Summary
Внеклеточные пузырьки играют важную роль в физиологических и патологических процессах, в том числе коагуляции, иммунных реакций, а также рака или в качестве потенциальных терапевтических агентов для доставки лекарств или регенеративной медицины. Этот протокол представляет методы количественного и размера характеристике изолированных и неизолированных внеклеточных пузырьков в различных жидкостей с использованием перестраиваемого зондирования резистивный импульса.
Abstract
Внеклеточные везикулы (EVS), в том числе "микровезикул» и «экзосом», весьма распространены в жидкостях организма. В последние годы наблюдается значительное увеличение интереса к электромобилей. Электромобилей, как было показано, играют важную роль в различных физиологических и патологических процессах, в том числе коагуляции, иммунных реакций и рака. Кроме того, электромобили обладают потенциалом в качестве терапевтических агентов, например, в качестве средств доставки лекарств или в качестве регенеративной медицины. Из своего небольшого размера (от 50 до 1000 нм) точную количественную и размер профилирование электромобилей технически сложным.
Этот протокол описывает, как перестраиваемый технологии резистивный импульса зондирования (TRPS), с использованием системы qNano, могут быть использованы для определения концентрации и размер электромобилей. Метод, который основан на измерении электромобилей по их передаче через размера поры нано, сравнительно быстро, достаточно использование небольших объемов образцов и не требует пурфикация и концентрация электромобилей. Следующая протоколу регулярной эксплуатации альтернативный подход описывается с помощью пробы с шипами полистирольных шариков известного размера и концентрации. Это в режиме реального времени метод калибровки может быть использован, чтобы преодолеть технические препятствия, возникающие при измерении электромобилей непосредственно в биологических жидкостях.
Introduction
Пузырьки от клеточного происхождения весьма распространены в жидкостях организма 1. Эти так называемые внеклеточные везикулы (ЕДС) (50 - 1000 нм по размеру) образованы либо слияния нескольких везикулярных тел с клеточной мембраной или путем прямого внешнего почкованием клеточной мембраны. В последние годы, научный интерес к электромобилей значительно возросло, в результате чего множеством EV-ориентированных изданий, в которых новые функции и характеристики электромобилей описаны 1. Электромобилей в настоящее время считается, участвуют в широком спектре физиологических и патологических процессов, таких как передачи сигнала, иммунной регуляции, и свертывания крови 1-4. При раке, электромобилей, кажется, играют роль в формировании premetastatic ниш 5,6, передачи про-раковой содержимому 7,8 и стимуляции ангиогенеза 8. Кроме того, электромобили рассматриваются как агенты доставки терапевтических агентов 9.
Несмотря на эти деvelopments, надежный количественное электромобилей остается сложной. Традиционно, косвенные методы количественного используются, которые полагаются по количественной оценке общего содержания белка или специфических белков. Хотя широко используется, эти методы не учитывают белок-на-EV различий, и не делают различий между загрязняющих белковые агрегаты и белки в электромобилей. Кроме того, эти методы требуют изоляции электромобилей, которые во многих случаях делает сравнение концентраций EV в биологических образцах невозможно.
Поэтому, усилия предпринимаются для разработки новых методов, которые позволяют точнее и прямой EV измерения 10. Этот доклад описывает использование перестраиваемого зондирования резистивный импульса (TRPS) для надежного количественного и размера профилирования электромобилей.
В настоящее время, qNano инструмент (Рисунок 1а) является единственным коммерчески доступным платформа для TRPS. В TRPS, не проводящий гибкая мембрана перемежается Wiй в наноразмерного поры отделяет два жидкости клетки. Одним из клеток жидкости заполнен образца интерес, в то время как другая ячейка заполнена частицами, свободной от электролита. При подаче напряжения, ионной поток / устанавливается электрический ток, который изменяется при передаче частиц через поры (фиг.1В). Величина этого тока блокады ("резистивный импульсов ') пропорциональна объему частицы 11 (рисунок 1в). Продолжительность блокада может быть использован для оценки дзета-потенциал частиц, которая опирается на характеристики частиц, таких как заряд или формировать 12. Размер профилирование неизвестных частиц может быть выполнена путем сравнения импульсов резистивных вызванные неизвестных частиц с импульсами резистивных вызванных калибровки частиц с известным диаметром. Кроме величины события блокады, ставка которого они происходят измеряется. Этот показатель количества Reliэс на концентрации частиц. Поскольку концентрация и скорость блокады линейно пропорциональна 13, с использованием одного образца калибровки с частицами известной концентрации и размера частиц дает возможность измерения концентрации 14 и 11 распределение по размерам неизвестного образца.
Движение частиц через нанопоры определяется электро-кинетический (электрофоретических и электро-осмотического) и жидкостных сил 15. С помощью модуля переменным давлением (VPM) разность давлений между жидкостью клеток могут быть вызваны в качестве дополнительной силы. Применение положительное давление увеличивает скорость потока частиц, которые могут быть полезны, когда концентрация частиц мала. Кроме того, давление может быть приложено, чтобы уменьшить эффект электро-кинетической сил. Это особенно важно при использовании нанопор с относительной малого диаметра пор (NP100, NP150 и NP200 возможно), как часто используется для обнаружения электромобилей.Для этих нанопор, даже при применении значительное давление, что электро-кинетическая силы могут, в зависимости от поверхностного заряда частиц, остаются nonnegligible 16. Путем измерения скорости частиц на нескольких давлений, электро- кинетически исправлена, и, следовательно, более точной, концентрация EV может быть вычислена.
Здесь подробные протоколы предназначены для определения распределения по размерам и концентрации электромобилей. Рядом с протоколом регулярной эксплуатации, альтернативный подход описан в котором установлены образцы подсыпали полистирольных шариков известного размера и концентрации 17. Эта методика калибровки в реальном времени могут быть использованы для преодоления некоторых технических проблем, возникающих при измерении электромобилей непосредственно в биологических жидкостей, таких как моча, плазмы и супернатанта клеточной культуры, или когда стабильность нанопор в течение длительного периода времени измерения не может быть обеспечивается.
Protocol
1 Стандартный Операционная протокол
1.1 Настройка прибора и подготовки образцов
- Подключите прибор к компьютеру с программным обеспечением Izon Control Suite установлен.
- Выберите размер нанопор использовать: для размера и концентрации измерения электромобилей NP150 (диапазон размеров целевой 85 - 300 нм) или NP200 (диапазон размеров целевой 100 - 400 нм) наиболее часто используются. При работе с электромобилей, которые были выделены с использованием протокола, который включает в себя удаление больших электромобилей, например при прохождении образца через 220 нм фильтром, NP100 пор (диапазон размеров целевой 70 - 200 нм) могут быть использованы. При работе с электромобилей в биологическом образце или электромобилей изолированных с помощью другого протокола, NP200 может использоваться, как он будет забиваться реже. Другие нанопоры, такие как NP300 (диапазон целевой размер 150 - 600 нм) или NP400 (диапазон целевой размер 200 - 800 нм), или даже более крупными нанопор, могут быть использованы для более крупных видов электромобилей.
- Выберите полистирола CalibrAtion частицы, которые дополняют нанопористых выбранный на шаге 1.1.2. Для NP100, NP150 и NP200 нанопора использовать CPC100, CP100 и CPC200 частицы, соответственно. Для точной оценки размера, убедитесь, что частицы калибровки имеют аналогичный размер, как неизвестные частицы.
- Для обеспечения однородности частиц калибровки, вихревой кратко (30 сек). При желании, применить ультразвуковую обработку для удаления агрегатов.
- Развести частицы калибровки в PBS до целевой концентрации в объеме по крайней мере, 40 мкл. Примечание: Целевая концентрация меняется в зависимости от нанопору выбранного на шаге 1.1.2. Концентрации целям поставляются с нанопор.
- Применить и непосредственно удалить 78 мкл PBS на нижней камере для текучей среды; Этот смачивание нижней камере жидкости снижает риск образования пузырьков воздуха под нанопор при применении электролит к нижней камере жидкости, когда нанопор находится в положении.
- Поместите нанопористых на 4 плеч прибора. Использованиецифровые суппорты, чтобы измерить расстояние между двумя противоположными оружия и введите расстояние в мм в поле ввода "Растягивание" и нажмите "откалибровать участок" для калибровки нанопор участок.
- Растянуть нанопористых до 47 мм, поворачивая стороны колеса и, таким образом, увеличивая расстояние между противоборствующими плеч прибора, перед повторным 78 мкл PBS в нижней камере жидкости.
Примечание: Электрические помехи могут существенно повлиять на качество измерений. При использовании ноутбука для запуска программного обеспечения Izon Control Suite, убедитесь, что ноутбук подключен к электросети с помощью заземленной розетке и вилку. Мобильные находиться рядом с прибором может быть источником электромагнитных помех. Электрические помехи наблюдается как постоянно повторяющихся пиков в базовой тока, часто с среднеквадратичной (RMS) шум> 10 Па.
Примечание: Практически любой буфер может быть использован для разбавления калибровки частиц и электромобилей для TRPS characteriзация. Наличие солей является необходимым условием для создания электрического тока. Для измерений используют EV PBS в качестве буфера. Частицы калибровки всегда следует разбавить в том же буфере как электромобили для обеспечения точности измерений.
1.2. Определить оптимальные настройки для измерения
Примечание: Перед записью, важно установить оптимальные настройки измерений. Блокада величина вызвано частицы, проходящей через нанопоры зависит от приложенного растяжения и напряжения, приложенного. Для надежных измерений RMS шум должен быть <10 Па и режим блокады величина должна быть> 0,1 нА.
- Поместите верхнюю ячейку жидкости и защитный каркас на нанопору и ввести 40 мкл разбавленных частиц калибровки в верхней камере жидкости. Используйте VPM применять ≥0.8 кПа избыточного давления.
- Уменьшите применяется протяжение медленно к 44 мм в то время как анализ блокады события, вызванные калибровкичастицы. Примечание: При уменьшении диаметра пор движение частиц через нанопоры, менее вероятно и, таким образом, скорость частиц будет уменьшаться. Тем не менее, в связи с увеличением относительной блокады поры большего размера событие блокада будет происходить в результате чего улучшается отношение сигнал-шум. Увеличение напряжения может дополнительно увеличить блокады величину, но и может увеличить RMS шум.
- Уменьшите протяжение до соответствующих событий блокады (Рисунок 1c) не наблюдается в панели "Сигнал след". (Режим> 0,1 нА) и соответствующая скорость частиц> 100 / мин. Примечание: Скорость частиц менее строгими отсечки, однако, как измерения не менее 500 частиц идеальны, ставки частиц <100 / мин вызовет записи длительностью не менее 5 минут. Скорости частиц выше, чем 2000 / мин может привести к снижению точности измерений (если он присутствует, разбавление пробы должны быть выполнены).
1.3 Измерение КалибровкаЧастицы, Промывка упер Fluid Cell и образца для измерений
- В этом разделе электромобилей от супернатанта культуры клеток клеточной линии U87-MG / EGFRvIII глиобластом характеризуются. Выделение и получение этих электромобилей ранее было описано и визуализируется 18.
- Поместите частицы калибровки в верхней ячейке жидкости. Надавите (например 0,8 кПа), используя VPM и запись> 500 частиц.
- При выполнении измерений с несколькими давления, увеличения прилагаемого давления (например до 1,0 кПа) и записать второй файл калибровки. Примечание: минимум 0,2 разницы кПа требуется.
- Снимите калибровочный образец из верхней ячейки жидкости. Вымойте верхней ячейке жидкости 3 раза 100 мкл PBS для удаления остаточных частиц. До введения образца в верхней ячейке жидкости, использовать безворсовой ткани, чтобы удалить остатки PBS с верхней клетки жидкости.
- Введение образца до верхней камере жидкости. Убедитесь, что базовый ток в пределах 3% от базового тока наблюдается при измерении частицы калибровки. Если не находится в пределах 3%, применить стратегию, описанную ниже, для стабилизации базовой тока. Применить точные давления применительно к частицам калибровки и записывать файлы примеров.
Примечание: Скорость участок частица должна отображать обнаружение постоянного частиц (Рисунок 2а). В случае внезапного прерывания регистрации частиц, внезапного падения базовой тока, или внезапного увеличения значения шума, пор может быть засорен; Таким образом, приостановить запись. Для того, чтобы восстановить исходную, кран или скрутить экранирующую крышку, применяются на поршень, или полностью удалить нанопор и мыть его дистиллированной водой и заменить его на инструменте.
Примечание: В качестве альтернативы, увеличить нанопор протяжение до 47 мм в сочетании с максимальным давлением от ВПМ течение примерно 5 минут.
Анализ 1,4 данных
- Нажмите на кнопку "; Анализ вкладку Data ", чтобы открыть раздел анализа программного обеспечения. Процесс калибровки и файлы примеров, щелкнув правой кнопкой на "необработанных файлов» и выбрав "обрабатывать файлы".
- Установите флажок рядом с образцом в "Откалиброванная" колонке на пару файлов примеров для калибровки записей. Выберите соответствующие примеры и калибровочные файлы и нажмите "OK". Примечание: при использовании опции калибровки нескольких давление выберите вкладку "Calibration Multi-давление" слева, чтобы пару нескольких образцов в несколько файлов калибровки.
- После того, как успешно в сочетании, программное обеспечение Izon Control Suite покажет различные характеристики образца, таких как размер-распределения (рисунок 2b), базовые продолжительность, полная ширина половины максимального (FWHM) и анализ концентрации. Опционально: Для каждого образца, отдельные точки данных могут быть экспортированы в разделенные запятой файл.
2lternative протокол - владением Образцы с калибровкой Бусы
Примечание: В общем, стандартная процедура может использоваться при работе с изолированными электромобилей. При работе с неизолированными электромобилей в биологических образцах, или изолированных EV препаратов, загрязненных крупных белковых агрегатов, эксплуатации прибора может быть сложной задачей. Эти проблемы состоят в основном из высоких темпов блокирования нанопор (внезапное падение базового тока), невозможности восстановления базовых токов в пределах 3% от калибровочного измерения или значительные различия в темпах частиц между идентичных образцов (рис 3а). Для образцов, что показывает эти трудности альтернативный протокол количественно электромобилей была разработана 17. Эта методика основана на введении больших калибровки полистирола в образец интереса (фиг.3В). Подробное описание процедуры для этого альтернативного протокола обсуждается ниже.
2.1. ОбразецПодготовка
Примечание: При подготовке проб с использованием альтернативного метода, желательно установить соотношение EV-к-бусинку вокруг 1 Кроме того, важно, чтобы включить 'Калибровка шарик только' образец, чтобы обеспечить точную 'стробирования' из Калибровочные шарики и определить количество фоновых частиц (например белковых агрегатов), присутствующих в буфере.
- Центрифуга 100 мкл супернатанта клеточной культуры 7 мин при 300 мкг в
- Добавить 20 мкл супернатанта в 20 мкл PBS и 10 мкл 75 раз разбавляют 335 нм полистирольные шарики (складе 7e10 / мл).
2.2. Образец Измерение
- Используйте стратегию, описанную в разделе 1.2, чтобы определить оптимальные настройки прибора.
- Измерьте 'Калибровка шарик только' образец первого. Убедитесь, что фон обнаружение мелких частиц без бортов является как можно более низкой (<10% гранул).
- Измерьте каждую отдельную саmple однажды записи размножается в целях распределения флуктуаций в условиях нанопористых поровну на различных образцах. Мера по крайней мере, 3 повторов каждого образца.
- Измерьте »калибровку бисера только« образец после окончания записи всех образцов.
2.3. Анализ данных
Примечание: При использовании альтернативного протокола, исключительное использование программного обеспечения Izon Control Suite не хватает для расчета концентрации. Дополнительное программное обеспечение электронной таблицы не требуется. Таблица 1 показывает пример расчета концентрации образцов, показанных на рисунке 3.
- Откройте »калибровку бисера только« образец и один или несколько файлов образцов.
- Определите, какие блокада событие размер (в нА) может быть использован в качестве отсечения для различия между электромобилей и полистирольных шариков. Определение стоимости блокады (Na), соответствующую левой нижней части популяции полистирольных шариков (
- Получить значения общего количества частиц для каждого образца, нажав на вкладку "Анализ частиц Сводка» образца.
- Фильтр наборов данных с использованием уровня отсечки определяется на этапе 2.3.2. выбрав «Фильтрация данных» всплывающее окно. Показать только частицы меньше, чем отсечкой.
- Получить значения подсчета EV для каждого образца от «Анализ частиц Основная".
- Вычесть количество электромобилей от общего количества частиц, чтобы определить количество калибровочных шариков.
- Определить соотношение EV-к-бусинки, деля количество EV по количеству калибровки бортового.
- Определить среднюю соотношение фона путем усреднения коэффициентов, определенных для каждого &# 8220; шарик только "калибровки образец. Вычтите это значение из каждого отдельного образца.
- Умножьте скорректированный коэффициент EV-к-бусинки по концентрации калибровочных бисера для определения концентрации электромобилей для каждого образца.
- Умножение концентрацию найденных на шаге 2.3.9 на коэффициент разбавления, введенного Е. добавлением калибровки шариков к образцу EV. Примечание: В примере установки образца, общее разбавление образца в PBS и калибровки шариков в 2,5 раза и, таким образом, концентрация найден на этапе 2.3.9 следует умножить на 2,5, чтобы определить концентрацию образца сырой эВ.
- Рассчитать статистику, например, средних, стандартного отклонения и стандартной ошибки среднего для каждой группы дубликатов.
Примечание: в некоторых случаях перекрываются между электромобилей и колосовых полистирольных шариков наблюдается. Если коррекция в недооценке концентрации EV требуется, образцы без колосовых полистирольных шариков также должны быть измерены. Используйте ту же нарезнаяот как определено на этапе 2.3.2 определить отношение "шарик-к-EV", чтобы вычислить отношение электромобилей, которые входят в диапазоне шипами полистирольных шариков. Это отношение шарик-в-EV должны быть добавлены в соотношении EV-к-бусинки, определенной в шаге 2.3.8.
2.4. Дополнительно: EV Размер Распределение Использование альтернативного метода.
- Откройте запись образца в два раза в набор программного обеспечения управления.
- Установите параметры фильтра одного из образцов для отображения только частиц больше светотеневой определенной выше. Это покажет только частицы калибровки.
- Установите отфильтрованный образец к "калибровки файл" и введите размер режим калибровки бисера.
- Пара образец файла и "файл калибровки", созданный на шаге 2.4.3, как описано в 1.4.2. Теперь пример файла будет отображать распределение по размерам обоих электромобилей и калибровки шариков на основе шипами калибровки шариков.
Примечание: стандартный оперуПротокол тин чаще всего достаточно для определения размера-распределений электромобилей. Иногда, однако, точные компоненты буфера неизвестны (например, в плазме или моче), что делает невозможным, чтобы приготовить образец калибровочных шариков в том же буфере, что и электромобилей, представляющих интерес. Е. Образец, обогащенный калибровки частиц могут быть использованы для EV-размера оценки в этих конкретных условиях.
Representative Results
Чтобы использовать инструмент TRPS, не проводящий нанопора должен быть размещен на 4 объятия машины (рисунок 1а) и напряжения (рисунок 1b) должен быть применен. После того, как электрический ток базовый устанавливается, импульсы резистивные вызванные частиц, проходящих через поры будет обнаружен как показано на рисунке 1c.
Электромобилей очищали из супернатанта культуры клеток из линии клеток глиобластомы U87-MG / EGFRvIII ультрацентрифугированием. Стабильный курс-участок частиц наблюдается при измерении разрозненные электромобилей (Рисунок 2а) на нанопору NP100. Это стабильный курс-участок частиц требуется для надежного измерения концентрации EV. После спаривания запись EV-пробы к записи 115 нм калибровки полистирола бисером, размер дистрибутива (Рисунок 2b) и оценки концентрации в EV-образца можно получить (данные не представлены).
(Figrue 3а). Это приводит к неточным оценкам концентрационных EV. По пики образца с полистирольных шариков известной концентрации и размеров, коэффициент EV-к-шарик может быть определена. 3б иллюстрирует результаты, полученные после пики супернатанта клеточной культуры с полистирольных шариков 335 нм по размеру. Два четкие популяции наблюдаются. Частицы, вызывающие блокаду менее 0,46 нА определяются электромобилей, более крупные частицы определяются полистирольные шарики. Отношение электромобилей в полистирольных шариков используется, чтобы вычислить концентрацию сырого электромобилей (таблица 1). Фиг.3С иллюстрирует оценку размера из двух популяций на основе шипами полистирольных шариков. Установка нанопора используется повторнообращались за консультациями в обнаружении EVS> 140 нм в размере. Это может быть снижена за счет уменьшения отверстие нанопор, однако это также приведет к более загрязненности событий.
Рисунок 1: qNano инструмент и режим работы. (А) Фотография прибора. Нанопор расположен на инструменте, отделяя более низкую клетку жидкости из верхней камере для жидкости. Жидкость клетки защищены от окружающей среды электрических помех со стороны защитного колпачка. (B) Иллюстрация с изложением перестраиваемый зондирования резистивный импульсов (TRPS). Непроводящий упругой нанопора отделяет два жидкости клетки. При подаче напряжения устанавливается электрический ток через поры проколотой в нанопоры. Как внеклеточные пузырьки двигаться через нанопоры, ионный поток изменяется, и, как обнаружено резистивного импульса. В TRPS размер открытие нанопору могут быть настроены (уменьшается или увеличивается), растягивая нанопористых путем увеличения расстояния между противоположными плеч прибора, или сокращение этого расстояния. (C) Наглядный пример резистивных импульсов. Величина одного импульса резистивной пропорциональна объему частицы:. Крупные импульсы указывают на более крупные частицы Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Частица рассчитывать-сюжет и размер-распределение, полученное из измерения изолированных электромобилей от U87-MG / EGFRvIII супернатанта культуры клеток () частиц рассчитывать-участок с указанием общего обнаружения постоянного частиц.. Краткая сокращение учаОбнаружение ле наблюдалась между 80 и 100 сек записи. После паузы записи и нажав на экранирующий колпачок, скорость частиц стабилизированного после чего запись была возобновлена. (Б) распределение по размерам отдельных электромобилей нанесена после калибровки неизвестного образца (ЕДС) на 115 нм калибровочных полистирольных шариков. (5 нм Размер бен). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: TRPS количественное электромобилей в супернатанта клеточной культуры с использованием альтернативного протокола. (А) Типичные зависимости скорости частиц, полученных при измерении электромобилей непосредственно на биологической жидкости. Пор засорение приводит краткие перерывы и колебания в скорости обнаружения частиц. КаждыйУчасток представляет собой измерение реплицировать того же образца. (B) трех повторных размер-графики распределения полученных после пики супернатант клеточной культуры с 335 нм калибровки полистирола бисера. Все частицы, вызывающие резистивный импульс меньше, чем 0,46 нА выбраны в качестве электромобилей. (С) шипами полистирольные гранулы могут быть использованы, чтобы получить размер-распределение образца. (5 нм Размер бен). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Измерение | Только Калибровка # 1 | Только Калибровка # 2 | Супернатант # 1 | Супернатант # 2 | Супернатант # 3 |
| Средний ток (нА) | 117 | 120 | <TD> 116118 | 120 | |
| Скорость частиц | 172 | 194 | 250 | 246 | 196 |
| отсечки используется (нА) | 0.46 | 0.46 | 0.46 | 0.46 | 0.46 |
| Всего частицы | 303 | 317 | 489 | 488 | 454 |
| Внеклеточные везикулы | 3 | 1 | 213 | 215 | 213 |
| Шипами калибровки бусины | 300 | 316 | 276 | 273 | 241 |
| EVS / калибровки бусины | 0.01 | 0.003 | 0,772 | 0,788 | 0,884 |
| Образец - фон | 0,765 | 0,781 | 0,877 | ||
| Extracelullar везикулы (10 7) / Мл | 7.14 | 7.29 | 8.18 | ||
| Образец 2.5x разбавляют | |||||
| Сырье концентрации электромобилей (10 +7) / мл | 17.85 | 18.22 | 20.46 |
Таблица 1:. Пример расчета концентрации EV используя альтернативный протокол пороговые значения намерен выделить электромобилей от калибровки бисера. Впоследствии, общее количество электромобилей и бисера может быть восстановлена. Для каждого измерения вычисляется отношение EV-к-шарик. Количество фоновых частиц в электролите (например белковых агрегатов) рассчитывается путем усреднения соотношение EV-к-шарик для отдельных измерений "калибровки бисером только 'образца. Для каждого образца отношение фона вычитается из полученного коэффициента. Это adjusteОтношение г умножается на концентрации калибровочных бисера в образце (в данном примере: 9.33e7 / мл). Для определения концентрации первичного электромобилей, полученный концентрация умножается на общее коэффициент разбавления электромобилей (в данном примере: 2,5).
Discussion
Протоколы, описанные в этой рукописи предлагают методологий для определения количества и размера характеристике электромобилей с использованием TRPS. Основными преимуществами платформы TRPS являются малый размер выборки, относительная длительность короткого измерения и отсутствие необходимой манипуляции образца.
Предпосылкой для точного измерения TRPS является сохранение условий идентичные между поверочные и образцов. Это включает в себя использование одинаковых буферов, а также одинаковые настройки прибора, такие как размер нанопор, напряжения и приложенного давления. Оригинальный ВПМ отсутствует механизм для точной настройки приложенного давления, в результате чего незначительные различия в приложенного давления между образцами. Кроме того, испарение заливной жидкости в VPM может вызвать незначительные перепады давления при измерении в различные моменты времени и ВПМ должны поэтому часто быть повторно заполнен. Эти ограничения потенциально решена путем введения VPM2, которыйесть щелчок на основе масштабирование и базируется давление воздуха.
Альтернативный протокол, описанный в этой рукописи особенно подходит для измерения электромобилей в не очищенных биологических образцов 17. Мы считаем, что буферные компоненты, такие как сахара, липидов, белков и других крупных обломков, в некоторых случаях может повлиять на условия измерений слишком много для стандартного протокола, применима. Добавление калибровки бисера к образцу, а не сравнение двух отдельных измерений вводит в «реальном времени калибровки '. Этот способ особенно подходит при сравнении образцов (например, в плазме крови различных доноров), которые имеют различные и / или неизвестных жидкостных фоновые содержимое. Хотя существуют различия между электромобилей и частиц полистирола (например плотности частиц и поверхностного заряда), теоретических моделей, а также экспериментальных данных подчеркивают удобство полистирольных шариков для количественного и размера профилирования электромобилей,под условие, что значительное давление применяется 15,19. Чтобы свести к минимуму влияние электрокинетических сил, использование относительно увеличения NP150 / NP200 нанопору и значительным положительным давлением рекомендуется.
Электромобили и калибровочные шарики отличаются по размеру. Следовательно, нанопор должен быть открыт путем применения участок, до диаметра, где наблюдается обнаружение обоих электромобилей и более крупных частиц калибровки. Поскольку открытие поры будет уменьшить чувствительность к более мелкие частицы, только EVS больше определенного размера регистрируются (часто EVS> 120 нм при использовании 335 нм калибровки шарик). Минимальный предел обнаружения для электромобилей может быть уменьшена примерно до 90 нм, 203 нм, используя калибровочные шарики на нанопоры NP150. Тем не менее, эта установка может быть нежизнеспособным, когда крупные электромобилей вызвать частое засорение нанопоры. Присутствие этих препятствующих электромобилей может заставить использование установке, где популяция электромобилей, слишком мала, чтобы REAсп порог обнаружения, не будут обнаружены.
Трудность для работы системы увеличивается при попытке измерить частиц менее 100 нм в размере. В таких случаях, обнаружение может быть улучшена за счет увеличения концентрации соли в электролите. Повышенная концентрация ионов будет индуцировать относительно повышенные блокады величины для мелких частиц (больше отношение сигнал-шум). Жизнеспособность этой техники для измерений электромобилей имеет быть подтверждено хотя, как повышенные концентрации соли может повлиять на объем электромобилей.
В заключение, TRPS платформа может использоваться для прямого количественного и размера характеристике электромобилей. Поскольку никакой изоляции или EV манипуляции (связывания антител или люминесцентные маркировка) не требуется, платформа подходит для прямого EV количественного в биологических жидкостях. Альтернативный протокол условии, что может быть полезным для образцов, где буферные компоненты вызывают значительное пор clogginг события, делая надежную использование стандартного протокола нежизнеспособным.
Disclosures
Развитие наметившейся протокола и написания этой рукописи выполнена при финансовой поддержке, в частности, голландским Brain Foundation, Шумахер Kramer Фонда, и Bohnenn фонда. Производство этого видео-статье частично sponsorted по Izon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qNano instrument | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Variable pressure module | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Nanopore | Izon Science Ltd. | NP100, NP200 | Choice of nanopore varies based on target particle. Different nanopores are available for different target sizes. |
| Calibration Particles | Izon Science Ltd. | CPC100, CPC200, CPC400 | Calibration particles are available in different sizes. |
| Sonication bath | Multiple available | Basic sonication bath is sufficient | |
| (Mini) vortexer | Multiple available | ||
| Lift-free tissues | Multiple available | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Multiple available | ||
| Windows based computer | |||
| Izon Control Suite 2.2 | Izon Science Ltd. | N/A | |
| Spreadsheet Software | Multiple available | N/A |
References
- Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature reviews. Drug discovery. 12, 347-357 (2013).
- Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 24-35 (2013).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'. Seminars in immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9, 871-881 (2008).
- Bobrie, A., et al. Rab27a supports exosome-dependent and -independent mechanisms that modify the tumor microenvironment and can promote tumor progression. Cancer research. 72, 4920-4930 (2012).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nature medicine. 18, 883-891 (2012).
- Al-Nedawi, K., et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells. Nature cell biology. 10, 619-624 (2008).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature cell biology. 10, 1470-1476 (2008).
- Dommelen, S. M., et al. Microvesicles and exosomes: opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 161, 635-644 (2012).
- Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. Innovation in detection of microparticles and exosomes. Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 36-45 (2013).
- Vogel, R., et al. Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor. Analytical chemistry. 83, 3499-3506 (2011).
- Kozak, D., et al. Simultaneous size and zeta-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors. ACS. 6, 6990-6997 (2012).
- Willmott, G. R., et al. Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions. Journal of physics. Condensed matter : an Institute of Physics journal. 22, 454116-4510 (2010).
- Roberts, G. S., et al. Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions. Biosensor. 31, 17-25 (2012).
- Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors. Analytical chemistry. 84, 3125-3131 (2012).
- Kozak, D., Anderson, W., Trau, M. Tuning Particle Velocity and Measurement Sensitivity by Changing Pore Sensor Dimensions. Chemistry Letters. 41, 1134-1136 (2012).
- Vrij, J., et al. Quantification of nanosized extracellular membrane vesicles with scanning ion occlusion sensing. Nanomedicine. 8, 1443-1458 (2013).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (3037), (2012).
- Yang, L., Broom, M. F., Tucker, I. G. Characterization of a nanoparticulate drug delivery system using scanning ion occlusion sensing. Pharmaceutical research. 29, 2578-2586 (2012).
