה מכל מדגם בודד.
- הכפל את יחס EV-to-חרוז המותאם על ידי הריכוז של חרוזים כיול כדי לקבוע את הריכוז של כלי רכב חשמליים לכל דגימה.
- הכפל את הריכוז שנמצא בשלב 2.3.9 על ידי הגורם לדילול EV הוצג על ידי התוספת של חרוזים כיול למדגם EV. הערה: בהתקנת דוגמא המדגם, הדילול הכולל של מדגם בPBS וחרוזים כיול הוא 2.5 פעמים ובכך הריכוז שנמצא בשלב 2.3.9 יש להכפיל 2.5 כדי לקבוע את ריכוז מדגם EV הגלם.
- לחשב נתונים סטטיסטיים כגון ממוצעים, סטיית תקן ושגיאת תקן של הממוצע לכל קבוצה של משכפל.
הערה: בחלק מהמקרים חפיפה בין כלי רכב חשמליים וחרוזי פוליסטירן ממוסמר הוא ציין. אם נדרש תיקון להערכה הנמוכה מדי של ריכוז EV, דגימות ללא חרוזי פוליסטירן ממוסמר, יש לבצע מדידה. השתמש באותו חותךאת, כפי שנקבע בשלב 2.3.2 כדי לקבוע יחס "חרוז ל-EV", כדי לחשב את היחס של כלי רכב חשמליים שנמצאים בטווח של חרוזי פוליסטירן ממוסמר. יחס חרוז ל-EV זה יש להוסיף ליחס EV-to-חרוז קבע בשלב 2.3.8.
2.4. אופציונאלי: הפצת גודל EV שימוש בשיטה האלטרנטיבית.
- פתח הקלטת מדגם פעמיים בבקרת חבילת התוכנה.
- הגדר את אפשרויות הסינון של אחת מהדגימות לחלקיקי תצוגה בלבד גדולים יותר מהחתך שנקבע לעיל. זה יציג את חלקיקי כיול בלבד.
- הגדר את המדגם המסונן ל" קובץ כיול "ולהזין את גודל המצב של חרוזים הכיול.
- זוג קובץ לדוגמה ו" קובץ הכיול "יצר בשלב 2.4.3 כפי שמתואר ב1.4.2. קובץ הדוגמא עכשיו יציג התפלגות גודל של שני כלי רכב חשמליים וחרוזים כיול המבוסס על חרוזים כיול ממוסמר.
הערה: האופרה סטנדרטיתפרוטוקול טינג לרוב יספיק לקביעת גודל הפצות של כלי רכב חשמליים. לפעמים לעומת זאת, רכיבי חיץ מדויקים אינם ידועים (למשל בפלזמה או בשתן) מה שהופך את זה אי אפשר להכין מדגם של חרוזים כיול באותו החיץ ככלי הרכב החשמלי של עניין. מדגם EV הממוסמר עם חלקיקי כיול יכול לשמש לגודל הערכת ערך הגלום בתנאים ספציפיים האלה.
Representative Results
כדי להשתמש במכשיר tRPS, nanopore אינו מוליך צריך להיות ממוקם על 4 זרועות של המכונה (איור 1 א) ומתח (איור 1b) יש ליישם. ברגע נוכחי בסיס חשמלי שהוקמה, קטניות התנגדות נגרמות על ידי חלקיקים עוברים דרך הנקבובית תזוהה כפי שמודגמות באיור 1 ג.
כלי רכב החשמליים היו מטוהרים מן supernatant תרבית תאים של U87-MG / EGFRvIII שורת תאי גליובלסטומה ידי ultracentrifugation. שיעור עלילת חלקיקים יציב הוא ציין בעת מדידת כלי הרכב החשמלי המבודדים (איור 2 א) על nanopore NP100. שיעור עלילת חלקיקים יציב זה נדרש למדידת ריכוז EV אמינה. לאחר התאמת הקלטת EV-המדגם להקלטה של חרוזים 115 ננומטר כיול קלקר, התפלגות גודל (איור 2b) ואומדן ריכוז של EV-המדגם ניתן להשיג (מידע לא מוצג).
=> כלי רכב חשמליים "jove_content" גם היו לכמת באופן ישיר בsupernatant תרבית תאי גליובלסטומה. כאשר מודדים כלי רכב חשמליים בדגימות ביולוגיות, סתימת nanopore לעתים קרובות תוצאות הפרעות ו / או תנודות בחלקות שיעור חלקיקים (3 א Figrue). התוצאה היא הערכות ריכוז EV לא מדויקות. על ידי מחבלים במדגם עם חרוזי פוליסטירן של ריכוז וגודל ידועים, ניתן לקבוע יחס EV-to-חרוז. איור 3 ממחיש את התוצאות שהתקבלו לאחר spiking supernatant תרבית תאים עם חרוזי פוליסטירן של 335 ננומטר בגודל. שתי אוכלוסיות ברורות הם נצפו. חלקיקי גרימת מצור של פחות מ 0.46 Na הם כלי רכב חשמליים נחושים, החלקיקים הגדולים יותר נקבעים חרוזי פוליסטירן. היחס של כלי רכב חשמליים לחרוזי פוליסטירן משמש לחישוב ריכוז הגלם של כלי רכב חשמליים (טבלה 1). איור 3 ג ממחיש את הערכת הגודל של שתי האוכלוסיות המבוססות על חרוזי פוליסטירן ממוסמר. מחדש התקנת nanopore משמשsulted בזיהוי של כלי הרכב החשמלי> 140 ננומטר בגודל. זה יכול להיות הוריד על ידי הקטנת פתיחת nanopore, אולם זה יהיה גם לגרום לאירועי סתימה יותר.
איור 1: מכשיר qNano ובדרך הפעולה. צילום () של המכשיר. Nanopore ממוקם על המכשיר, הפרדת תא נוזל נמוך יותר מתא עליון נוזל. תאי הנוזל מוגנים מפני הפרעות חשמליות סביבתיות על ידי כובע המיגון. איור (ב) מתווים חישה מתכונן דופק התנגדות (tRPS). Nanopore אלסטי שאינו מוליך הוא מפריד בין שני תאי נוזל. באמצעות הפעלת זרם זרם חשמלי שהוקם הדרך הנקבובית ניקב בnanopore. כשלפוחית תאית לעבור nanopore, הזרימה יונית משתנה וזוהתה כדופק resistive. בtRPS גודל הפתיחה של nanopore יכול להיות מכוון (מופחת או מוגבר) על ידי מתיחת nanopore על ידי הגדלת המרחק בין זרועות היריבה של המכשיר, או צמצום המרחק הזה. דוגמא להמחשה של פולסים resistive (C). סדר הגודל של דופק התנגדות יחיד הוא פרופורציונאלי להיקף החלקיק:. קטניות גדולות יותר מצביעות על חלקיקים גדולים יותר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: חלקיקים לספור עלילה וגודל החלוקה מתקבלת ממדידת כלי רכב חשמלי מבודדים מU87-MG / supernatant תרבית תאי EGFRvIII () חלקיקים לספור עלילה המצביעה על גילוי חלקיקים קבוע כולל.. הפחתה קצרה של particזיהוי le נצפה בין 80 ו100 שניות של הקלטה. לאחר השהיית ההקלטה והקשה על כובע המיגון, שיעור החלקיקים התייצב לאחר שההקלטה התחדשה. (ב) התפלגות הגודל של כלי רכב חשמליים מבודדים היא להתוות לאחר כיול המדגם לא ידוע (EVS) לחרוזי כיול קלקר 115 ננומטר. (5 ננומטר גודל סל). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: כימות tRPS של כלי רכב חשמליים בsupernatant תרבית תאים באמצעות הפרוטוקול החלופי. חלקות () אופייניות של חלקיקים בריבית המתקבלות במדידת כלי רכב חשמלי באופן ישיר בנוזל ביולוגי. סתימה נקבובית גורמת להפרעות ותנודות קצרות בשיעור של גילוי חלקיקים. כלעלילה מייצגת מדידה לשכפל של המדגם זהה. גרפים (ב ') בגודל הפצה שלוש לשכפל מתקבלים לאחר spiking supernatant תרבית תאים עם חרוזים כיול קלקר 335 ננומטר. כל חלקיקי גרימת דופק התנגדות של פחות מ 0.46 Na נבחרו ככלי רכב חשמליים. חרוזי פוליסטירן ממוסמר (C) ניתן להשתמש כדי להשיג גודל החלוקה של המדגם. (5 ננומטר גודל סל). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מדידה | כיול רק # 1 | כיול רק # 2 | Supernatant 1 # | Supernatant 2 # | Supernatant 3 # |
| הנוכחי ממוצע (NA) | 117 | 120 | <td> 116118 | 120 | |
| שיעור חלקיקים | 172 | 194 | 250 | 246 | 196 |
| הפסקת שימוש (NA) | 0.46 | 0.46 | 0.46 | 0.46 | 0.46 |
| סה"כ חלקיקים | 303 | 317 | 489 | 488 | 454 |
| שלפוחית תאית | 3 | 1 | 213 | 215 | 213 |
| חרוזים כיול ממוסמר | 300 | 316 | 276 | 273 | 241 |
| כלי רכב חשמליים / חרוזים כיול | 0.01 | 0.003 | 0.772 | .788 | .884 |
| לדוגמא - רקע | 0.765 | 0.781 | .877 | ||
| שלפוחית Extracelullar (10 7) / מ"ל | 7.14 | 7.29 | 8.18 | ||
| 2.5x המדגם מדולל | |||||
| כלי רכב חשמליים ריכוז גלם (10 7) / מ"ל | 17.85 | 18.22 | 20.46 |
טבלת 1:. חישוב דוגמא לריכוז EV באמצעות הפרוטוקול החלופי ערך חתך הוא נחוש בדעתו להבחין כלי רכב חשמליים מחרוזי כיול. בהמשך לכך, במספר הכולל של כלי רכב חשמליים וחרוזים יכול להאסף. לכל מדידת יחס EV-to-חרוז מחושב. הסכום של חלקיקי רקע באלקטרוליט (לדוגמא אגרגטים חלבון) מחושב על ידי מיצוע יחס EV-to-חרוז למדידות בודדות של המדגם 'חרוזים כיול רק'. עבור כל דגימת יחס הרקע יורד מהיחס שהתקבל. adjuste זהיחס ד מוכפל בריכוז של חרוזים הכיול במדגם (בדוגמא זו: 9.33e7 / מ"ל). כדי לקבוע את ריכוז הגלם של כלי רכב חשמליים, הריכוז המתקבל מוכפל בגורם לדילול כלי רכב חשמלי הכולל (בדוגמא זו: 2.5).
Discussion
הפרוטוקולים מתוארים במתודולוגיות הצעת כתב היד הזה לכימות ואפיון גודל של כלי רכב חשמליים באמצעות tRPS. יתרונותיו העיקריים של פלטפורמת tRPS הם גודל המדגם הקטן, משך מדידה קצר יחסית והיעדר המניפולציה מדגם הנדרש.
תנאי מוקדם למדידת tRPS מדויקת הוא לשמור תנאים זהים בין מדידות כיול ומדגם. זה כולל את השימוש במאגרים זהים, כמו גם הגדרות מכשיר זהות, כגון גודל nanopore, מתח ולחץ מופעל. VPM המקורי חסר מנגנון להגדרה של הלחץ המופעל מדויקת, ובכך גורם להבדלים קלים בלחץ שימושי בין דגימות. כמו כן, אידוי של נוזל תחול בVPM יכול לגרום להבדלי לחץ קטין בעת מדידה בנקודות זמן שונים וVPM ולכן צריך להיות לעתים קרובות מחדש דרוך. מגבלות אלה עלולות להיות כבר נפתרו על ידי הקדמה של VPM2, שיש קנה מידה המבוסס על לחץ ומבוסס לחץ אוויר.
הפרוטוקול החלופי שתואר בכתב היד הזה הוא מתאים במיוחד למדידה של כלי רכב חשמלי בדגימות ביולוגיות שאינם מטוהרת 17. אנו מאמינים כי רכיבי חיץ, כגון סוכרים, שומנים, חלבונים וגדולים יותר פסולת אחרות, יכול במקרים מסוימים להשפיע על תנאי המדידה יותר מדי עבור הפרוטוקול הסטנדרטי להיות ישים. תוספת של חרוזים כיול למדגם ולא השוואה בין שתי מדידות נפרדות מציגה 'כיול בזמן אמת'. שיטה זו מתאימה במיוחד כאשר משווה דגימות (למשל פלזמה של תורמי דם שונים) שיש לי תוכן רקע fluidic שונה ו / או לא ידוע. למרות שקיימים הבדלים בין כלי רכב חשמליים וחלקיקי פוליסטירן (צפיפות חלקיקים למשל ותשלום פני השטח), מודלים תיאורטיים, כמו גם נתוני ניסוי מדגיש את השימושיות של חרוזי פוליסטירן לכימות ואפיון גודל של כלי רכב חשמליים,תחת התנאי שהלחץ משמעותי מיושם 15,19. כדי למזער את השפעתם של כוחות electrokinetic, שימוש בNP150 / nanopore NP200 הגדול יחסית והלחץ חיובי משמעותי מומלץ.
כלי רכב חשמליים וחרוזים כיול נבדלים ביניהם בגודל. כתוצאה מכך, nanopore יש נפתח על ידי יישום מתיחה, לקוטר שבו גילוי של שני כלי רכב חשמליים וחלקיקי כיול הגדולים יותר הוא ציין. מאז הפתיחה הנקבובית תקטן הרגישות כלפי חלקיקים קטנים יותר, רק EVS גדול יותר מגודל מסוים נרשמים (לעתים קרובות כלי רכב חשמלי> 120 ננומטר בעת שימוש בחרוז כיול 335 ננומטר). גבול הגילוי המינימאלי לכלי רכב חשמליים יכול להיות ירידה של כ 90 ננומטר, באמצעות 203 חרוזים כיול ננומטר על nanopore NP150. עם זאת, תוכנית התקנה זו יכולה להיות unviable כאשר כלי רכב חשמליים גדולים יותר לגרום לסתימה תכופה של nanopore. הנוכחות של כלי רכב חשמליים החוסמים אלה עלולות לאלץ את הניצול של התקנה שבו אוכלוסייה של כלי רכב חשמליים, קטנה מדי למחשבהCH סף הגילוי, לא יזוהה.
הקושי לפעול עליות המערכת כאשר מנסה למדוד חלקיקים קטנים יותר מאשר בגודל 100 ננומטר. במקרים כאלה, זיהוי ניתן לשפר על ידי הגדלת ריכוז מלח של אלקטרוליט. ריכוז יון מוגבר יגרום לסדרי גודל יחסית מוגברים מצור לחלקיקים קטנים (גדול יותר יחס אות לרעש). הכדאיות של טכניקה זו למדידות של כלי רכב חשמליים צריכה להיות מאומתת אם כי, כפי שריכוזי מלח מוגברים עשויים להשפיע על עוצמת הקול של כלי רכב חשמליים.
לסיכום, פלטפורמת tRPS יכולה לשמש לכימות ישיר ואפיון גודל של כלי רכב חשמליים. מאז לא נדרש בידוד או המניפולציה EV (נוגדן תיוג מחייב או ניאון), הפלטפורמה מתאימה לכימות EV ישיר בנוזלים ביולוגיים. פרוטוקול חלופי ובלבד שיכול להיות מועיל עבור דגימות שבו רכיבי חיץ לגרום cloggin הנקבובית משמעותיאירועים גרם, מה שהופך את הניצול אמין של הפרוטוקול הסטנדרטי unviable.
Disclosures
הפיתוח של הפרוטוקול שתואר והכתיבה של כתב היד הזה כבר נתמך כלכלי, בחלקו, על ידי הקרן ההולנדית המוח, שומאכר קרמר קרן, וBohnenn קרן. הפקה של מאמר וידאו זה הייתה בsponsorted חלקית על ידי Izon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
| Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
| Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
| (Mini) vortexer | Multiple available | ||
| Lift-free tissues | Multiple available | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
| Windows based computer | |||
| Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |
References
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature reviews. Drug discovery. 12, 347-357 (2013).
- Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 24-35 (2013).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'. Seminars in immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9, 871-881 (2008).
- Bobrie, A., et al. Rab27a supports exosome-dependent and -independent mechanisms that modify the tumor microenvironment and can promote tumor progression. Cancer research. 72, 4920-4930 (2012).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nature medicine. 18, 883-891 (2012).
- Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells. Nature cell biology. 10, 619-624 (2008).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature cell biology. 10, 1470-1476 (2008).
- Dommelen, S. M., et al. Microvesicles and exosomes: opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 161, 635-644 (2012).
- Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. Innovation in detection of microparticles and exosomes. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 36-45 (2013).
- Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Analytical chemistry. 83, 3499-3506 (2011).
- Kozak, D., et al. Simultaneous size and zeta-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS. 6, 6990-6997 (2012).
- Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. Journal of physics. Condensed matter : an Institute of Physics journal. 22, 454116-4510 (2010).
- Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosensor. 31, 17-25 (2012).
- Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Analytical chemistry. 84, 3125-3131 (2012).
- Kozak, D., Anderson, W., Trau, M. Tuning Particle Velocity and Measurement Sensitivity by Changing Pore Sensor Dimensions. Chemistry Letters. 41, 1134-1136 (2012).
- Vrij, J., et al. Quantification of nanosized extracellular membrane vesicles with scanning ion occlusion sensing. Nanomedicine. 8, 1443-1458 (2013).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (3037), (2012).
- Yang, L., Broom, M. F., Tucker, I. G. Characterization of a nanoparticulate drug delivery system using scanning ion occlusion sensing. Pharmaceutical research. 29, 2578-2586 (2012).
