Extracellulaire vesicles spelen een belangrijke rol in fysiologische en pathologische processen, zoals coagulatie, immuunresponsen en kanker of als potentiële therapeutische middelen bij geneesmiddelafgifte of regeneratieve geneeskunde. Dit protocol geeft methoden voor de kwantificering en de grootte karakterisering van geïsoleerde en niet-geïsoleerde extracellulaire blaasjes in verschillende vloeistoffen met behulp van instelbare weerstand puls detectie.
Extracellulaire blaasjes (EV's), met inbegrip van 'microvesicles' en 'exosomen', zijn zeer overvloedig in lichaamsvloeistoffen. De afgelopen jaren is een enorme toename van de belangstelling voor EV's getuige. EV bleken belangrijke rol in verscheidene fysiologische en pathologische processen, zoals coagulatie, immuunresponsen en kanker. Bovendien EV hebben potentieel als therapeutische middelen, bijvoorbeeld als drug delivery vehicles of regeneratieve geneeskunde. Door hun kleine formaat (50 tot 1000 nm) accurate kwantificering en grootte profilering van EV's is technisch uitdagend.
Dit protocol beschrijft hoe afstembare resistieve pulse sensing (TRP) technologie, waarbij het qNano systeem kan worden gebruikt om de concentratie en de grootte van EV bepalen. De methode, die berust op de detectie van EV op de overdracht door een nano sized poriën, is relatief snel, volstaat het gebruik van kleine monstervolumes en niet de pur vereisenification en concentratie van EV's. Naast de reguliere werking protocol een alternatieve aanpak wordt beschreven met behulp van monsters verrijkt met polystyreen parels van bekende grootte en concentratie. Deze real-time calibratie kunnen worden gebruikt om technische obstakels overwinnen ondervonden bij meting EV direct in biologische vloeistoffen.
Blaasjes van cellulaire oorsprong zijn zeer overvloedig in lichaamsvloeistoffen 1. Deze zogenaamde extracellulaire blaasjes (EV's) (50 – 1000 nm groot) worden gevormd door een fusie van multi-vesiculaire lichamen met de celmembraan of door directe uiterlijke ontluiken van de celmembraan. De laatste jaren heeft wetenschappelijke belangstelling EV sterk toegenomen, wat resulteert in een overvloed aan-EV gerichte publicaties waarop nieuwe functies en eigenschappen van EV beschreven 1. EV's zijn nu geloofd te worden betrokken bij een breed scala aan fysiologische en pathologische processen zoals signaaltransductie, immuunregulatie, en bloedstolling 1-4. Bij kanker EV lijken een rol in de vorming van premetastatic niches 5,6, overdracht van pro-kanker gehalte 7,8 tot stimulatie van angiogenese 8 spelen. Daarnaast worden EVs onderzocht als levering agenten van therapeutische middelen 9.
Ondanks deze dekelingen, betrouwbare kwantificering van EVS blijft uitdagend. Traditioneel worden indirecte kwantificering methoden, die berusten op de kwantificering van totaal eiwitgehalte specifieke eiwitten. Hoewel in grote lijnen gebruikt, zijn deze technieken niet goed voor eiwit-per-EV verschillen, en geen onderscheid maken tussen vervuilende eiwit aggregaten en eiwitten in EV's. Bovendien vereisen deze technieken isolatie van EV, die in veel gevallen maakt vergelijking van EV concentraties in biologische monsters mogelijk.
Daarom zijn pogingen ondernomen om nieuwe methoden die het mogelijk maken voor meer nauwkeurige en directe meting EV 10 te ontwikkelen. Dit rapport beschrijft het gebruik van afstembare resistieve puls sensing (TRP) voor een betrouwbare kwantificering en grootte profilering van EV's.
Momenteel is de qNano instrument (figuur 1a) is de enige commercieel beschikbare platform voor TRP. In TRP, een niet-geleidend elastisch membraan doorspekt wiste een nano-sized porie is het scheiden van twee vloeistof cellen. Een van de vloeistof cellen is gevuld met het monster van belang, terwijl de andere cel is gevuld met deeltjes vrij elektrolyt. Door een spanning, wordt een ionische stroom / elektrische stroom ingesteld, dat wordt gewijzigd bij de overdracht van deeltjes door de poriën (Figuur 1b). De grootte van deze stroom blokkade (resistief pulse ") komt overeen met het volume van het deeltje 11 (figuur 1c). De duur blokkade kan worden gebruikt om de zeta-potentiaal van deeltjes, die berust op deeltjeseigenschappen zoals lading of vorm 12 bepalen. Grootte profilering van onbekende deeltjes kan worden uitgevoerd door vergelijking van de resistieve pulsen veroorzaakt door onbekende deeltjes met het resistieve pulsen door kalibratie deeltjes met een bekende diameter. Naast de omvang van een blokkade gebeurtenis, wordt de snelheid waarvan deze zich voordoen gemeten. Dit teltempo relies de deeltjesconcentratie. Aangezien de concentratie en blokkades lineair evenredig 13 met een calibratie monster met deeltjes met een bekende concentratie en deeltjesgrootte maakt het meten van de concentratie 14 en grootteverdeling 11 van een onbekend monster.
De beweging van deeltjes door de nanopore wordt bepaald door electro met kinetische (elektroforese en elektro-osmotische) en vloeibare krachten 15. Via de variabele druk module (VPM) een drukverschil tussen het fluïdum cellen worden geïnduceerd als een extra kracht. Toepassing positieve druk verhoogt de stroomsnelheid van deeltjes, die van nut kunnen zijn bij de deeltjesconcentratie laag is. Ook kan aangedrukt worden om het effect van elektro-kinetische krachten verminderen. Dit is vooral belangrijk bij het gebruik nanoporiën met een relatief kleine poriediameter (NP100, NP150 en eventueel NP200) zo vaak gebruikt voor de detectie van EV.Om deze nanoporiën, zelfs bij toepassing van aanzienlijke druk, de elektro-kinetische krachten, afhankelijk deeltjesoppervlak wordt, blijft niet te verwaarlozen 16. Door het meten van het deeltje snelheid meervoudige drukken, een elektro-kinetisch gecorrigeerd, en dus meer accuraat, kan EV concentratie berekend worden.
Hier worden gedetailleerde protocollen verschaft om de grootteverdeling en concentratie van EV bepalen. Naast de reguliere werking protocol, wordt een alternatieve aanpak beschreven waarbij monsters worden verrijkt met polystyreen parels van bekende grootte en concentratie 17. Deze real-time calibratie kan worden aangewend om bepaalde technische problemen ondervonden bij het meten EV direct in biologische vloeistoffen, zoals urine, plasma en celkweek supernatant, of wanneer de stabiliteit van de nanopore gedurende een lange meettijd kan zijn verzekerd.
De in dit manuscript aanbod methoden voor kwantificering en grootte karakterisering van EV's met behulp van TRP beschreven protocollen. De belangrijkste voordelen van de TRP platform zijn de kleine steekproef, relatief korte meettijd en het ontbreken van vereiste monstervolume manipulatie.
Voorwaarde voor nauwkeurige TRPS meting is om voorwaarden die identiek zijn tussen kalibratie en sample metingen houden. Dit omvat het gebruik van identieke buffers en identiek instrumentinstellingen, zoals nanopore grootte, spanning en toegepaste druk. De originele VPM ontbreekt een mechanisme voor de exacte instelling van de toegepaste druk, waardoor wordt veroorzaakt kleine verschillen in de toegepaste druk tussen de monsters. Ook kan verdamping van priming fluïdum in de VPM kleine drukverschillen veroorzaken bij het meten op verschillende tijdstippen en VPM derhalve dikwijls opnieuw gevuld. Deze beperkingen zijn mogelijk opgelost door invoering van de VPM2 dieheeft een klik op basis van schaalvergroting en is de luchtdruk gebaseerd.
Het alternatief protocol in dit manuscript beschreven is bijzonder geschikt voor het meten van EV in niet gezuiverde biologische monsters 17. Wij geloven dat buffer componenten, zoals suikers, lipiden, eiwitten en andere grotere brokstukken, kan in sommige gevallen beïnvloeden de meetomstandigheden te veel voor het standaardprotocol toepassing. Toevoeging van kalibratie kralen om het monster in plaats van het vergelijken van twee afzonderlijke metingen introduceert 'real time kalibrering'. Deze methode is vooral geschikt bij het vergelijken van monsters (bijvoorbeeld bloedplasma van verschillende donoren) die verschillende en / of onbekende vloeibare inhoud achtergrond hebben. Hoewel er verschillen zijn tussen de EV en polystyreen deeltjes (bijvoorbeeld deeltjes dichtheid en oppervlakte lading), theoretische modellen en experimentele gegevens onderstrepen de bruikbaarheid van polystyreen parels voor de kwantificering en de grootte profilering van EVS,onder de voorwaarde dat er aanzienlijke druk wordt uitgeoefend 15,19. Om de invloed van elektrokinetische krachten te minimaliseren, is het gebruik van de relatief grote NP150 / NP200 nanopore en significant positieve druk aangeraden.
EV's en kalibratie kralen onderscheiden zich door de grootte. Bijgevolg nanopore moet geopend worden door middel rek, een diameter waarbij detectie van EV en grotere kalibratie deeltjes waargenomen. Sinds de opening van de poriën van de gevoeligheid voor kleinere deeltjes zal afnemen, EVS alleen groter dan een bepaalde grootte worden opgenomen (vaak EV> 120 nm bij gebruik van een 335 nm kalibratie kraal). De minimum detectielimiet voor EV's kunnen worden verlaagd tot ongeveer 90 nm, met behulp van 203 nm kalibratie kralen op een NP150 nanogaatje. Echter, kan deze setup niet levensvatbaar zijn als grotere EV's veroorzaken frequente verstopping van de nanogaatje. De aanwezigheid van deze belemmeren EV kan het gebruik van een opstelling dwingen waarbij een populatie van EV, te klein om te reach de detectiegrens, niet zal worden gedetecteerd.
De moeilijkheid van het systeem toeneemt werking wanneer het proberen om deeltjes kleiner dan 100 nm te meten. In dat geval kan de detectie worden verbeterd door de zoutconcentratie van de elektrolyt. Een verhoogde ionenconcentratie relatief verhoogde blokkade magnitudes voor kleine deeltjes (grotere signaal-ruisverhouding) induceren. De haalbaarheid van deze techniek voor het meten van elektrische voertuigen moet echter worden gevalideerd, zoals verhoogde zoutconcentraties het volume van de EV's kunnen beïnvloeden.
Concluderend kan het TRP-platform worden gebruikt voor directe kwantificering en grootte karakterisering van EV's. Aangezien er geen isolatie of EV manipulatie (antilichaambindingsonderzoeken of fluorescerende labeling) is vereist, het platform is geschikt voor directe EV kwantificering in biologische vloeistoffen. Een alternatief protocol verschaft die nuttig zijn voor monsters kunnen zijn wanneer buffercomponenten induceren significante porie Clogging gebeurtenissen, waardoor betrouwbaar gebruik van het standaard protocol niet levensvatbaar.
The authors have nothing to disclose.
qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
(Mini) vortexer | Multiple available | ||
Lift-free tissues | Multiple available | ||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
Windows based computer | |||
Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |