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Behavior

व्यवहार अनुभव के बाद मस्तिष्क के नमूनों से ट्रांसक्रिप्शन गतिशीलता के व्यापक विश्लेषण

Published: August 26, 2014 doi: 10.3791/51642
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1The Alexander Silberman Institute of Life Sciences & Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences, The Hebrew University of Jerusalem

Abstract

मस्तिष्क और दीर्घकालिक यादों का समेकन में अनुभव की एन्कोडिंग जीन प्रतिलेखन पर निर्भर करते हैं. एन्कोडिंग अनुभव में विशिष्ट जीन के समारोह की पहचान आणविक तंत्रिका विज्ञान के मुख्य उद्देश्यों में से एक है. इसके अलावा, विशिष्ट व्यवहार के साथ परिभाषित जीन की कार्यात्मक संघ neuropsychiatric विकारों के आधार को समझने के लिए निहितार्थ हैं. मजबूत प्रतिलेखन कार्यक्रमों की प्रेरण विभिन्न व्यवहार जोड़तोड़ निम्नलिखित चूहों के दिमाग में देखा गया है. कुछ आनुवंशिक तत्व अलग व्यवहार जोड़तोड़ के बाद और अलग मस्तिष्क नाभिक में खरीदे उपयोग कर रहे हैं, ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रमों समग्र उत्प्रेरण उत्तेजनाओं और वे 1,2 अध्ययन कर रहे हैं जिसमें संरचना के लिए अद्वितीय हैं.

इस प्रकाशन में, एक प्रोटोकॉल व्यवहार में गड़बड़ी के जवाब में चूहों के मस्तिष्क नाभिक से मजबूत और व्यापक ट्रांसक्रिप्शनल रूपरेखा के लिए वर्णित है.प्रोटोकॉल तीव्र कोकीन अनुभव निम्नलिखित accumbens नाभिक में जीन अभिव्यक्ति की गतिशीलता के विश्लेषण के संदर्भ में प्रदर्शन किया है. विवो अनुभव में परिभाषित करने के बाद, लक्ष्य तंत्रिका ऊतक विच्छेदित है; शाही सेना शुद्धि के बाद, कई लक्ष्य जीन की व्यापक qPCR विश्लेषण के लिए प्रतिलेखन और microfluidic सरणियों का उपयोग रिवर्स. इस प्रोटोकॉल ऐसे छोटे मस्तिष्क के नमूने या यहां तक ​​कि एकल कक्षों के रूप में व्यापक विश्लेषण शुरू सामग्री की मात्रा को सीमित करने के (50-500 जीन को संबोधित) की दिशा में सक्षम है.

प्रोटोकॉल कई नमूनों की समानांतर विश्लेषण (जैसे एकल कक्षों, दवा निम्नलिखित गतिशील विश्लेषण, वायरल या व्यवहार perturbations) के लिए सबसे फायदेमंद है. हालांकि, प्रोटोकॉल भी प्रोटीन या RNAseq द्वारा पूरे जीनोम के अध्ययन के लिए पहले नमूने के लक्षण वर्णन और गुणवत्ता आश्वासन के लिए सेवा करते हैं, साथ ही पूरे जीनोम के अध्ययन से प्राप्त आंकड़ों का सत्यापन कर सके.

Introduction

मस्तिष्क के गतिशील संगठन संज्ञानात्मक व्यवहार और लचीलापन सक्षम बनाता है. अनुभव मस्तिष्क 3 में न्यूरॉन्स के बीच कनेक्शन की संरचना और ताकत के संशोधनों के माध्यम से इनकोड. यह "अनुभव पर निर्भर plasticity" synaptic संरचना और शक्ति 4 के संशोधन के लिए आवश्यक प्रोटीन प्रदान करता है कि जीन की अभिव्यक्ति के विशिष्ट पैटर्न की प्रेरण का परिणाम है. दीर्घकालिक यादों के गठन मध्यस्थता जीन विनियामक नेटवर्क की पहचान ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रमों के प्रमुख तत्वों की पहचान के लिए स्मृति गठन, साथ ही लक्ष्य के विनियमन के मौलिक सिद्धांतों में अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा कि उम्मीद के साथ, आणविक तंत्रिका विज्ञान के एक केंद्रीय सिद्धांत है neurodegenerative और neuropsychiatric विकारों का इलाज. Transcriptional कार्यक्रमों विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं जो अलग चरित्र के जीन, सांकेतिक शब्दों में, जिनमें से प्रत्येक अस्थायी परिभाषित लहरों में प्रकाशितसंकेतन घटना 1,2 के परिणाम के कार्यान्वयन में ifferent चरणों. यह प्रेरित जीन की पूर्ण पूरक की पहचान, और उन्हें शामिल करने की गतिशीलता के अनुसार उनके संभावित समारोह में जानकारी हासिल करने के लिए इतनी के रूप में, एक विस्तृत लौकिक timescale पर ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता पता करने के लिए महत्वपूर्ण है.

मादक पदार्थों की लत मस्तिष्क 5,6 में तंत्रिका सर्किट पर दुरुपयोग की दवाओं के लंबे समय से स्थायी प्रभाव की वजह से अनुभव पर निर्भर plasticity की एक मजबूत रूप है. दवाओं के लिए प्रारंभिक, तीव्र जोखिम की लत के विकास और जीर्ण उपयोग करने के लिए संक्रमण हो सकता है. प्रासंगिक जानकारी लत के विकास में एक महत्वपूर्ण तत्व है. ड्रग से जुड़े पर्यावरण संकेतों नशीली दवाओं के नशेड़ी के मन में महत्वपूर्ण महत्व आवंटित कर रहे हैं. दवा लालसा को पलटा पैदा कर सकते हैं अतीत दवा अनुभव की एक दवा abuser याद दिलाने प्रासंगिक जानकारी भी दवा जोखिम 7,8 से संयम की लंबी अवधि के बाद.इसलिए लत में महान नैदानिक ​​चुनौती - लक्षण 9 थम जाने के बाद नशा की प्रवृत्ति भी लंबे समय डूबने के लिए.

कोकीन को व्यवहार संवेदीकरण मादक पदार्थों की लत के तंत्र के अध्ययन में उपयोगी कोकीन अनुभव का एक सरल मॉडल है. दुरुपयोग की दवाओं के लिए पुरानी जोखिम से प्रेरित लंबे समय से स्थायी संवेदीकरण के लिए यह व्यापक रूप से अध्ययन किया मॉडल में, कृन्तकों पहले खारा इंजेक्शन (intraperitoneal, आईपी) के आदी रहे हैं एक उपन्यास वातावरण में (उनकी हरकत गतिविधि पर नजर रखी है जिसमें एक खुले मैदान कक्ष) ; उनकी गतिविधि 10 (चित्रा 1) पर नजर रखी है, जबकि उसके बाद, वे खुले मैदान कक्षों में कोकीन के दैनिक इंजेक्शन प्राप्त करते हैं. इस व्यवहार प्रतिमान आम तौर पर एक perv के गठन का प्रदर्शन, कोकीन इंजेक्शन की समाप्ति के बाद के महीनों की अवधि के लिए बनाए रखा है, जो (8-12 गुना आधारभूत गतिविधि से ऊपर) हरकत व्यवहार 11, की एक मजबूत संवेदीकरण में परिणामदवा अनुभव के asive स्मृति ट्रेस.

स्वाभाविक रूप से एक प्रजाति की सफलता (जैसे खिला, सेक्स) के लिए आवश्यक व्यवहार को मजबूत करने में शामिल इनाम के तंत्रिका circuitry, दवा जुड़े व्यवहार 12,13 को सुदृढ़ करने के लिए दुरुपयोग की दवाओं द्वारा शोषण किया जाता है. दुरुपयोग की दवाओं का अनुभव बढ़ाया है जिसके द्वारा आणविक और सेलुलर तंत्र अन्य मस्तिष्क संरचना 14 में कथात्मक या अर्थ यादों के गठन के अंतर्निहित तंत्र के समान दिखाई देते हैं. इसलिए, व्यवहार संवेदीकरण मॉडल की मजबूती यह अनुभव पर निर्भर plasticity के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली बनाता है.

नाभिक accumbens (एनएसी) मस्तिष्क का इनाम circuitry के एक केंद्रीय करनेवाला है, और बड़े पैमाने पर की लत 5,6 के विकास के साथ संबद्ध किया गया है. लत के गठन के नाभिक accumbens में उपन्यास प्रोटीन का प्रतिलेखन पर निर्भर करता है, और मजबूतस्पष्ट रूप से संरचित प्रतिलेखन कार्यक्रमों की duction कोकीन अनुभव 15-19 निम्नलिखित एनएसी में मनाया जाता है. कोकीन प्रदर्शन करने के लिए तीव्र ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया मजबूत प्रेरण प्रोत्साहन के लिए अनुकूल है और नए प्रोटीन के उत्पादन को निर्देशित करने के क्रम में कई स्तरों पर कार्य करने की संभावना है कि दवा 6,19-22 के लिए जोखिम से प्रेरित संरचनात्मक और electrophysiological परिवर्तन के लिए जिम्मेदार हैं.

मस्तिष्क में अनुभव पर निर्भर plasticity की आणविक तंत्र के अध्ययन को बढ़ावा देने के क्रम में, एक प्रोटोकॉल व्यवहार हेरफेर निम्नलिखित मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों में प्रतिलेखन गतिशीलता के व्यापक विश्लेषण के लिए वर्णित है. ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए microfluidic गतिशील सरणियों उपयोग, कोकीन को व्यवहार संवेदीकरण - प्रोटोकॉल Citri प्रयोगशाला में अध्ययन व्यवहार अनुभव के संदर्भ में यह साफ है. वर्णित प्रोटोकॉल जाहिर टी का अध्ययन करने के लिए ही सीमित नहीं हैवह व्यवहार संवेदीकरण के संदर्भ में accumbens नाभिक है, लेकिन व्यवहार मानदंड और मस्तिष्क क्षेत्रों की एक बड़ी संख्या के लिए लागू किया जा सकता है. वास्तव में, इस प्रोटोकॉल मस्तिष्क के बाहर शरीर के ऊतकों को लागू किया जा सकता है, और अनुभवों या जीव की जोड़तोड़ की एक किस्म का अध्ययन किया.

प्रोटोकॉल मोटे तौर पर चार चरणों में बांटा गया है. पहले चरण में, पशु व्यवहार प्रतिमान के अधीन है; दूसरे चरण में ऊतक microdissected है; तीसरे चरण में - mRNA, शुद्ध-लिखित रिवर्स और जांच की, और अंतिम चरण में डेटा का विश्लेषण किया जाता है.

ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता के अध्ययन के संदर्भ में अनुभव के सटीक समय और परिभाषा नियंत्रित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक मापदंडों शायद रहे हैं. इस कारण से, चुनाव के हमारे व्यवहार मॉडल है कि कोकीन के लिए व्यवहार संवेदीकरण, अनुभव के मापदंडों से अधिक प्रयोगकर्ता नियंत्रण के उच्च स्तर में सक्षम बनाता है जो एक प्रणाली की हैCE. अनुभव पर निर्भर plasticity या स्मृति गठन के विभिन्न मॉडलों सटीक समय सक्षम और पता है कि अतिरिक्त व्यवहार मानदंड उपलब्ध हैं. इन मॉडलों को डर कंडीशनिंग 23, तीव्र पर्यावरण संवर्धन 24,25, उपन्यास वस्तु की खोज 26 और अंधेरे पालन 27 निम्नलिखित दृश्य अनुभव शामिल हैं. फिर भी, कोकीन को व्यवहार संवेदीकरण एक लगातार मजबूत व्यवहार हेरफेर कोकीन अनुभव 28 के बाद के महीनों के लिए रहता है, जो एक अत्यंत व्यापक स्मृति ट्रेस बनाने, है.

मस्तिष्क नाभिक accumbens की पुस्तिका microdissection द्वारा पीछा किया, sectioned है. यह तेजी से तैयार मस्तिष्क के स्लाइस से मार्गदर्शन microdissection व्यवहार प्रतिमान के लिए प्रासंगिक ऊतक निकालने का सबसे विश्वसनीय और तेजी से विधि प्रदान करता है कि हमारे अनुभव रहा है, और अनुभव के साथ, ऊतक की सीमाओं को मान्यता दी आसानी से स्पष्ट हो गया है और. वैकल्पिक रूप से, ठीक स्लाइस prepar हो सकता हैलेजर कब्जा microdissection द्वारा पीछा एड,. इस विधि अत्यधिक रुचि के क्षेत्र का चित्रण परिभाषित सक्षम बनाता है, यह, (इस प्रकार अस्थिर mRNA की हानि खतरे में डाल) थकाऊ धीमी है और महंगा समर्पित उपकरण (एक लेजर कब्जा सेटअप के साथ लगे एक माइक्रोस्कोप) की आवश्यकता है. यहां परिभाषित प्रोटोकॉल भी पैच pipettes 29 का उपयोग नेत्रहीन पहचान कोशिकाओं की कोशिका द्रव्य का मार्गदर्शन आकांक्षा से, एकल कोशिका ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. यह ज्यादातर मामलों में, ऊतक के भीतर कोशिकाओं की केवल एक subpopulation वास्तव में अनुभव का जवाब देने में शामिल रहे हैं कि बहुत संभव है, जबकि वर्णित प्रोटोकॉल एक जनसंख्या औसत प्रदान करता है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. यह अनुभव का जवाब देने के विशेष सेल आबादी के भीतर से एक चयनात्मक तरीके से प्रतिलेखन प्रोफाइल के लिए ब्याज की है, लेकिन इन तरीकों की चर्चा मौजूदा दायरे के बाहर है.

MRNA शुद्धि के लिए, रिवर्स प्रतिलेखन और qPCR क्वेरी, ऊतकव्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के उपयोग द्वारा पीछा ठीक सुई, के माध्यम से इसे पारित द्वारा बाधित है (अधिक जानकारी के लिए, 8 तालिका देखें). चुनाव उच्च गुणवत्ता शाही सेना और बहाव के अनुप्रयोगों से मजबूत परिणाम की विश्वसनीय निकासी सुनिश्चित जो इन तरीकों के साथ अनुभव द्वारा सूचित किया है.

प्रोटोकॉल गतिशील सरणियों का उपयोग उच्च throughput qPCR के लिए वर्णित है, वहीं नमूने अंत बिंदु पीसीआर, कम throughput qPCR, जीन अभिव्यक्ति प्रोटीन या गहरी अनुक्रमण का उपयोग जीन की अभिव्यक्ति के लिए जांच की जा सकती. उच्च throughput qPCR गतिशील सरणियों के उपयोग के लिए वरीयता mRNA व्यवहार मानदंड निम्नलिखित अक्सर सीमित मात्रा है मस्तिष्क नाभिक से प्राप्त है कि इस तथ्य के कारण है. गतिशील सरणियों एक ही प्रयोग में समानांतर नमूनों की एक बड़ी संख्या से टेप के कुशल व्यापक विश्लेषण सक्षम बनाता है एक मंच प्रदान करते हैं. Microfluidic प्रणाली की प्रारंभिक अधिग्रहण (सामान्यतः एक संस्थागत पु बादrchase), प्रयोगों को चलाने के लिए अपेक्षाकृत सस्ती हैं. इस विश्लेषण के बाद, नमूने के आगे क्वेरी गतिशील सरणियों गुणवत्ता आश्वासन के लिए एक व्यापक संदर्भ प्रदान करने के साथ (प्रोटीन या RNAseq द्वारा) उपन्यास टेप के लिए खोज करने के लिए और अधिक महंगा प्लेटफार्मों का उपयोग किया जा सकता है. अंत में, डेटा विश्लेषण के लिए, मानक दृष्टिकोण का उपयोग कर रहे हैं. उत्पन्न हो सकती है कि मुद्दों के संबंध में विशिष्ट संकेत प्रोटोकॉल के पाठ में चर्चा की जाएगी.

इस प्रोटोकॉल कई शर्तों और प्रतिकृति का अध्ययन ब्याज की अपनी प्रणाली की गहन जांच में रुचि जांचकर्ताओं के लिए सबसे उपयुक्त है. प्रोटोकॉल भी पहले से ही वे बार बार क्वेरी में रुचि रखते हैं, जो ब्याज के 50-500 जीन, के एक सबसेट पर (माइक्रोएरे या RNAseq प्रयोगों के माध्यम से) में honed है जो जांचकर्ताओं के लिए सबसे उपयुक्त है.

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Protocol

नोट: प्रोटोकॉल जेरूसलम के हिब्रू विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल दिशा निर्देशों के बाद.

ACSF समाधान के 1 तैयारी

  1. पानी या NaCl के उपयुक्त इसके साथ ~ 300 mOsm / एल परासारिता लाने, 1 टेबल में वर्णित है. ACSF समाधान तैयार DDH 2 ओ में 1 एल (> 18 MΩ शुद्धता) बनाते हैं.

2 उपकरण और कक्ष सेट करें

कोकीन प्रेरित हरकत व्यवहार की निगरानी के लिए उपकरण एक आंतरिक प्रकाश स्रोत, प्रशंसक और कैमरा (या अवरक्त सेंसर) के साथ तार व्यवहार कक्षों (50 x 45 सेमी) के होते हैं, और एक आंतरिक कड़ा बॉक्स (30 x 30 सेमी) में साथ लगाया जो चूहों उनकी हरकत पर नजर रखी है, जबकि आसानी से ले जाने की अनुमति है. व्यवहार परीक्षण एक नियमित रूप से प्रकाश / अंधेरे चक्र पर, रोशनी से पहले 1 घंटे के लिए पर रोशनी के बाद 1 घंटा के बीच बंद किया जाना चाहिए. पशु प्रत्येक दिन एक ही समय में लगातार प्रशिक्षित किया जाना चाहिए.

  1. घ्राण क्यू पूर्वाग्रह को रोकने के लिए और उचित कीटाणुशोधन सुनिश्चित करने के लिए, माउस सुविधा और / या गंध को दूर करने अभिकर्मक द्वारा प्रदान की कीटाणुनाशक के साथ एक परीक्षण के बाद कक्षों साफ करें.

महत्वपूर्ण: से निपटने जबकि चूहों, शांत शांत और सावधान रहना होगा.

3 पशु तैयारी

  1. हाउस 5 C57BL6 पुरुष चूहों, मानक और स्थानीय पशु की आवश्यकताओं के अनुसार एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र और भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ एक कमरे में पिंजरे प्रति (6-12 सप्ताह पुराने वजन की ~ 25-35 ग्राम),, समिति मार्गदर्शन और प्रोटोकॉल देखभाल. प्रयोग की शुरुआत से पहले, चूहों का वजन और डेटा लॉग इन करें. कोकीन बाद चूहों के वजन के हिसाब से किया जाता है.
  2. पहला परीक्षण शुरू करने से पहले व्यवहार कक्ष 30 मिनट में चूहों युक्त पिंजरों स्थानांतरण.
  3. सभी के अभ्यस्तप्रयोग में इस्तेमाल चूहों, इंजेक्शन से निपटने और व्यवहार सेटअप में निगरानी प्रयोगकर्ता को. नीचे वर्णित के रूप में यह 250 μl खारा की लगातार 3 दैनिक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा हासिल की है.
  4. 250 μl खारा की intraperitoneal इंजेक्शन प्रशासन. तुरंत इंजेक्शन के बाद, 15 मिनट के लिए हरकत गतिविधि पर नजर रखने के लिए एक व्यवहार कक्ष में माउस जगह है. प्रत्येक दिन एक ही समय पर, लगातार 3 दिनों के लिए यह कार्रवाई दोहराएँ.
  5. चौथे दिन, दो समूहों में चूहों को विभाजित. खारा में 2 मिलीग्राम / एमएल पर कोकीन की एक शेयर समाधान तैयार है. (- एक 30 ग्राम माउस 300 μl प्राप्त होगा, जबकि 250 μl इंजेक्षन एक 25 ग्राम माउस के लिए उदाहरण के लिए) माउस के वजन के अनुसार प्रयोगात्मक समूह में कोकीन समाधान (अंतिम 20 मिलीग्राम / किग्रा) की एक इंजेक्शन प्रशासन. नियंत्रण समूह में खारा प्रशासन. तुरंत इंजेक्शन के बाद, हरकत गतिविधि की निगरानी (typic के लिए एक व्यवहार कक्ष में 20 मिनट के लिए माउस जगहसहयोगी, पहले 15 मिनट) पर नजर रखी जाती है.
  6. कोकीन इंजेक्शन के बाद, अलग अलग समय बिंदुओं (इंजेक्शन के बाद 0, 1, 2, 4, 8 और 24 घंटे) में चूहों बलिदान. महत्वपूर्ण बात है, संदर्भ चूहों (0 समय बिंदु) इस दिन पर कोई इंजेक्शन प्राप्त नहीं होगा कि सुनिश्चित करें. कारण इसके महत्व को, यह संदर्भ समूह की प्रतिकृति शामिल करने के लिए आवश्यक है.

नाभिक accumbens की 4 विच्छेदन

  1. कोकीन / खारा इंजेक्शन के बाद उचित समय पर isoflurane के साथ चूहों anesthetize. isoflurane सीधे कमरे से बाहर निकाल दिया जाना चाहिए. इसलिए, प्रक्रिया एक रासायनिक धूआं हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
  2. रियर पैर पलटा परीक्षण द्वारा संज्ञाहरण की गहराई मॉनिटर. जानवर ने एक वापसी प्रतिक्रिया बटोर पंजा चुटकी. एक पलटा पता चलता है कि एक जानवर संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा के स्तर पर और नहीं एक राज्य euthanize करने में नहीं है.
  3. मस्तिष्क के निष्कर्षण:
    1. कत्ल के द्वारा माउस euthanize.
      2. <ली> खोपड़ी के केन्द्र से ऊपर त्वचा निकालें और तेज कैंची के साथ खोपड़ी में कटौती.
    2. रीढ़ की हड्डी मस्तिष्क (रंध्र मैग्नम) में प्रवेश करती है जहां बिंदु पर कैंची डालें और दो पार्श्व कटौती कर.
    3. एक ही बिंदु से, बाण के समान सीवन के साथ एक लंबे समय बाण के समान कटौती करने. बाईं ओर और सही करने के लिए घ्राण बल्ब, क्लिप तक पहुँचने पर.
    4. एक संदंश के साथ, पर प्रेस या मस्तिष्क को नुकसान नहीं ख्याल रख रही है, मजबूती से खोपड़ी के प्रत्येक आधा लोभी और टीम के लिए खींच, ध्यान से खोपड़ी को हटा दें.
    5. एक औंधा सूक्ष्म चम्मच रंग का उपयोग करके कपाल नसों विच्छेद जबकि मस्तिष्क निकालें.
  4. ठंडा होगा और कड़ा करने के लिए 1-2 मिनट के लिए एक बहुत ठंडा ACSF समाधान में मस्तिष्क रखें.
  5. व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा vibratome मंच पर, ऊपर का सामना करना पड़ के साथ, ACSF से मस्तिष्क निकालें एक कागज तौलिया के साथ अतिरिक्त तरल पदार्थ बाती, सेरिबैलम और मस्तिष्क के बाकी हिस्सों के बीच एक राज्याभिषेक कटौती बनाने और मस्तिष्क गोंद.
  6. एनएसी काटना: Vibratome का टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष में ठंडा तापमान पर ACSF समाधान बनाए रखें. नाभिक accumbens (एनएसी) तक 200 माइक्रोन पर धारा स्पष्ट रूप से Paxinos और फ्रेंकलिन माउस ब्रेन एटलस (शीर्षस्थान करने के लिए लगभग 1.8 मिमी पूर्वकाल के अनुसार पहचान की है, महासंयोजिका, पूर्वकाल संयोजिका के स्थान और आकार के आकार पर ध्यान देना और निलय, साथ ही मस्तिष्क खंड के समग्र आकृति विज्ञान). इस बिंदु पर, एनएसी विच्छेदित किया जाएगा जिसमें से दो 400 माइक्रोन वर्गों, बनाएँ.
  7. एक स्टिरियोस्कोप के तहत, स्लाइस से एनएसी क्षेत्र बाहर काटना ठीक एक ब्लेड का उपयोग करें. एनएसी की परिभाषा Paxinos और फ्रेंकलिन माउस ब्रेन एटलस के अनुसार है, और आसानी से ऊतक पर ब्लेड से चार त्वरित गुजरता द्वारा उचित वर्गों में विच्छेदित किया जा सकता है. (चित्रा 2).
  8. तुरंत एनएसी वर्गों एक microcentrifuge ट्यूब और दुकान में 900 μl Trizol सेल अभिकर्मक में -80 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना extr तक जगहकार्रवाई.

5 शाही सेना निष्कर्षण और सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन

  1. नाभिक युक्त ट्यूबों कमरे के तापमान पर TRIzol सेल अभिकर्मक में वर्गों accumbens पिघलना और ऊतक पूरी तरह से homogenized (कम से कम 15-20 बार) है जब तक 25 जी सुई से जुड़े एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ lysate homogenize. पहले कुछ राउंड मुश्किल हो जाता है, और सुई की नोक में प्रवेश कर सकता है कि छोटे टुकड़े करने के लिए इसे तोड़ने के क्रम में ट्यूब की दीवार के खिलाफ ऊतक धक्का की आवश्यकता होती है.
  2. Homogenization सुनिश्चित करने के लिए 1 मिनट के लिए 12,000 XG पर एक QIAshredder मिनी स्पिन स्तंभ और अपकेंद्रित्र में lysate pipet.
  3. Pipet नया microcentrifuge ट्यूब में lysate और निर्माता के निर्देशों के अनुसार शाही सेना निकालें. उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना स्टोर.
  4. , आरएनए एकाग्रता उपाय एक Bioanalyzer या समकक्ष उपकरण का उपयोग कर ईमानदारी और गुणवत्ता का विश्लेषण. आर के साथ सीडीएनए तैयारी के प्रत्येक दौर के लिए 100-500 एनजी शाही सेना का प्रयोग करेंandom hexamer प्राइमरों.

6 प्रथम डिजाइन और प्राइमर परीक्षण

  1. अच्छा प्राइमरों का चयन: mRNA टेप की qPCR के लिए एक इष्टतम प्राइमर जोड़ी के लिए, इन आवश्यकताओं (चित्रा 3) का पालन करें:
    1. 17-28 ठिकानों से नहीं रह युक्त डिजाइन प्राइमरों. वे mispriming को बढ़ावा देने के रूप में न्यूक्लियोटाइड दोहराता बचें.
    2. 56-68 डिग्री सेल्सियस (बेहतर 60-64 डिग्री सेल्सियस) के बीच तापमान के पिघलने (टी एम) के साथ डिजाइन प्राइमरों. प्राइमर जोड़ी के भीतर टी एम एक दूसरे के 1 डिग्री सेल्सियस के भीतर होना चाहिए.
    3. उत्पाद का आकार आदर्श 80 और 150bp के बीच होना चाहिए कि अवगत हो.
    4. जीनोमिक डीएनए contaminants के प्रवर्धन से बचने के लिए, प्राइमरों के कम से कम एक एक एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शन शामिल किया गया है, या amplicon (Intron फैले) एक बड़े Intron जिसमें सुनिश्चित करें.
    5. प्रथम डिजाइन में सुधार करने के क्रम में (उदाहरण 2 टेबल देखें) Primer3 पर आधारित एक विश्वसनीय सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
  2. जनसंपर्क का परीक्षणimers: प्राइमरों की विशिष्टता और दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, एक नियंत्रण qPCR प्रतिक्रिया प्रदर्शन किया जाना चाहिए:
    1. (सभी प्रासंगिक प्राइमर जोड़े के लिए सीडीएनए टेम्पलेट युक्त) एक सकारात्मक नमूना का प्रयोग करें और सीडीएनए टाइट्रेट (जैसे 10 एनजी ~ का एक प्रारंभिक एकाग्रता से आठ तीन गुना dilutions) डुप्लिकेट समानांतर प्रतिक्रियाओं में. प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया समाधान के भीतर प्रदूषण के लिए नियंत्रित करता है जो एक नहीं टेम्पलेट नियंत्रण, शामिल हैं.
    2. (- 1 / ढलान) -1 10 () 100 ×, इष्टतम ढलान की वक्र ऐसी है कि - 3.333 (यानी 10 (- 1 / 3.333) = 2) (चित्रा 4): सूत्र का उपयोग करके प्राइमर दक्षता की गणना.
    3. प्रवर्धन की विशिष्टता का निर्धारण करते हैं. विशिष्ट प्रवर्धन जबकि बंद लक्ष्य प्रवर्धन एक स्पष्ट विचलन fr के रूप में प्रकट होता है, प्रवर्धित उत्पादों के सभी पिघलने से घटता के लिए आम एक भी प्रमुख शिखर द्वारा प्रदर्शन किया हैएक बड़े शिखर ओम.

7 qPCR विश्लेषण

  1. पूर्व प्रवर्धन:
    1. व्यापक qPCR विश्लेषण प्राइमर जोड़े की एक बड़ी संख्या के साथ शाही सेना की मात्रा सीमित करने की समानांतर क्वेरी पर आधारित है. इसलिए, पूर्व प्रवर्धन के एक कदम जरूरी है. इस चरण में, सीडीएनए (800 प्राइमर जोड़े तक) भविष्य में नमूना क्वेरी के लिए उपयोग किया जाएगा कि सभी प्राइमरों का एक मिश्रण के साथ पूर्व प्रवर्धन की 14-18 चक्र आए.
    2. विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन (एसटीए) के लिए 50 माइक्रोन तक ते (कम EDTA) में सभी प्राइमरों पतला.
    3. पूल में एक साथ 50 माइक्रोन प्राइमर का सब से 1 μl aliquots 800 assays के लिए ऊपर, एसटीए प्रतिक्रिया में शामिल करने के लिए सेट.
    4. तालिका 3 में वर्णित है. एसटीए के लिए पूर्व मिश्रण और नमूने तैयार परिलक्षित होने की जरूरत है कि नमूनों की संख्या की 110% के लिए मिश्रण तैयार करके त्रुटि के लिए अनुमति दें.
    5. प्रत्येक नमूने के लिए विभाज्य 3.75 μl एसटीए पूर्व मिश्रण. 1.25 μl जोड़ेंप्रत्येक के लिए सीडीएनए की.
    6. भंवर 10 सेकंड के लिए प्रतिक्रियाओं और अपकेंद्रित्र मिश्रण करने के लिए.
    7. तालिका 4 में संकेत के रूप में एक थर्मल cycler और चक्र में एसटीए प्रतिक्रियाओं रखें.
  2. Exonuclease मैं (ExoI) उपचार:
    1. 5 तालिका में संकेत के रूप में Exo मैं पतला.
    2. प्रत्येक 5 μl एसटीए प्रतिक्रिया के लिए पतला ExoI (4 यू / μl) के 2 μl जोड़ें, भंवर, 37 में एक थर्मल cycler में (6000 XG>) नीचे स्पिन और जगह डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए और फिर 15 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर.
    3. परीक्षण के लिए एक उपयुक्त एकाग्रता के लिए अंतिम उत्पाद पतला. उपयोग ते बफर (7 μl टीएसए नमूने के 43 μl ते बफर जोड़ने).
    4. -20 डिग्री सेल्सियस पर पतला एसटीए उत्पादों की दुकान या तुरंत का उपयोग करें.
  3. QPCR के लिए प्राइमर और नमूना सेटअप:
    1. 6 तालिका में दिखाया गया है. नमूने तैयार प्रयोग के लिए चुना चिप के अनुसार मिश्रण तैयार करें, और उचित रूप में नमूने जोड़ें.
    2. आंदोलन20 सेकंड का एक न्यूनतम के लिए नमूना मिक्स समाधान टेट, और अपकेंद्रित्र (> 6000 XG) में कम से कम 30 सेकंड के लिए. चिप लोड करने के लिए तैयार है जब तक तैयार प्रतिक्रियाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर कम अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता है.
    3. तालिका 7 में वर्णित के रूप में assays तैयार करें.
    4. सभी घटकों के नीचे स्पिन करने के लिए कम से कम 30 सेकंड के लिए 20 सेकंड और अपकेंद्रित्र (> 6000 XG) की एक न्यूनतम के लिए परख मिक्स आंदोलन.
      महत्वपूर्ण: अच्छी तरह से भंवर और अपकेंद्रित्र चिप inlets में pipetting से पहले सभी नमूना और परख समाधान. ऐसा करने में विफलता डेटा की गुणवत्ता में कमी हो सकती है.
      नोट: प्रत्येक प्राइमर के अंतिम एकाग्रता इनलेट में 5 माइक्रोन और अंतिम प्रतिक्रिया में 500 एनएम है.
  4. भड़काना और गतिशील ऐरे आईएफसी (एकीकृत fluidic सर्किट) चिप लोड हो रहा है. आईएफसी चिप (Figu microfluidic कक्षों पर दबाव डालने के लिए इस्तेमाल किया नियंत्रण रेखा द्रव (खनिज तेल) के लिए नमूने और assays के लिए inlets, साथ ही निर्दिष्ट inlets (बिजली) है) -4 ए पुन.
    1. चिप पर प्रत्येक संचायक में नियंत्रण रेखा द्रव इंजेक्षन.
    2. निकालें और चिप के नीचे से नीले सुरक्षात्मक फिल्म त्यागें.
    3. उचित आईएफसी नियंत्रक में चिप प्लेस (नियंत्रक एमएक्स 48.48 गतिशील ऐरे आईएफसी या 96.96 गतिशील ऐरे आईएफसी के लिए आईएफसी नियंत्रक सेमी के लिए), तो 48.48 गतिशील ऐरे आईएफसी या प्रधानमंत्री (136x) के लिए प्रधानमंत्री (113x) स्क्रिप्ट चलाने प्रधानमंत्री चिप के क्रम में 96.96 गतिशील ऐरे आईएफसी के लिए स्क्रिप्ट.
    4. स्क्रिप्ट समाप्त हो गया है, आईएफसी नियंत्रक से primed चिप हटा दें.
    5. पिपेट प्रत्येक परख मिक्स के 5 μl और उनके inlets में प्रत्येक नमूने मिक्स के 5 μl.
    6. आईएफसी नियंत्रक चिप लौटें.
    7. आईएफसी नियंत्रक सॉफ्टवेयर का प्रयोग, 48.48 गतिशील ऐरे आईएफसी के लिए लोड मिक्स (113x) स्क्रिप्ट चलाने) या 96.96 गतिशील ऐरे आईएफसी चिप में नमूनों और assays लोड करने के लिए मिक्स (136x) स्क्रिप्ट लोड. लोड मिक्स स्क्रिप्ट लिया है, जब भार को दूरआईएफसी नियंत्रक से एड चिप.
    8. पिघलने वक्र विश्लेषण सहित, (निर्माता दिशा निर्देशों के अनुसार) एक नई चिप रन बनाने के लिए, थर्मल cycler पर चिप लोड करें. थर्मल cycler सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, प्रतिक्रिया कक्षों ठीक से मान्यता प्राप्त कर रहे हैं कि सुनिश्चित करने, और प्रतिक्रिया पूरा करने के लिए चलाने के लिए अनुमति देते हैं.

8 डेटा विश्लेषण

  1. गुणवत्ता आश्वासन:, डेटा गुणवत्ता सुनिश्चित (ऊपर वर्णित) के कमजोर पड़ने से घटता संबोधित द्वारा प्राइमरों की गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए. Amplicons के पिघलने से घटता देखकर प्रवर्धन की विशिष्टता मॉनिटर, जो की चोटियों बेहतर कसकर 29 गठबंधन किया जाना चाहिए.
  2. दृश्य: उच्च throughput qPCR द्वारा प्राप्त आंकड़ों की बड़ी मात्रा के दृश्य के लिए, उपयोग सॉफ्टवेयर में जो अभिव्यक्ति रंग कोडित तीव्रता से है, heatmaps उत्पन्न. इसके अलावा, लाइन में खड़ा बिखराव भूखंडों के रूप में एक जीन की ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता प्रदर्शित करते हैं.
  3. प्रकाशन: प्रकाशन मेंजीन एक्सप्रेशन परिणाम, यह अपनी प्रासंगिकता, सटीकता, सही व्याख्या, और reproducibility सुनिश्चित करने के लिए एक qPCR प्रयोग के लिए सूचित किया जाना चाहिए कि कम से कम जानकारी का ब्यौरा, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर प्रयोगों के प्रकाशन के लिए MiQE दिशानिर्देश का पालन करने की सलाह दी है.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल को लागू करने से प्राप्त परिणामों की गुणवत्ता महत्वपूर्ण मापदंडों की एक संख्या पर निर्भर करता है. उचित प्रयोगात्मक नियोजन प्रयोगात्मक चूहों को न्यूनतम अशांति, में परिणाम होगा इस तरह के परीक्षण अनुभव (इस उदाहरण में, कोकीन के लिए जोखिम की है कि) उनके हाल के इतिहास में सबसे प्रमुख अनुभव होगा, और इसलिए एक मजबूत और विशिष्ट ट्रांसक्रिप्शनल में परिणाम होगा कि कार्यक्रम. चित्रा 1 नाभिक चूहों से विच्छेदित और विश्लेषण किया जाता है accumbens जिस पर कोकीन अनुभव निम्न समय बिंदुओं को परिभाषित करने, कोकीन को व्यवहार संवेदनशील बनाने के लिए प्रायोगिक योजना का वर्णन है. अगले महत्वपूर्ण बात यह है कि विश्लेषण के लिए उचित ऊतक के छांटना के लिए सटीक सीमाओं को परिभाषित करने की है. 2 राज्याभिषेक और बाण के समान वर्गों में नाभिक accumbens की सीमाओं का वर्णन चित्रा. एनएसी के ऊतकों की एक पतली मार्जिन क्षेत्र Tak से बाहर रखा गया है कि अधिमानतः विच्छेदन ऐसे प्रदर्शन किया जाना चाहिएरूपरेखा के लिए एन. यह केवल एनएसी के अनुरूप रूपरेखा, कम करने परिवर्तनशीलता और आसपास के ऊतकों के शामिल किए जाने से उत्पन्न होने वाली कलाकृतियों के लिए क्षमता प्रदान करता है.

छोटे मस्तिष्क नाभिक के विच्छेदन के रूप में शाही सेना की मात्रा सीमित amplifying जब, प्रवर्धन की कई चक्रों संकेत का उचित पता लगाने के लिए आवश्यक हैं. इसलिए शुरू सामग्री की कम मात्रा के साथ कार्य करते समय आगे परिलक्षित किसी भी मात्रात्मक पीसीआर प्रयोग में एक महत्वपूर्ण बिंदु, प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों के लक्षण वर्णन है. 3 इष्टतम प्राइमरों परिभाषित करने में प्रमुख विशेषताओं का वर्णन करता है, और चित्रा 4 प्राइमरों के प्रवर्धन घटता निर्देशित दर्शाता चित्रा C-Fos और FosB के खिलाफ, इन प्राइमर जोड़े हर चक्र में ~ 100% दक्षता के साथ अपने लक्ष्य प्रतिलेख प्रदर्शन बढ़ाना है. प्राइमर मान्यता और उचित प्रयोगात्मक प्रतिमान की स्थापना के बाद लक्ष्य टीआईएसएस से ट्रांसक्रिप्शन का स्पष्ट निर्धारण सक्षम करने के लिएUE, व्यापक विश्लेषण (; चित्रा 5 96.96 प्रारूप में) 9216 समानांतर qPCR प्रतिक्रियाओं अप करने के लिए सक्षम करने, Fluidigm Biomark मंच पर प्रदर्शन किया जा सकता है. यह उच्च throughput मंच एक एकल चिप पर समान प्रयोगात्मक शर्तों का उपयोग, कई प्रयोगात्मक दोहराव की समानांतर विश्लेषण में सक्षम बनाता है. C-Fos और FosB तीव्र कोकीन अनुभव निम्न में से ट्रांसक्रिप्शनल प्रेरण संबोधित चौगुनी प्रयोगात्मक दोहराव के लिए डेटा, चित्रा 6 में प्रदर्शन कर रहे हैं.

चित्रा 1
कोकीन अनुभव निम्नलिखित गतिशील ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण के लिए चित्रा 1 प्रयोगात्मक प्रतिमान. (ए) प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल - एक ध्वनि attenuating व्यवहार कक्ष में वीडियो ट्रैकिंग द्वारा हरकत गतिविधि की निगरानी करते हुए चूहों, 3 दिनों के लिए हैंडलिंग और इंजेक्शन के आदी रहे हैं. चूहेकोकीन अनुभव करने के लिए तो अधीन हैं; एक जोखिम = तीव्र कोकीन अनुभव; 5 लगातार इंजेक्शन पुरानी जोखिम कहा जाता है. कोकीन से संयम की ≥16 दिनों निम्नलिखित एक इंजेक्शन एक कोकीन चुनौती करार दिया है. खारा इंजेक्शन के 3 दिन या खारा + एक के 3 दिन के निम्न व्यवहार कक्ष के भीतर माउस ट्रैक के transcriptional गतिशीलता कोकीन अनुभव (1, 2, 4, 8, 24 घंटा) निम्नलिखित विभिन्न प्रयोगात्मक समय बिंदुओं पर संबोधित कर रहे हैं. (बी) के प्लॉट एक तीव्र कोकीन जोखिम. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
माउस मस्तिष्क में नाभिक accumbens की 2. स्थान चित्रा. मोटी सफेद लाइनों बी परिभाषित कटौती के स्थान चिह्नित . (बी) बाण के समान अनुभाग, एनएसी (ए) राज्याभिषेक अनुभाग के oundaries. (तस्वीरें एलन ब्रेन एटलस संदर्भ एटलस से अनुकूलित छवियाँ:. नि: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=1&plate=100960352 , नि: //atlas.brain- map.org/atlas?atlas=2&plate = 100883869 ). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
3 योजना qPCR प्राइमरों चित्रा. विशिष्टता, स्थिरता और अनुकूलता के लिए परिभाषा के साथ, qPCR प्राइमरों योजना बनाने के लिए दिशानिर्देश. 2fig3highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
प्राइमर दक्षता के 4 चित्र आकलन. Fluidigm आईएफसी सरणियों का उपयोग Fos और FosB के प्रवर्धन घटता (ए) का परिणाम है. एक मानक वक्र माउस एनएसी से निकाला और Fos और FosB की अभिव्यक्ति के लिए जांच की कुल शाही सेना के सात सीरियल 3 गुना dilutions का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था. (बी) Fos और FosB के लिए प्राइमर जोड़ी की दक्षता (चक्र दहलीज मूल्य की साजिश रचने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था नमूना के गुना कमजोर पड़ने के लघुगणक के खिलाफ प्रत्येक कमजोर पड़ने पर सीटी). पाठ के रूप में परिभाषित प्राइमरों की दक्षता, मानक वक्र के ढलान से गणना कर रहे हैं. कमजोर पड़ने वक्र पर प्रवर्धन घटता है और अंक रंग मेल कर रहे हैं.51642 / 51642fig4highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
Fluidigm मंच लागू करने चित्रा 5 व्यापक qPCR रूपरेखा. (ए) वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर के लिए 96.96 गतिशील ऐरे आईएफसी. प्राइमरों दाएं में स्थित inlets में लोड कर रहे हैं, और नमूने चिप के बाईं ओर में स्थित inlets में लोड कर रहे हैं. यह आंकड़ा Fluidigm रीयल टाइम पीसीआर विश्लेषण उपयोगकर्ता गाइड से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है. अच्छी तरह से चिप पर प्रत्येक के लिए सीटी मूल्यों का प्रतिनिधित्व qPCR परिणाम (बी) गर्मी नक्शे,. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा एक तीव्र कोकीन प्रदर्शन के बाद अभिव्यक्ति की गतिशीलता के 6 नमूना का परिणाम है. C-Fos और FosB की कोकीन प्रेरित अभिव्यक्ति समय के एक समारोह के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं. यहां परिभाषित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन चौगुनी प्रयोगात्मक दोहराव, का मूविंग, मतलब की मानक त्रुटि चित्रित त्रुटि सलाखों के साथ साथ प्रदर्शित कर रहे हैं.

अभिकर्मक मेगावाट मिमी जी / एल
NaCl (सिग्मा Aldrich, 71376) 58.44 119 6.95
3 NaHCO (सिग्मा Aldrich, S6014) 84.01 26 2.18
ग्लूकोज (सिग्मा Aldrich, G8270) 180.16 10 1.8
KCl (सिग्मा Aldrich, P9541) डी> 74.55 2.5 0.186
नाह 2 पीओ 4 (सिग्मा Aldrich, S9638) 137.99 1 0.138
4 MgSO ⋅7H 2 ओ (सिग्मा Aldrich, M1880) 246.5 4 0.99
2 CaCl (सिग्मा Aldrich, C3011) 147 4 0.59

तालिका 1 ACSF समाधान.

सॉफ्टवेयर का नाम आवेदन वेब स्थान
रॉश Probefinder प्राइमरों डिजाइन http://qpcr.probefinder.com/organism.jsp
एन सी बी आई प्राइमर विस्फोट प्राइमरों डिजाइन http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
ve_content "> तालिका 2 सॉफ्टवेयर की सूची.

अभिकर्मक वॉल्यूम / रिएक्शन (μl) + 10% बढ़ा हुआ 48 प्रतिक्रियाओं (μl) के लिए वॉल्यूम + 10% बढ़ा हुआ 96 प्रतिक्रियाओं (μl) के लिए वॉल्यूम
2X TaqMan preamp मास्टर मिक्स (एप्लाइड Biosystems) 2.5 132 264
500 एनएम (10X) जमा प्राइमर मिश्रण 1 52.8 105.6
जल 0.25 13.2 26.4
सीडीएनए 1.25
कुल मात्रा 5

3 तालिका एसटीए रिएक्शन समाधान.

हालत पकड़ो 10-14 साइकिल पकड़ो
तापमान 95 डिग्री सेल्सियस 95 डिग्री सेल्सियस 60 डिग्री सेल्सियस 4 डिग्री सेल्सियस
समय 10 मिनट 15 सेकंड 4 मिनट ∞

टेबल पूर्व प्रवर्धन के लिए 4 थर्मल चक्र की स्थिति.

घटक 5 μL नमूना प्रति (μl) अधिक बढ़ा हुआ साथ 48 नमूने (μl) अधिक बढ़ा हुआ साथ 96 नमूने (μl)
जल 1.4 84 168
Exonuclease मैं प्रतिक्रिया बफर 0.2 12 24
20 इकाइयों में exonuclease मैं / μl 0.4 24 48 </ TD>
कुल मात्रा 2.0 120 240

सारणी 5 ExoI प्रतिक्रिया समाधान.

<Tr />
नमूना मिक्स इनलेट प्रति घटक वॉल्यूम (μl) अधिक बढ़ा हुआ साथ इनलेट प्रति खंड (μl) 48.48 गतिशील ऐरे आईएफसी (μl) के लिए वॉल्यूम (120 नमूने) 96.96 गतिशील ऐरे आईएफसी (μl) के लिए वॉल्यूम (120 नमूने)
2X SsoFast कम rox साथ EvaGreen Supermix (जैव रेड, 5211 पी.एन. 172-) 2.5 3 180 360
20X डीएनए बाध्यकारी डाई नमूना लोड हो रहा अभिकर्मक (Fluidigm, 3738 पी.एन. 100) हरी टोपी 0.25 0.3 18 36
एसटीए और ExoI इलाज नमूना 2.25 2.7
कुल 5 6

6 तालिका नमूना पूर्व मिक्स समाधान.

टेबल 7 परख मिक्स समाधान.

घटक इनलेट प्रति खंड (μl) अधिक बढ़ा हुआ साथ इनलेट प्रति खंड (μl) 48.48 गतिशील ऐरे आईएफसी (μl) के लिए वॉल्यूम 96.96 गतिशील ऐरे आईएफसी (μl) के लिए वॉल्यूम
2X परख लोड हो रहा है अभिकर्मक 2.5 3 180 360
1X डीएनए निलंबन बफर (ते कम EDTA) 2 2.4 144 288
50 माइक्रोन प्रत्येक मिश्रित आगे और रिवर्स प्राइमर 0.5 0.6
कुल मात्रा 5 6
अभिकर्मक / सामग्री के नाम कंपनी सूची संख्या
Virusol Oriek चिकित्सा J29D
Isoflurane, खासियत 100% MINRAD कांग्रेस एनडीसी 60307-110-25
RNeasy प्लस यूनिवर्सल मिनी किट QIAGENE 73,404
QIAshredder QIAGENE 79,654
उच्च क्षमता सीडीएनए रिवर्स प्रतिलेखन किट Invitrogene अटल बिहारी-4368814
ते बफर Invitrogene 1355656

रसायन / अभिकर्मकों की तालिका 8 सूची.

उपकरण का नाम कंपनी सूची संख्या
व्यवहार चैंबर (MDF, 50 x 45 सेमी) स्व इकट्ठे
इनर Perspex बॉक्स (30 x 30 सेमी) स्व इकट्ठे
कैमरा और वीडियो रिकॉर्डर Campden संस्थान CMD-80051
मीडिया रिकॉर्डर सॉफ्टवेयर Noldus एनडीएस-NMR3-00M
परितारिका कैंची एफ एस टी एफ एस टी-14062-09
Vibratome Campden इंस्ट. 7000SMZ -2
Bioanalyzer टेक्नोलॉजीज Agilent 2100 Bioanalyzer
थर्मल cycler जैव रेड 1852048
उल्टे MICROSPUN रंग Bochem साधन जीएमबीएच 3213
Biomark एच.डी. पुनader Fluidigm BMHD-BMKHD
96.96 जीन की अभिव्यक्ति के लिए गतिशील सरणी चिप Fluidigm BMK-M-96.96

टेबल 9 उपकरणों की सूची.

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Discussion

व्यवहार मानदंड निम्नलिखित मस्तिष्क के ऊतकों से जीन अभिव्यक्ति के सफल लक्षण वर्णन पर निर्भर करता है: व्यवहार प्रतिमान के दौरान चूहों का 1) सावधानी से निपटने; ब्याज की ऊतक के 2) त्वरित और सटीक विच्छेदन; 3) आरएनए सुरक्षित उपाय शाही सेना की अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए; और 4) सावधान प्राइमरों और प्रयोगात्मक लेआउट की योजना बनाने के साथ ही qPCR विश्लेषण के लिए तैयारी में विस्तार करने के लिए सटीक और ध्यान.

वर्णित प्रक्रिया का उद्देश्य एक व्यवहार अनुभव से प्रेरित ट्रांसक्रिप्शनल घटनाओं की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए है; इसलिए, सावधान ध्यान माउस द्वारा अनुभवी व्यवहार प्रतिमान वास्तव में अनुसंधानकर्ता द्वारा इरादा अनुभव का प्रतिनिधित्व करता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है. उदाहरण के लिए, यहां तक ​​कि कोकीन को व्यवहार संवेदीकरण के रूप में इस तरह के एक सरल प्रतिमान में, माउस का अनुभव कई कारकों से प्रभावित हो सकता है: पूर्व से पहले घर पिंजरे में माउस का पूर्व अनुभवperiment; प्रायोगिक कक्ष को हस्तांतरण विधि; प्रयोगात्मक कमरे में रोशनी, ध्वनि और गंध जोखिम; प्रयोगकर्ता से निपटने का अनुभव; आईपी ​​इंजेक्शन की वजह से दर्द / असुविधा; एक उपन्यास प्रयोग करने के लिए जोखिम है, और इच्छामृत्यु की बात करने के लिए निर्दिष्ट व्यवहार निम्न अनुभव. इन अनुभवों में से हर एक, अलगाव में, माउस के मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों में ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रमों के शामिल होने को बढ़ावा देने सकता है. इसलिए, देखभाल ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रम वांछित प्रतिमान है कि उपायों को सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए, और epiphenomena प्रतिमान के साथ जुड़ा हुआ नहीं. कोकीन अनुभव के मामले में, यह आसानी से माउस के बजाय कोकीन को इंजेक्ट किया जाता है सावधान प्रयोग और विस्तार पर ध्यान है, साथ ही सभी मापदंडों स्थिर रखा जाता है जिसमें एक साधारण नियंत्रण प्रयोग,, लेकिन वाहन (खारा) द्वारा हासिल की है. हमारे अनुभव में, खारा इंजेक्शन की तुलना में बहुत सीमित पैमाने की एक ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रम लातीकोकीन जोखिम, प्रतिमान भारी ब्याज की घटना की जांच के लिए सक्षम बनाता है कि प्रदर्शन है.

यह चूहों की शांत और सावधानी से निपटने की जरूरत महसूस, अभी भी सक्रिय है, जबकि अत्यंत सावधानी माउस के अनुभवों की सीमा को सीमित करने के लिए लिया जाना चाहिए. इसके विपरीत, संज्ञाहरण के बाद, तेजी से और सटीक काम के संभावित कारण कोशिकाओं बाधित कर रहे हैं एक बार तेजी से अपमानित किया जा सकता है, जो (मिनट की timescale पर) शाही सेना के प्रतिनिधित्व में तेजी से बदलाव और शाही सेना की आंतरिक lability के लिए क्षमता, के लिए आवश्यक है अनुभव से प्रेरित ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल में खलल न डालें. यह (1-2 मिनट के भीतर) एक ठंडा वातावरण को जल्दी से खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाने और तेजी से ठंडा परिस्थितियों में एनएसी टुकड़े करना इसलिए महत्वपूर्ण है. मस्तिष्क ठंडा हो जाने के बाद, ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन या आरएनए गिरावट के लिए संभावित काफी कम कर रहे हैं, लेकिन प्रासंगिक वर्गों TRIzol अभिकर्मक में रखा जाता है केवल जब और जमे हुए, मैंएस ऊतक की अखंडता और ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफ़ाइल के प्रतिनिधित्व सुनिश्चित किया.

इस संदर्भ में, यह उत्तेजना के बाद पहले 1 घंटा बढ़ता जा अक्सर, तत्काल जल्दी जीन अभिव्यक्ति की ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता एक तेजी से समय पैमाने पर होता उल्लेखनीय है कि सार्थक है. वर्णित प्रयोगात्मक प्रतिमान के संदर्भ में, ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता से पूछताछ के नमूनों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के क्रम में कुछ घंटे के पैमाने तक सीमित है. बार में कम से कम 1 घंटे के लिए, समय में छोटे बदलाव मनाया ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन की भयावहता में बड़े बदलाव में परिणाम सकता है. इस समय बिंदु परिशुद्धता के साथ प्रदर्शन करने के लिए आसान प्रयोगात्मक है, और प्रयोग में कुछ ही मिनटों के अंतर के स्तर पर बदलाव के लिए कम संभावना है क्योंकि इसलिए 1 घंटा समय बिंदु, विश्लेषण के लिए चुना गया है.

परंपरागत रूप से, एक ऊतक micropunch ऊतकों के नमूनों की विच्छेदन के लिए कई प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है. वहाँऊतक के मार्गदर्शन microdissection तरजीह देने के कारणों की एक संख्या हैं. पंच सामान्य रूप से स्टेनलेस स्टील का बना है और पारदर्शी नहीं होता है. इसलिए एक सटीक और सुसंगत स्थान में पंच स्थिति मुश्किल हो सकता है. इसके अलावा, पंच प्रारंभिक स्थिति में एक गलती अगर वहाँ किसी भी सुधार के लिए किए जाने की अनुमति नहीं है. अंत में, पंच के भीतर से ऊतक की निकासी कभी कभी मुश्किल साबित, और ऊतकों को खोने के लिए क्षमता है, या ले जाने से अधिक नमूनों के बीच कर सकते हैं. ठीक एक स्केलपेल का उपयोग ऊतक की Microdissection प्रयोगकर्ता अधिक सटीक नियंत्रण सक्षम बनाता है और नमूनों की शुद्धता के बारे में सुरक्षा प्रदान करता है.

शाही सेना निकासी के दौरान और ऊपर सीडीएनए संश्लेषण, काम पर्यावरण RNase contaminants के सूत्रों से मुक्त रखा जाना चाहिए, और काम RNase नि: शुल्क उपकरण, disposables और अभिकर्मकों का उपयोग किया जाना चाहिए जब तक. इस स्तर पर, सबसे छोटी संदूषण शाही सेना के नमूने आसानी से भ्रष्ट मेहनत की कमाई कर सकता है. नमूने मैं रखते हुएCE ठंड ट्रांसक्रिप्शनल readout संशोधित कर सकता है, साथ ही नमूना अखंडता को प्रभावित कर सकता है कि enzymatic गतिविधि को कम करने के लिए है कि तंत्रिका गतिविधि को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. अतिरिक्त औषधीय inhibitors कभी कभी तंत्रिका excitability कम करने के लिए जोड़ रहे हैं, लेकिन अक्सर इन आवश्यक नहीं कर रहे हैं.

सीडीएनए के लिए रिवर्स प्रतिलेखन के बाद, जोर टेप की व्यापक रूपरेखा से प्राप्त परिणामों की वैधता सुनिश्चित करने के लिए उत्तेजित करता है. पहला कदम है जिसके लिए यह बेहद शाही सेना का एक परिभाषित स्रोत के कमजोर पड़ने से घटता पर प्राइमर दक्षता और विशिष्टता का परीक्षण करने की सिफारिश की है, उचित qPCR प्राइमरों उपयोग किया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए है. इष्टतम पीसीआर प्राइमरों लक्ष्य के विशिष्ट और कुशल प्रवर्धन प्रदान करते हैं. विशिष्ट प्रवर्धन कुशल प्रवर्धन प्रत्येक चक्र में, लक्ष्य अनुक्रम की मात्रा का तात्पर्य है कि जबकि प्रवर्धन, स्पष्ट पिघलने वक्र विश्लेषण में एक भी असतत चोटी के रूप में, केवल लक्ष्य अनुक्रम का तात्पर्य है कि100% approximating दक्षता के साथ दोहराया. क्योंकि microfluidic qPCR चिप्स के उच्च throughput प्रकृति के कारण, इन प्रयोगों सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण की एक महत्वपूर्ण संख्या के शामिल किए जाने को सुनिश्चित करने के लिए सावधान योजना की आवश्यकता है. यह नियंत्रण और प्रयोगात्मक शर्तों से परिणामों की सीधी तुलना सक्षम करने, हर चिप समय में लगातार नियंत्रण शामिल करने के लिए बेहतर है. प्रयोग की स्थापना के दौरान, यह नहीं पार दूषित कुओं के लिए महत्वपूर्ण है. गलत कुएं में प्राइमरों की छोटी राशि अवांछित लक्ष्य के प्रवर्धन का कारण बन सकता चूंकि प्राइमरों pipetting जब, अतिरिक्त ध्यान रखा जाना चाहिए.

मस्तिष्क से सबसे ऊतकों के नमूनों के लिए यह विच्छेदन के दौरान ब्याज की ही ऊतक परिणामों का विश्लेषण उलझाना सकता है जो अप्रासंगिक मस्तिष्क क्षेत्रों का कोई संदूषण के साथ, निकाला गया था कि निश्चित होना मुश्किल है. इस प्रयोजन के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण जिनकी अभिव्यक्ति से बाहर रखा होने की उम्मीद है जीनों के लिए जांच कर रही हैब्याज की ऊतक. जीन अभिव्यक्ति के स्थानिक पैटर्न की पहचान करने के लिए एक उपयोगी उपकरण एलन ब्रेन एटलस (है http://www.brain-map.org/ ).

डेटा विश्लेषण का पूरी तरह से चर्चा इस प्रकाशन के दायरे से बाहर है, यह है कि सावधान प्रयोग वारंट सावधान विश्लेषण ध्यान दिया जाना चाहिए. यह प्रासंगिक संदर्भ जीनों के एक नंबर qPCR के हर दौर में शामिल हैं जो सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. ये जीन शाही सेना की समान मात्रा assayed किया जा रहा है कि यह सुनिश्चित करने के क्रम में सामान्य बनाने के लिए काम करेगा. सामान्य "ΔΔCt विधि" लागू करने, प्रयोग ("समय 0") के लिए संदर्भ चूहों को तो नमूना भीतर संदर्भ जीन को पहली बार प्रदर्शन किया, और है.

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल चूहों के नाभिक accumbens में कोकीन अनुभव निम्नलिखित ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता के अध्ययन के उद्देश्य से है. हालांकि, यह बहुत आसानी से adapte हैमाउस के किसी भी अन्य अनुभव के अध्ययन के लिए विकास, के रूप में लंबे समय के उचित नियंत्रण लागू किया जाता है, और अनुभव के समय अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है. जाहिर है, इस प्रोटोकॉल के रूप में भी अच्छी तरह से तंत्रिका तंत्र के बाहर ऊतकों में प्रतिलेखन की गतिशीलता के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है.

यह microfluidic आधारित qPCR का उपयोग व्यापक ट्रांसक्रिप्शनल रूपरेखा ट्रांसक्रिप्शनल घटनाओं की रूपरेखा का एक लागत प्रभावी तरीका है, लेकिन ब्याज की लक्ष्य जीन के पूर्व ज्ञान पर निर्भर करता है कि जोर दिया जाना चाहिए. ये आम तौर पर इस तरह के प्रोटीन और गहरी अनुक्रमण के रूप में निष्पक्ष रूपरेखा तरीकों, के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं. इसलिए, एक बड़ी परियोजना की कार्यप्रवाह में, व्यापक qPCR रूपरेखा डेटा के थोक प्रदान कर सकता है, लेकिन preferentially प्रणाली के एक पूर्व निष्पक्ष लक्षण वर्णन का पालन करना चाहिए.

यह ऊतक के नमूने प्राप्त करने के लिए साथ साथ वर्णित प्रक्रिया भी अध्ययन की दिशा में लागू किया जा सकता है कि बताते हुए भी लायक हैप्रोटिओमिक्स और प्रोटीन संशोधनों, Metabolomics, lipidomics और epigenetic निशान - अन्य सेलुलर घटनाओं की एक किस्म आईएनजी.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Virusol Oriek Medical J29D
Isoflurane, USP 100% MINRAD INC NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit QIAGEN 73404
QIAshredder QIAGEN 79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit Invitrogen AB-4368814
TE Buffer Invitrogen 1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm) Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm) Self assembled
Camera and video recorder Campden Inst. CMD-80051
Media Recorder software Noldus NDS-NMR3-00M
Iris Scissors FST FST-14062-09
Vibratome Campden Inst. 7000SMZ-2
Bioanalyzer Agilent Technologies The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler Bio-Rad 1852048
Inverted microspoon spatula Bochem Instrument GmbH 3213
Biomark HD Reader Fluidigm BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression Fluidigm BMK-M-96.96

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References

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व्यवहार अंक 90 मस्तिष्क व्यवहार शाही सेना प्रतिलेखन नाभिक accumbens कोकीन उच्च throughput qPCR अनुभव पर निर्भर plasticity जीन विनियामक नेटवर्क microdissection
व्यवहार अनुभव के बाद मस्तिष्क के नमूनों से ट्रांसक्रिप्शन गतिशीलता के व्यापक विश्लेषण
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Turm, H., Mukherjee, D., Haritan, D., Tahor, M., Citri, A. Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience. J. Vis. Exp. (90), e51642, doi:10.3791/51642 (2014).

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