Omfattende analyse af transskription Dynamics fra Brain Prøver Efter Behavioral Experience

Abstract

Kodningen af ​​oplevelser i hjernen og konsolidering af langsigtede erindringer afhænger af gen-transkription. Identifikation af funktion af specifikke gener i kodning erfaring er et af de vigtigste mål for molekylær neurovidenskab. Desuden funktionelle sammenslutning af definerede gener med specifikke adfærd har konsekvenser for forståelsen grundlag af neuropsykiatriske lidelser. Induktion af robuste transskription programmer er blevet observeret i hjernerne hos mus efter forskellige adfærdsmæssige manipulationer. Mens nogle genetiske elementer udnyttes gentagne efter forskellige adfærdsmæssige manipulationer og i forskellige hjernekerner transkriptionelle programmer er generelt unikke for inducerende stimuli og struktur, hvori de studeres ^1,2.

I denne publikation er en protokol beskrevet for robust og omfattende transskriptionsprofilering fra hjernekerner af mus som reaktion på adfærdsmæssige manipulation. Denprotokol er påvist i forbindelse med analyse af genekspression dynamik i nucleus accumbens efter akut kokain oplevelse. Efter en defineret in vivo erfaring målet nervevæv dissekeres; efterfulgt af RNA-oprensning, revers transkription og udnyttelse af mikrofluide arrays for en omfattende qPCR analyse af flere target gener. Denne protokol er gearet til omfattende analyse (adressering 50-500 gener) for at begrænse mængderne af udgangsmateriale, såsom små hjerne prøver eller endda enkelte celler.

Protokollen er mest fordelagtigt for parallel analyse af flere prøver (f.eks enkelte celler, dynamisk analyse efter farmaceutiske, viral eller adfærdsmæssige forstyrrelser). Imidlertid kunne protokollen også tjene til karakterisering og kvalitetssikring af prøverne forud for hel-genom studier af mikroarrays eller RNAseq, samt validering af data fra hel-genom studier.

Introduction

Hjernens dynamisk organisation giver kognitiv og adfærdsmæssig fleksibilitet. Oplevelser er kodet gennem ændringer i struktur og styrke forbindelser mellem neuroner i hjernen ^3. Denne "erfaring-afhængige plasticitet" er et resultat af induktion af specifikke mønstre af genekspression, der giver de nødvendige proteiner til ændring af synaptisk struktur og styrke ^4. Identifikationen af ​​gen regulerende netværk mægle dannelsen af ​​langsigtede erindringer er et centralt element i molekylær neurovidenskab, med forventningen om, at identifikationen af ​​de dominerende elementer i transkriptionelle programmer vil give indsigt i de grundlæggende principper, der regulerer hukommelse dannelse, samt mål for behandling af neurodegenerative og neuropsykiatriske lidelser. Transkriptionelle programmer udfolde sig i tidsmæssigt definerede bølger, som hver koder for gener af forskellig karakter, som er vigtige for different stadier i gennemførelsen af resultatet af begivenheden signalering ^1,2. Det er derfor vigtigt at behandle transkriptionelle dynamik på en detaljeret tidsmæssig tidshorisont, således at identificere den fuldtallige gener induceret, og få indsigt i deres potentielle funktion i henhold til dynamikken i deres induktion.

Stofmisbrug er en robust form for erfaring-afhængige plasticitet forårsaget af langvarige virkninger af misbrugsstoffer på neurale kredsløb i hjernen ^5,6. Initial, akut eksponering for lægemidler kan føre til udvikling af afhængighed og overgang til kronisk brug. Kontekstuelle oplysninger er et afgørende element i udviklingen af ​​afhængighed. Drug-associeret miljømæssige signaler tildeles stor betydning i hovederne på stofmisbrugere. Kontekstuelle oplysninger minde en stofmisbruger af tidligere lægemiddel erfaring kan fremkalde tilbagefald til stofhunger selv efter lange perioder med afholdenhed fra narkotika eksponering ^7,8.Derfor den store kliniske udfordring i afhængighed - tilbøjelighed til addicts selv længe efter abstinenssymptomer er aftaget ^9.

Behavioral sensibilisering til kokain er en simpel model af kokain erfaring nyttige i studiet af mekanismer narkotikamisbrug. I denne bredt studerede model for langvarig overfølsomhed induceret af kronisk eksponering for misbrugsstoffer, er gnavere først vant til saltvandsinjektioner (ip, IP) i en roman miljø (en åben mark, i hvilket deres bevægelsesaktiviteten overvåges) ; så får de daglige injektioner af kokain på åben mark kamre, mens deres aktivitet overvåges ¹⁰ (figur 1). Denne adfærdsmæssige paradigme typisk resulterer i en robust sensibilisering af bevægelsesapparatet adfærd (8-12 gange over baseline aktivitet) ^11, som opretholdes i en periode på flere måneder efter ophør af kokain injektioner, hvilket viser dannelsen af en perversasive hukommelse spor af narkotika oplevelse.

Den neurale kredsløb i belønning, naturligvis involveret i at styrke adfærd afgørende for succes af en art (f.eks fodring, køn), udnyttes af misbrugsstoffer at styrke lægemiddelrelaterede adfærd ^12,13. De molekylære og cellulære mekanismer, som oplevelsen af misbrugsstoffer er øget synes at svare til de mekanismer, der ligger til grund for dannelsen af deklarative eller semantiske erindringer i andre hjerne strukturer ^14. Derfor robusthed adfærdsmæssige overfølsomhed Modellen gør det til et attraktivt modelsystem til at studere mekanismer erfaring afhængige plasticitet.

The nucleus accumbens (NAC) er en central integrator hjernens belønningssystem kredsløb og er blevet grundigt forbundet med udvikling af afhængighed ^5,6. Dannelsen af ​​afhængighed afhænger transkription af nye proteiner i nucleus accumbens, og robust iduktion af klart struktureret transskription programmer er observeret i NAC efter kokain erfaring ^15-19. Den akutte transkriptionel respons på kokain eksponering kan forventes at fungere på flere niveauer med henblik på at tilpasse sig til den stærke induktion stimulus og styre produktionen af nye proteiner, er ansvarlige for de strukturelle og elektrofysiologiske forandringer som følge af eksponering for lægemidlet ^6,19-22.

For at fremme studiet af molekylære mekanismer erfaring afhængige plasticitet i hjernen, er en protokol beskrevet for den omfattende analyse af transskription dynamik i hjernens vævsprøver efter adfærdsmæssige manipulation. Protokollen er illustreret i forbindelse med adfærdsmæssige erfaring studeret i Citri laboratoriet - adfærdsmæssige sensibilisering kokain, udnytte mikrofluide dynamiske arrays til transkriptionel analyse. Den beskrevne protokol er naturligvis ikke begrænset til at studere than nucleus accumbens i forbindelse med adfærdsmæssige sensibilisering, men kan anvendes på en lang række adfærdsmæssige paradigmer og hjerneregioner. Faktisk kan denne protokol anvendes til kroppens væv uden for hjernen, og en række af oplevelser eller manipulationer af organismen undersøgt.

Protokollen er groft inddeles i fire trin. I det første trin, dyret udsættes for adfærdsmæssige paradigme; i det andet trin vævet er mikrodissekeres; i det tredje trin - mRNA renset, revers transkriberet og undersøgt, og i det sidste trin af data analyseres.

I forbindelse med at studere transkriptionale dynamik, den præcise timing og definition af erfaring er nok de vigtigste eksperimentelle parametre der styrer. Af denne grund vores adfærdsmæssige model for valget er, at adfærdsmæssige sensibilisering kokain, et system, der giver en høj grad af forsøgslederen kontrol over parametre oplece. Yderligere adfærdsmæssige paradigmer, der muliggør præcis timing og håndtere forskellige modeller for erfaring-afhængige plasticitet eller hukommelse dannelse er tilgængelige. Disse modeller omfatter frygt condition ^23, akut miljøberigelse ^24,25, roman objekt udforskning ²⁶ og visuel oplevelse efter mørke opdræt ^27. Stadig, adfærdsmæssige sensibilisering til kokain er en solid og sammenhængende adfærdsmæssige manipulation, hvilket skaber en meget gennemtrængende hukommelse spor, som varer i flere måneder efter kokain erfaring ^28.

Hjernen er sektioneret, efterfulgt af manuel mikrodissektion af nucleus accumbens. Det har været vores erfaring, at manuel mikrodissektion fra hurtigt tilberedt hjerneskiver giver den mest pålidelige og hurtig metode til udvinding vævet relevant for den adfærdsmæssige paradigme, og med erfaring, grænserne for væv bliver tydelige og let genkendes. Alternativt kan tynde skiver være prepared, efterfulgt af laser-capture mikrodissektion. Selv om denne metode giver mulighed for højt defineret afgrænsning af området af interesse, den er langsom (og dermed risikere tab af labile mRNA), kedelig og kræver dyre dedikeret udstyr (et mikroskop udstyret med en laser-capture setup). Protokollen defineret heri kan også tilpasses til encellede transkriptionel analyse ved manuel opsugning af cytoplasma visuelt identificerede celler ved anvendelse af patch pipetter ^29. Det er vigtigt at bemærke, at protokollen beskrevet giver en gennemsnitlig befolkning, mens det er meget sandsynligt, at i de fleste tilfælde kun en delpopulation af cellerne i vævet faktisk involveret i at reagere på oplevelsen. Det er af interesse at profilere transkription på en selektiv måde fra inden for specifikke cellepopulationer reagerer på oplevelsen, men diskussion af disse tilgange er ud over det nuværende omfang.

For mRNA oprensning, reverse-transskription og qPCR forespørge, vævetafbrydes ved at føre det gennem fine nåle, efterfulgt af anvendelse af kommercielt tilgængelige kits (for mere information, se tabel 8). Valget er informeret af erfaring med disse metoder, der sikrer pålidelig ekstraktion af RNA høj kvalitet og robuste resultater fra efterfølgende anvendelser.

Mens protokollen er beskrevet for high-throughput qPCR udnytte dynamiske arrays, kan prøverne probes til genekspression ved hjælp endepunkt PCR, lav-throughput qPCR, genekspressionssystemer mikroarrays eller dyb sekventering. Præferencen for high-throughput qPCR udnytte dynamiske arrays skyldes det faktum, at mRNA opnået fra hjernekerner følgende adfærdsmæssige paradigmer er ofte begrænsende mængder. Dynamiske arrays giver en platform, som muliggør effektiv omfattende analyse af transkripter fra et stort antal parallelle prøver i et enkelt eksperiment. Efter den første erhvervelse af mikrofluid systemet (almindeligvis en institutionel purchase) eksperimenter er relativt billige at køre. Efter denne analyse kan yderligere forespørgsler af prøverne udføres ved hjælp af mere kostbare platforme til at søge efter nye afskrifter (ved mikroarrays eller RNAseq) med de dynamiske arrays giver en omfattende reference for kvalitetssikring. Endelig til dataanalyse, der standard tilgange udnyttes. Specifikke fingerpeg om problemer, der kan opstå, vil blive drøftet i teksten til protokollen.

Denne protokol er mest hensigtsmæssigt for efterforskerne interesseret i en grundig undersøgelse af deres system af renter, der studerer flere betingelser og gentagelser. Protokollen er også bedst egnet til efterforskere, der allerede har finpudset i (gennem microarray eller RNAseq eksperimenter) på en delmængde af 50-500 gener af interesse, som de er interesseret i at forespørge gentagne gange.

Protocol

BEMÆRK: Protokollen følger retningslinjerne i Det hebraiske Universitet i Jerusalem dyreplejepraksis.

1. Fremstilling af ACSF Løsning

1. Forbered ACSF opløsning som beskrevet i tabel 1. Lav 1 L i Hedeselskabet ₂ O (> 18 MOhm renhed), bringer osmolaritet til ~ 300 mOsm / L med passende tilsætning af vand eller NaCI.

2. Udstyr og Room Set Up

Det udstyr til overvågning af kokain-induceret lokomotorisk adfærd består af adfærd kamre (50 x 45 cm) kablede med en indvendig lyskilde, ventilator og kamera (eller infrarøde sensorer), og forsynet med en indre plexiglas boks (30 x 30 cm) i som musene får lov til at bevæge sig frit, mens deres bevægelse overvåges. Den adfærdsmæssige test bør udføres mellem 1 time efter lys på til 1 time før lysene slukket, på en regelmæssig lys / mørke-cyklus. Dyr bør uddannes konsekvent på samme tidspunkt hver dag.

1. Rengør kamrene efter hvert forsøg med et desinfektionsmiddel, som mus, og / eller lugt fjernelse reagens for at undgå olfaktoriske cue partiskhed og for at sikre en korrekt desinfektion.

VIGTIGT: Under håndtering musene være stille, rolig og forsigtig.

3. Animalske Forberedelse

1. House 5 C57BL6 hanmus (6-12 uger gamle ~ 25-35 g vægt) pr bur, i et værelse med en 12 timers lys / mørke-cyklus og fri adgang til mad og vand, i henhold til standarder og krav om lokalt Animal Omsorgsudvalget vejledning og protokoller. Før påbegyndelse af forsøget, vejes musene og logge data. Kokain senere indgives ifølge vægten af ​​musene.
2. Overfør alle bure indeholdende mus ind i adfærdsmæssige rum 30 minutter, før du starter den første retssag.
3. Vænne allemus, der anvendes i forsøget til forsøgslederen håndtering, injektioner og overvågning i adfærd opsætningen. Dette opnås ved 3 på hinanden følgende daglige intraperitoneale injektioner af 250 pi saltvand som beskrevet nedenfor.
4. Administrere en intraperitoneal injektion af 250 pl saltvand. Umiddelbart efter injektionen, skal du placere musen i en adfærd kammer til at overvåge motorisk aktivitet i 15 min. Gentag denne handling for 3 dage i træk, på samme tidspunkt hver dag.
5. På den fjerde dag, opdele musene i to grupper. Forbered en stamopløsning af kokain ved 2 mg / ml i saltvand. Administrere en enkelt injektion af kokain opløsning (endelig 20 mg / kg) til den eksperimentelle gruppe efter vægt af mus (fx for en 25 g mus - injiceres 250 pi, mens en 30 g mus får 300 ul). Indgives saltvand til kontrolgruppen. Umiddelbart efter injektionen, skal du placere musen i 20 min i en adfærd kammer til overvågning af bevægelsesaktivitet (typicallieret, er de første 15 minutter overvåget).
6. Efter kokain injektion ofre musene på forskellige tidspunkter (0, 1, 2, 4, 8 og 24 h efter injektion). Vigtigere er det, sørg for, at referencepriser mus (0 tidspunkt) ikke vil modtage injektion på denne dag. På grund af sin betydning, er det bydende nødvendigt at medtage gentagelser af referencegruppen.

4. dissektion af nucleus accumbens

1. Bedøve mus med isofluran på et passende tidspunkt efter kokain / saltvand injektion. Den isofluran skal være direkte udluftet ud af lokalet. Derfor skal proceduren udføres i et stinkskab.
2. Overvåg dybden af ​​bedøvelse ved at teste den bageste fod refleks. Klem pote til at fremkalde en kontraktion af dyret. Et dyr, der viser en refleks er ikke på et kirurgisk niveau af anæstesi og ikke i en tilstand til at aflive.
3. Udvinding af hjernen:
   1. Aflive musen ved halshugning.
   <li> Fjern skindet over midten af ​​kraniet og skære kraniet med skarpe saks.
   2. Sæt saksen på det punkt, hvor rygmarven ind i hjernen (foramen magnum) og fyldes to laterale udskæringer.
   3. Fra det samme punkt, at gøre en lang sagittal snit langs sagittale sutur. Ved ankomsten lugtekolben clip til venstre og til højre.
   4. Med en pincet fjerne kraniet omhyggeligt, greb hver halvdel af kraniet fast og trække til siden, pas på ikke at trykke på eller beskadige hjernen.
   5. Fjern hjerne, mens afskar kranienerver ved hjælp af en inverteret mikro ske spatel.
4. Placer hjernen i en iskold ACSF løsning for 1-2 minutter til nedkøling og hærde.
5. Fjern hjerne fra ACSF, væge overskydende væske med en papirserviet, oprette en koronale snit mellem lillehjernen og resten af ​​hjernen og lim hjernen, med den rostrale del opad, på vibratome scenen.
6. Skæring NAC: Bevar ACSF løsninger på iskolde temperaturer i udskæring kammer vibratome. Afdeling på 200 um, indtil nucleus accumbens (NAC) er klart identificeret i henhold til Paxinos og Franklin Mouse Brain Atlas (ca. 1,8 mm forreste til Bregma, være opmærksom på formen af ​​hjernebjælken, placeringen og formen af ​​den forreste commissure og ventriklerne, samt den overordnede morfologi af hjernen sektion). På dette tidspunkt, skal du oprette to 400 um sektioner, hvorfra NAC vil blive dissekeret.
7. Under en stereoskop bruge en fin kniv til at dissekere NAC-området ud fra skiver. Definitionen af ​​NAC er ifølge Paxinos og Franklin mus hjerneatlas, og kunne bekvemt dissekeret i de relevante afsnit af fire hurtige passager af bladet på vævet. (Figur 2).
8. Placer NAC sektioner straks 900 ul Trizol lyse reagens i et mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 ° C indtil RNA extrhandling.

5. RNA-ekstraktion og cDNA Revers transkription

1. Optø rør, der indeholder nucleus accumbens sektioner i TRIzol Reagens til lysering ved stuetemperatur og homogeniseres lysatet med en 1 ml sprøjte forbundet til 25 G kanyle, indtil vævet er homogeniseres fuldstændigt (mindst 15-20 gange). De første par runder er vanskelige og kræver skubbe væv mod væggen af ​​røret med henblik på at bryde det til små stykker, som kan trænge ind i spidsen af ​​nålen.
2. For at sikre homogenisering pipetteres lysatet i en QIAshredder mini rotationskolonne og centrifugeres ved 12.000 xg i 1 min.
3. Pipette lysatet i nye mikrocentrifugerør og udtrække RNA ifølge producentens anvisninger. Opbevar RNA ved -80 ° C indtil brug.
4. Mål-RNA-koncentration, analysere integritet og kvalitet ved hjælp af en Bioanalyzer eller tilsvarende udstyr. Brug 100-500 ng RNA for hver runde af cDNA forberedelse med Random hexamerprimere.

6. Primer Design og primer Test

1. Valg af gode primere: For optimal primer par til qPCR af mRNA-transkripter, skal du følge disse krav (figur 3):
   1. Design primere indeholdende højst 17-28 baser. Undgå nukleotid-gentagelser, da de fremmer mispriming.
   2. Design primere med temperatur smeltning (T _m) mellem 56-68 ° C (optimalt 60-64 ° C). _Tm inden primerparret bør være inden for 1 ° C fra hinanden.
   3. Vær opmærksom på, at produktet størrelse ideelt bør ligge mellem 80 og 150bp.
   4. Sikre, at mindst en af ​​primerne omfatter en exon-exon junction eller amplikon indeholder en stor intron (intron-spænder), for at undgå amplifikation af genomiske DNA-kontaminanter.
   5. Brug en pålidelig software baseret på Primer3 (for eksempler se tabel 2) med henblik på at forbedre primer design.
2. Test af PRimers: For at sikre, specificitet og effektiviteten af ​​de primere, en kontrol qPCR reaktion skal udføres:
   1. Anvend en positiv prøve (indeholdende cDNA-skabelon for alle relevante primerpar) og titreres cDNA (fx otte tre-fold fortyndinger fra en initiel koncentration på ~ 10 ng) i dobbelte parallelle reaktioner. Omfatter en kontrol uden template, som kontrollerer for snavs inden for de løsninger, der anvendes til reaktionen.
   2. Beregn primer effektivitet ved hjælp af formlen: (10 ^{(- 1 / hældning)} -1) x 100, således at kurven for den optimale hældning er - 3.333 (dvs. 10 ^{(- 1 / 3,333)} = ²⁾ (figur 4).
   3. Bestem specificitet forstærkning. Specifik amplifikation påvises ved en enkelt fremtrædende top fælles for alle smeltekurver af de amplificerede produkter, hvorimod off-målamplifikation forekommer som en indlysende afvigelse frabout enkelt stor top.

7. qPCR analyse

1. Pre-forstærkning:
   1. Omfattende qPCR Analysen er baseret på parallelle forespørgsler for at begrænse mængden af ​​RNA med et stort antal af primerpar. Derfor er det nødvendigt med en trin af præ-amplifikation. I dette trin cDNA undergår 14-18 cyklusser af præ-amplifikation med en blanding af alle primere, som vil blive anvendt til at forespørge prøven i fremtiden (op til 800 primerpar).
   2. Fortynd alle primere i TE (lav EDTA) til 50 pm for bestemte målgrupper Amplification (STA).
   3. Pool sammen en ul alikvoter af alle 50 uM primersæt skal indgå i STA reaktion, op til 800 assays.
   4. Forbered forblanding og prøver til STA som beskrevet i tabel 3. Tillad fejl ved fremstilling af blandingen til 110% af antallet af prøver, der skal forstærkes.
   5. Alikvot 3,75 pi STA forblanding for hver prøve. Tilføj 1,25 piaf cDNA til hver.
   6. Vortex at blande reaktioner og centrifuger i 10 sek.
   7. Placer STA reaktioner i en thermocycler og cyklus som angivet ved tabel 4.
2. Exonuclease I (ExoI) behandling:
   1. Fortynd Exo I som angivet i tabel 5.
   2. Tilsæt 2 pi fortyndet ExoI (4 U / ul) til hver 5 ul STA reaktion, vortex, spin ned (> 6.000 xg) og sted i en thermocycler ved 37 ° C i 30 minutter og derefter ved 80 ° C i 15 min.
   3. Fortynd slutprodukterne til en passende koncentration til afprøvning. Brug TE puffer (tilsæt 43 ul TE-buffer til 7 pi TSA prøve).
   4. Opbevar den fortyndede STA produkter ved -20 ° C eller bruge med det samme.
3. Primer og prøve opsætning til qPCR:
   1. Forbered prøver som vist i tabel 6. Forbered blanding ifølge valgt til eksperimentet chippen, og tilføj prøver til rådighed.
   2. Agidet lettere at Prøve Mix løsninger i minimum 20 sek, og centrifugeres (> 6.000 xg) i mindst 30 sek. Tilberedt reaktioner kan opbevares i korte perioder ved 4 ° C, indtil chippen er klar til læsning.
   3. Forbered analyser som beskrevet i tabel 7.
   4. Ryst Assayblandingen i mindst 20 sek og centrifugeres (> 6.000 xg) i mindst 30 sek til at spinde ned alle komponenter.
      VIGTIGT: Vortex grundigt og centrifuger alle prøverne og assayopløsningerne inden pipettering chip indløb. I modsat fald kan resultere i et fald i datakvaliteten.
      BEMÆRK: Slutkoncentrationen af ​​hver primer er 5 uM i indløbet og 500 nM i den endelige reaktion.
4. Priming og indlæsning Dynamic Array IFC (integreret fluidisk kredsløb) chip. IFC chip har indløb for prøver og analyser, samt specificerede indløb (akkumulatorer) til kontrol linje væske (mineralsk olie), der anvendes til at presse de mikrofluide kamre (Figure 4A).
   1. Injicer styreledningen væske i hver akkumulator på chippen.
   2. Fjern og den blå beskyttende film skille fra bunden af ​​chippen.
   3. Placer chippen i det relevante IFC-controlleren (controller MX for 48.48 Dynamisk Array IFC eller IFC-controlleren HX for 96,96 Dynamisk Array IFC), derefter køre Prime (113x) manuskript til 48.48 Dynamisk Array IFC eller Prime (136x) manuskript til 96,96 Dynamisk Array IFC for at prime chippen.
   4. Når scriptet er færdig, skal du fjerne det grundede chip fra IFC-controlleren.
   5. Afpipetteres 5 ul af hver analyse Mix og 5 pi af hver prøve blandes ind deres indløb.
   6. Retur chippen til IFC-controlleren.
   7. Brug af IFC-controller-software, skal du køre Load Mix (113x) manuskript til 48.48 Dynamisk Array IFC) eller Load Mix (136x) manuskript til 96,96 Dynamisk Array IFC at indlæse prøver og analyser i chippen. Når belastningen Mix scriptet er færdig, skal du fjerne belastningened chip fra IFC-controlleren.
   8. Indlæse chip på den termiske variator, oprette en ny chip køre (i henhold til retningslinjerne producenten), herunder smeltekurve analyse. Ved hjælp af termiske cykler software sikre, at reaktionskamrene indregnes ordentligt, og tillade reaktionen til at løbe til færdiggørelse.

8. Dataanalyse

1. Kvalitetssikring: For at sikre datakvaliteten, kontrollere kvaliteten af ​​primerne ved at tage fortyndingskurver (som beskrevet ovenfor). Overvåg specificitet forstærkning ved at se smeltekurver af amplikoner, toppene af som bør optimalt være tæt på linie ^29.
2. Visualisering: Til visualisering af store mængder data opnået ved high-throughput qPCR, bruge software genererede heatmaps, hvor udtrykket er farvekodet med intensitet. Desuden vise de transkriptionelle dynamik af enlige gener som foret scatter plots.
3. Publikation: I udgivelsegenekspressionen resultater, anbefales det at følge MIQE retningslinjer for offentliggørelse af kvantitativ real-time PCR-forsøg, med angivelse af det minimum af oplysninger, der skal indberettes til en qPCR eksperiment for at sikre dets relevans, nøjagtighed, korrekt fortolkning og reproducerbarhed.

Representative Results

Kvaliteten af ​​de opnåede resultater ved at anvende denne protokol er helt afhængig af en række parametre. Korrekt eksperimentel planlægning vil resultere i minimal forstyrrelse de eksperimentelle mus, sådan at den testede erfaring (i dette eksempel, at udsættelse for kokain) vil være den mest dominerende oplevelse i deres nyere historie, og vil derfor resultere i et robust og transkriptionel program. Figur 1 beskriver forsøgsplan for adfærdsmæssige sensibilisering til kokain, som definerer de tidspunkter efter kokain oplevelse, hvor nucleus accumbens dissekeres fra mus og analyseret. Det næste afgørende punkt er, at definere de præcise grænser for udtagelse af den korrekte væv til analyse. Figur 2 beskriver grænserne for nucleus accumbens i koronale og sagittale sektioner. Fortrinsvis dissektion skal udføres således, at en tynd margin NAc væv er udelukket fra regionen takEN for profilering. Dette sikrer ensartet profilering kun NAC, hvilket reducerer variabilitet og potentialet for artefakter som følge af inddragelse af omgivende væv.

Når amplificering begrænsende mængder RNA, som i dissektion af små hjernekerner er nødvendig for korrekt detektering af signalet mange amplifikationscykler. Derfor et afgørende punkt i enhver kvantitativ PCR eksperiment, forstærkes yderligere, når man arbejder med små mængder udgangsmateriale, er karakterisering af primere anvendt til forstærkning. Figur 3 beskriver de vigtigste funktioner i at definere optimale primere, og figur 4 viser amplificeringsprodukterne kurver af primere rettet mod c-fos og FosB, hvilket viser, at disse primerpar forstærke deres mål udskrift med ~ 100% effektivitet i hver cyklus. Efter primer validering og etablering af den rette eksperimentelle paradigme at muliggøre klar vurdering af transkription fra målet Tissue, kan omfattende analyse udføres på Fluidigm Biomark platform giver mulighed for op til 9.216 parallelle qPCR reaktioner (i 96,96 format figur 5). Denne high-throughput platform muliggør parallel analyse af flere eksperimentelle gentagelser, ved hjælp af identiske eksperimentelle betingelser på en enkelt chip. Data for firedobbelt eksperimentelle gentagelser, rettet transkriptionel induktion af c-Fos og FosB efter akut kokain erfaring er demonstreret i figur 6.

Figur 1. Eksperimentel paradigme for dynamisk transkriptionel analyse efter kokain oplevelse. (A) Eksperimentel protokol - mus vant til håndtering og injektion i 3 dage, mens overvågning af motorisk aktivitet ved hjælp af video tracking i en lyddæmpende adfærd kammer. Musunderkastes derpå kokain erfaring; en enkelt eksponering = akut kokain erfaring; 5 på hinanden følgende injektioner betegnes kronisk eksponering. En enkelt injektion efter ≥16 dages afholdenhed fra kokain betegnes en kokain udfordring. Transkriptionelle dynamik behandles på forskellige eksperimentelle tidspunkter efter kokain erfaring (1, 2, 4, 8, 24 timer). (B) Plot af musen spor inden adfærd kammer efter 3 dage saltvand injektion eller 3 dage saltvand + en enkelt akut kokain eksponering. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Placering af nucleus accumbens i musehjerne. Tykke hvide linjer markere placeringen af nedskæringer definerer B oundaries af NAC (A) Supragingival strækning. (B) sagittal sektion. (Billeder tilpasset fra Allen Brain Atlas reference Atlas billeder:. http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=1&plate=100960352 ; http: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=2&plate = 100.883.869 ). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Planlægning qPCR primere. Retningslinjer for planlægning qPCR primere, med definitioner for specificitet, stabilitet og kompatibilitet. 2fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Vurdering af primer effektivitet. (A) Resultater af amplifikationsprodukter kurver Fos og FosB hjælp Fluidigm IFC arrays. En standardkurve blev genereret ved hjælp af syv serielle 3-foldige fortyndinger af totalt RNA ekstraheret fra muse NAc og probet for ekspression af Fos og FosB. (B) Effektiviteten af primerparret til Fos og FosB blev evalueret ved at plotte cyklus tærskelværdi ( Ct) ved hver fortynding mod logaritmen af ​​folden fortynding af prøven. Effektiviteten af ​​primerne er beregnet ud fra hældningen af ​​standardkurven, som defineret i teksten. Amplifikationsprocedurerne kurver og punkter på fortyndingskurve er farve-matchede.51642 / 51642fig4highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Omfattende qPCR profilering anvendelse af Fluidigm platformen. (A) 96,96 Dynamisk Array IFC for kvantitative realtids-PCR. Primerne er lagt i indløbene placeret i højre side, og prøverne lagt i indløbene ligger i venstre side af chippen. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Fluidigm Real Time PCR-analyse User Guide. (B) opvarmes kort af resultaterne qPCR, der repræsenterer Ct-værdier for hver brønd på chippen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6. Prøveresultater for ekspressionsvektorer dynamik efter akut kokain eksponering. Kokain-induceret ekspression af c-Fos og FosB vises som en funktion af tiden. Gennemsnit af firedobbelt eksperimentelle gentagelser, der udføres i henhold til protokollen er defineret heri, vises sammen med fejlsøjler portrættere standardafvigelse af middelværdien.

Reagens	MW	mM	g / l
NaCl (Sigma-Aldrich, 71376)	58,44	119	6.95
NaHCO3 (Sigma-Aldrich, S6014)	84.01	26	2.18
Glukose (Sigma-Aldrich, G8270)	180,16	10	1.8
KCl (Sigma-Aldrich, P9541) d>	74.55	2.5	0,186
NaH 2 PO 4 (Sigma-Aldrich, S9638)	137,99	1	0,138
MgSO4 ⋅7H 2 O (Sigma-Aldrich, M1880)	246,5	4	0.99
CaCl2 (Sigma-Aldrich, C3011)	147	4	0,59

Tabel 1. ACSF løsning.

Software navn	Ansøgning	web placering
Roche Probefinder	primere design	http://qpcr.probefinder.com/organism.jsp
NCBI primer-blast	primere design	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

ve_content "> tabel 2. Software listen.

Reagens	Volumen / Reaktion (pl)	Volumen i 48 Reaktioner + 10% overskud (ul)	Volumen til 96 Reaktioner + 10% overskud (ul)
2X TaqMan PreAmp Master Mix (Applied Biosystems)	2.5	132	264
500 nM (10X) puljet tændladningsblanding	1	52,8	105,6
Vand	0.25	13.2	26.4
cDNA	1.25
Samlet volumen	5

Tabel 3. STA reaktionsopløsningen.

Betingelse	Hold	10-14 Cykler	Hold
Temperatur	95 º C	95 º C	60 º C	4 * C
Tid	10 min	15 sek	4 min	∞

Tabel 4. varmecyklus betingelser for præ-forstærkning.

komponent	Pr 5 pi Sample (pl)	48 Prøver med Overdosering (pl)	96 Prøver med Overdosering (pl)
Vand	1.4	84	168
Exonuclease I reaktionsbuffer	0.2	12	24
Exonuclease I ved 20 enheder / ul	0.4	24	48 </ Td>
Samlet volumen	2.0	120	240

Tabel 5. ExoI reaktionsopløsningen.

</ Tr>

SAMPLE MIX	Komponent Volumen pr Inlet (pl)	Volumen pr Inlet med Overdosering (pl)	Volumen til 48.48 Dynamisk Array IFC (ul) (120 prøver)	Volumen til 96,96 Dynamisk Array IFC (ul) (120 prøver)
2X SsoFast EvaGreen Supermix med Low ROX (Bio-Rad, PN 172- 5211)	2.5	3	180	360
20X DNA binding Dye prøveindføringen Reagent (Fluidigm, PN 100- 3738) grøn kasket	0.25	0,3	18	36
STA og ExoI behandlede prøve	2.25	2.7
Samlet	5	6

Tabel 6. Eksempel på Pre-Mix løsning.

Tabel 7. Assay Mix opløsning.

Komponent	Volumen pr Inlet (pl)	Volumen pr Inlet med Overdosering (pl)	Volumen til 48.48 Dynamisk Array IFC (pl)	Volumen til 96,96 Dynamisk Array IFC (pl)
2X Assay Loading Reagens	2.5	3	180	360
1X DNA-suspension buffer (TE lav EDTA)	2	2.4	144	288
50 pm hver blandet Forward og reverse primere	0,5	0.6
Samlet volumen	5	6

Navn på reagens / Material	Virksomhed	Katalognummer
Virusol	Oriek Medicinsk	J29D
Isofluran, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit	QIAGENE	73404
QIAshredder	QIAGENE	79654
High Capacity cDNA Reverse transskription kit	Invitrogene	AB-4368814
TE Buffer	Invitrogene	1355656

Tabel 8. Liste over kemikalier / reagenser.

Navn på udstyr	Virksomhed	Katalognummer
Opførsel Chamber (MDF, 50 x 45 cm)	Self samlet
Indvendig Plexiglas boks (30 x 30 cm)	Self samlet
Kamera og videooptager	Campden Inst	CMD-80051
Medier Recorder software	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris saks	FST	FST-14062-09
Vibratome	Campden Inst.	7000SMZ-2
Bioanalyzer	Agilent Technologies	Agilent 2100 Bioanalyzer
Termocycler	Bio-Rad	1852048
Inverted microspun spatel	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD ReAder	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Dynamisk matrix Chip til 96,96 genekspression	Fluidigm	BMK-M-96.96

Tabel 9. Udstyr listen.

Discussion

Vellykket karakterisering af genekspression fra hjernevæv efter adfærdsmæssige paradigmer afhænger: 1) Omhyggelig håndtering af mus under den adfærdsmæssige paradigme; 2) Hurtig og præcis dissektion af væv af interesse; 3) RNA-safe foranstaltninger til at sikre integriteten af ​​RNA; og 4) Omhyggelig planlægning af primere og eksperimenterende layout samt præcision og opmærksomhed på detaljer i forberedelse til qPCR analyse.

Formålet med den beskrevne fremgangsmåde er at karakterisere dynamik transkriptionelle begivenheder induceret af en adfærdsmæssig erfaring; derfor er nødvendigt for omhyggelig med at sikre, at den adfærdsmæssige paradigme opleves af musen faktisk repræsenterer erfaring bestemt af forskeren. For eksempel, selv i en så simpel paradigme som adfærdsmæssige sensibilisering til kokain, oplevelsen af ​​musen kan blive påvirket af mange forstyrrende faktorer: den forudgående erfaring med musen i hjem-buret forud for exeksperimentere; metoden til overførsel til forsøgsrummet; lys, lyd og lugt eksponering i den eksperimentelle rum; oplevelsen af ​​håndtering af forsøgslederen; smerter / ubehag forårsaget af IP-injektion; udsættelse for et hidtil ukendt eksperiment, og erfaringerne efter den angivne adfærd op til punktet af eutanasi. Hver af disse erfaringer kan isoleret fremme induktion af transkriptionelle programmer i forskellige områder af hjernen med musen. Derfor skal der drages omsorg for at sikre, at det transkriptionelle program måler den ønskede paradigme, og ikke epiphenomena forbundet med paradigme. I tilfælde af kokain erfaring, er dette let opnås ved omhyggelig eksperimenteren og opmærksomhed på detaljer, såvel som en simpel styring eksperiment, hvor alle parametre holdes konstant, men køretøjet (saltopløsning) injiceres i mus end kokain. Det er vores erfaring, saltvand injektion inducerer en transskriptionel program meget begrænset omfang i forhold tilkokain eksponering, hvilket viser, at paradigmet overvældende muliggør undersøgelse af fænomenerne af interesse.

Bør tages yderst omhyggelig med at begrænse den række af oplevelser af musen, mens den stadig er aktiv, hvilket nødvendiggør rolig og omhyggelig håndtering af mus. I modsætning hertil efter anæstesi, er af afgørende betydning hurtig og præcis arbejde på grund af potentialet for hurtige ændringer i repræsentationen af ​​RNA (på tidsskala minutter), og den iboende labilitet af RNA, som kunne nedbrydes hurtigt, når cellerne bliver afbrudt, potentielt forstyrre transkriptionelle profil induceret af erfaring. Det er derfor vigtigt at fjerne hjernen fra kraniet hurtigt til en kølet miljø (indenfor 1-2 min) og hurtigt dissekere NAC i iskolde forhold. Når hjernen er blevet kølet, er potentialet for transkriptionelle ændringer eller RNA-nedbrydning reduceret betydeligt, men kun når de relevante afsnit er placeret i TRIzol reagens og frosset, jegs integritet af vævet og repræsentation af den transkriptionelle profil sikret.

I denne sammenhæng er det værd at nævne, at transkriptionelle dynamik øjeblikkelig tidlig genekspression sker på en hurtig tidsrum, ofte topper før 1 time efter stimulering. I forbindelse med den eksperimentelle paradigme beskrevet er interrogationssignalet transkriptionelle dynamik begrænset til omfanget af timer med henblik på at mindske variabiliteten mellem prøver. Til gange kortere end 1 time kan små variationer i timingen resultere i stor variation i størrelsen af ​​transkriptionelle observerede ændringer. Derfor har man valgt 1 hr tidspunkt til analyse, idet dette tidspunkt er eksperimentelt lettere at udføre med præcision, og er mindre udsat for variation i niveauet af et par minutter forskel i forsøget.

Traditionelt har et væv micropunch blevet brugt af mange laboratorier til dissektion af vævsprøver. Derer en række grunde til at foretrække manuel mikrodissektion af vævet. Dornen normalt lavet af rustfrit stål og er ikke gennemsigtig. Derfor placere punch i en præcis og konsistent placering kan være en vanskelig opgave. Endvidere har punch ikke tillade nogen korrektion, der skal foretages, hvis der var en fejl i den oprindelige placering. Endelig kan ekstraktion af væv inde fra punch undertiden være vanskelig, og der er potentiale for at miste væv, eller bære-over mellem prøverne. Mikrodissektion af vævet med en fin skalpel giver forsøgslederen mere præcis kontrol og giver sikkerhed med hensyn til renheden af ​​prøverne.

Under RNA-ekstraktion og frem til cDNA-syntese, behov arbejdsmiljøet skal holdes fri fra kilder RNase forureninger, og arbejde skal udføres ved hjælp af RNase gratis værktøjer, engangsartikler og reagenser. På dette stadium, den mindste forurening kunne nemt korrupte hårdtjente RNA-prøver. Holde prøverne Ice koldt er afgørende for at minimere neurale aktivitet, der kunne ændre den transskriptionelle udlæsning, samt at minimere enzymatisk aktivitet, der kan påvirke prøven. Yderligere farmakologiske inhibitorer sommetider tilsættes for at reducere neurale ophidselse, men ofte er disse er ikke afgørende.

Efter revers transkription til cDNA, vægten vender til at sikre validiteten af ​​de opnåede resultater fra den omfattende profilering af afskrifter. Det første skridt er at sikre, at passende qPCR primere er udnyttet, hvor det anbefales at teste primer effektivitet og specificitet på fortyndingskurver af en nærmere bestemt kilde af RNA. Optimale PCR primere specifik og effektiv amplifikation af målet. Specifik amplifikation indebærer, at amplifikation kun af målsekvensen, klart som en enkelt diskret top i smeltekurve analyse, mens effektiv amplifikation indebærer, at hver cyklus, mængden af ​​målsekvensenduplikeres, med en effektivitet tilnærme 100%. På grund af den high-throughput karakter af mikrofluide qPCR chips, disse eksperimenter kræver omhyggelig planlægning for at sikre inddragelse af et stort antal positive og negative kontroller. Det foretrækkes at omfatter konsistente kontroller i hver chip sigt muliggør direkte sammenligning af resultaterne fra kontrol og eksperimentelle betingelser. Under opsætningen af ​​eksperimentet, er det afgørende ikke at krydse-forurene brønde. Da lille mængde primere i den forkerte godt kan forårsage forstærkningen af ​​uønskede mål, skal der tages ekstra forsigtig, når pipettering primere.

For de fleste vævsprøver fra hjernen er det vanskeligt at være sikker på, at under dissektion kun vævet af interesse blev ekstraheret med ingen forurening af irrelevante hjerneregioner, som kunne forvirre analyse af resultaterne. Til dette formål er en vigtig kontrol sondering efter gener forventes hvis udtryk, der skal udelukkes fravævet af interesse. Et nyttigt værktøj til at identificere rumlige mønstre af genekspression er Allen Brain Atlas ( http://www.brain-map.org/ ).

Mens en grundig diskussion af dataanalyse er uden for rammerne af denne publikation, skal det bemærkes, at omhyggelige eksperimenter garanterer omhyggelig analyse. Det er vigtigt at sikre, at en række relevante referencepunkter gener indgår i hver runde af qPCR. Disse gener vil tjene til normalisering med henblik på at sikre, at tilsvarende mængder af RNA, der analyseres. Normalisering udføres først til de referencesatser generne i prøven, og derefter for de referencebeløb mus til eksperimentet ("tid 0"), anvendelse af "ΔΔCt-metoden".

Beskrevet i dette manuskript protokol tager sigte på at undersøge transkriptionelle dynamik efter kokain erfaring i nucleus accumbens hos mus. Det er imidlertid meget let adapted for studiet af enhver anden oplevelse af musen, så længe ordentlig kontrol er gennemført, og timingen af ​​den erfaring er veldefineret. Naturligvis kunne denne protokol også blive gennemført til undersøgelse af dynamikken i transkription i væv uden nervesystemet samt.

Det skal understreges, at omfattende transskriptionsprofilering hjælp mikrofluid-baserede qPCR er en omkostningseffektiv metode til profilering transkriptionelle begivenheder, men afhænger af forudgående kendskab målgenerne af interesse. Disse er normalt opnås gennem uvildige profilering metoder, såsom mikroarrays og dyb sekventering. Derfor, i arbejdsgangen af ​​et stort projekt, kunne omfattende qPCR profilering tilvejebringe størstedelen af ​​de data, men fortrinsvis bør følge en forudgående uvildig karakterisering af systemet.

Det er også værd om, at den heri beskrevne fremgangsmåde til opnåelse af vævsprøver også kunne gennemføres til studiertagelse af en række andre cellulære begivenheder - proteomics og protein modifikationer, metabolomik, lipidomics og epigenetiske mærker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Virusol	Oriek Medical	J29D
Isoflurane, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit	QIAGEN	73404
QIAshredder	QIAGEN	79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit	Invitrogen	AB-4368814
TE Buffer	Invitrogen	1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm)			Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm)			Self assembled
Camera and video recorder	Campden Inst.	CMD-80051
Media Recorder software	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris Scissors	FST	FST-14062-09
Vibratome	Campden Inst.	7000SMZ-2
Bioanalyzer	Agilent Technologies	The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler	Bio-Rad	1852048
Inverted microspoon spatula	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression	Fluidigm	BMK-M-96.96