Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Использование флуоресцентных белков для мониторинга Glycosome Динамика в африканском трипаносомы

doi: 10.3791/51647 Published: August 19, 2014

Abstract

Trypanosoma brucei является kinetoplastid Паразит, вызывающий африканским трипаносомозом человека (HAT), или сонная болезнь, и изнуряющая болезнь, Нагана, у крупного рогатого скота 1. Паразит чередует кровоток хозяина млекопитающих и мухи вектора лету. Состав многих клеточных органелл изменяет в ответ на эти различные внеклеточных условиях 2-5.

Glycosomes являются узкоспециализированными пероксисомы, в котором многие из ферментов, участвующих в гликолиза являются разобщенным. Glycosome состав изменяется в развития и экологически регулируемым образом 4-11. В настоящее время наиболее общие методы, используемые для изучения glycosome динамику являются электрон и флуоресцентной микроскопии; методы, которые стоят дорого, времени и труда, а не легко адаптировать к высокой пропускной анализов.

Чтобы преодолеть эти ограничения, репортер систему люминесцентная-glycosome вкоторой повышена желтый флуоресцентный белок (EYFP) слита с последовательностью ориентации пероксисом (PTS2), который направляет слитый белок по glycosomes 12, было установлено. При импорте слитого белка PTS2eYFP, glycosomes стать люминесцентные. Деградации органелл и результаты переработки в потере флуоресценции, которые могут быть измерены с помощью проточной цитометрии. Большое количество клеток (5000 клеток / сек) могут быть проанализированы в реальном времени без обширного пробоподготовки, например, фиксации и монтажа. Этот метод предлагает быстрый способ обнаружения изменений в органелл состава в ответ на колебания условий окружающей среды.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trypanosoma brucei вызывает африканскую сонную болезнь у человека и изнуряющая болезнь, Нагана, у крупного рогатого скота. Препараты, применяемые при лечении этих заболеваний являются устарелыми и чрезвычайно токсичны, вакцины отсутствуют, и потенциал для развития лекарственной устойчивости к необходимости поиска новых лекарственных препаратов 1.

Во время его жизненного цикла, Т. brucei, чередует вектор насекомых и млекопитающему; два компьютера, которые представляют очень разные условия, в которых паразит должен выжить. Ряд метаболических и морфологических изменений произойти паразит подвергается различным условиям окружающей среды. Некоторые из самых драматических изменений наблюдаются в одной мембраной ограничена паразитов конкретных микротел, называется glycosomes 13.

Уровни глюкозы являются относительно высокими (~ 5 мм) в крови и кровотока паразиты (BSF) генерации АТФ исключительно через гликолиза WHИль митохондриальная метаболизм репрессированных 14. В отличие от других эукариот, в котором гликолиза происходит в цитоплазме, T. brucei compartmentalizes большинство ферментов гликолиза в glycosomes 14,15. Паразиты будут взяты мухой цеце во время bloodmeal и испытать падение глюкозы, которая падает до неопределяемых уровней в течение 15 мин, чтобы быть заглатывании лету. Метаболизм насекомых, проциклической форма (PCF), паразиты является более гибким и глюкозы, а также аминокислоты, такие как пролин, могут быть использованы в синтезе АТФ 16-18. Сравнительные протеомные исследования показывают жизненного цикла зависимые изменения в glycosomal и митохондриальные белки с гликолиза белков повышенные в кровоток паразитов и митохондриальные белки, участвующие в цикле ТСА и дыхательной цепи 13,19. Хотя многие исследования были сосредоточены на различиях между ЧФ и ФКП glycosomes, мало известно об изменениях в ФКП glycosomes, которые происходят в ответ на окрironmental изменения.

В кишке лету, уровень глюкозы низкий с временными увеличивается во время кормления 20. В большинстве в пробирке исследования, ПКФ паразиты выращивают в среде, содержащей глюкозу. Тем не менее, недавние исследования показали, что изменения ФКП метаболизм значительно в ответ на глюкозу доступность 17. В отсутствие глюкозы, поглощение пролина и пролина увеличение активности дегидрогеназы 18. Это изменение метаболизма митохондрий, вероятно, сопровождается изменением состава и морфологии glycosome, однако, это не было непосредственно оценивать.

Электрон и флуоресцентной микроскопии являются общие методы используются для изучения динамики glycosome в Т. brucei 2,21-24. Эти протоколы времени и труда, дорого, и трудно адаптироваться в режиме реального времени исследований и протоколов с высокой пропускной. Чтобы преодолеть это ограничение, репортер система люминесцентная-органеллы USED для изучения органелл в млекопитающих и дрожжей систем была изменена для использования в T. brucei 12.

Репортер системы Люминесцентная-органелл широко используются в высших эукариот, таких как дрожжи, растений и клеток млекопитающих 25-27. В таких системах, флуоресцентный белок слит с аминокислотной последовательностью, которая направлена ​​белка в определенных органелл. Разложение или синтез целевых белков измеряется с помощью флуоресценции и изменения в составе органелл, отраженных от изменения флуоресценции клеток.

Когда открытая рамка считывания повышенной желтого флуоресцентного белка (EYFP) сливают с Тип II пероксисомальной последовательности целевых ориентиров (PtS2) 12, белок PTS2eYFP импортируется в зрелых, импортных-компетентный glycosomes и флуоресценции можно контролировать с помощью проточной цитометрии. Вариации в glycosome композиции, отраженных от изменений в клеточной флуоресценции. Эта система может помочь в резолВинг механизмы, которые регулируют экологически индуцированных изменений в glycosome состава.

Эта рукопись описывает генерацию системы glycosome репортера в ФКП паразитов в сочетании с проточной цитометрии для мониторинга динамики glycosome в режиме реального времени в живых паразитов и приводит пример, как он был использован, чтобы следить за изменениями в glycosome состава в ответ на различных средах. Таким образом, glycosome состав зависит от внеклеточных концентраций глюкозы и прохождения лог-фазовых культур в свежую среду вызывает изменения во glycosome состава. Эта система может быть изменен, чтобы изучить динамическое поведение других органеллах в трипаносом и других паразитов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1 Общие трипаносом Husbandry

  1. Взвесьте твердые для SDM79 подготовки медиа (Таблица 1).
  2. Хранить при 4 ° С в 50 мл коническую или Ziploc мешок. ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты стабильны в течение не менее 6 месяцев.
  3. Оттепели фетальной бычьей сыворотки (FBS), в 37 ° C водяной бане, и перемешивают периодически инверсии. Примечание: ФБС получен от поставщика в виде стерильного раствора. Фильтр стерилизации FBS снижает его способность поддерживать рост паразита.
  4. После того, как весь бутылки оттаивают, тепло инактивированную сыворотку в течение 30 мин в 56 ° C водяной бане, смешивание периодически, чтобы свести к минимуму осаждение компонентов сыворотки.
  5. Оттепели раствор пенициллина / стрептомицина (ручка / стрептококк), гемин (2 мг / мл в 50 мМ NaOH), и основная среда Eagle витамина раствору при комнатной температуре.
  6. К 1000 мл мерный цилиндр, добавить 20,2 г SDM79 твердых веществ (Таблица 1) жидких компонентов (таблица 2) и хорошо перемешать на мешалке.
  7. Отрегулируйте рН до 7,35, и принести объем до 850 мл водой.
  8. Фильтр стерилизации носитель путем присоединения вакуумный шланг к нижней части бутылки фильтра. Применение вакуума до тех пор, пока раствор не фильтруется.
  9. Удалить фильтра верх в кабинете биологической безопасности и добавить 150 мл тепла инактивированной FBS. Удалить пластиковую крышку от стерильной крышкой и уплотнение СМИ бутылки.
  10. Подготовьте SDM80 СМИ таким же образом, как SDM79 со следующими исключениями; не добавить глюкозу или глюкозамин и использовать MEM без глутамина. В месте 150 мл инактивированной нагреванием FBS, добавьте 135 мл диализовали, инактивированной нагреванием FBS, и 15 мл инактивированной нагреванием FBS.
  11. Культура ПКФ паразиты в 25 см 2 колбы с 10 мл соответствующей среды на 27 ° С и 5% СО 2. ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны учитываться в день с помощью гемоцитометра или проточного цитометра (см раздел 6) и культуры должны быть сохранены при плотностях между 1 х 10 5 и 5 х 10 6 клеток / мл.

2 Трansfection из ФКП Паразиты с люминесцентной Reporter Construct

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения glycosome динамику, репортер белок, содержащий пероксисомальной последовательность прицеливания (PtS2) альдолазы, слитого с повышенной желтого флуоресцентного белка выражается в паразитов. Последовательность, кодирующая слитый белок, клонируют в pXS2bla 12, который содержит промотор procyclin и тубулина межгенные области, которые направляют гомологичной рекомбинации в геном и ген устойчивости к бластицидин для выбора. Проциклической клеточные линии, несущие гены, кодирующие Т7-полимеразы и тетрациклинового репрессорного (PF29-13) трансформируют прицеливания конструкции, pXS2: PTS2eYFP.

  1. Подготовьте cytomix путем смешивания компонентов, перечисленных в таблице 3. Фильтр стерилизуют и хранят при комнатной температуре.
  2. Линеаризации плазмиды ДНК с помощью пипетки MluI 10 мкл ДНК (1 мкг / мкл), 5 мкл ограничительного фермента буфера, 33 мкл воды и 2 μ; Л MluI фермента в микроцентрифужную пробирку. Инкубируют при 37 ° С в течение 1 часа.
  3. Очищают ограничение переварить, добавив 1 объем связывания буфер для рестриктазой дайджеста. Смешайте буфера для связывания и переваренной ДНК встряхиванием. Кратко центрифуги для сбора образца в нижней части трубки.
  4. Вставьте ДНК привязку столбца в 2 мл пробирку, и передача переваривается ДНК / связывания буферный раствор к колонке.
  5. Центрифуга для 10000 мкг в течение 1 мин. После центрифугирования, отбросить фильтрат из пробирки и вернуть колонку в пробирку.
  6. Добавить 700 мкл SPW буфера и центрифуге при 10000 мкг в течение 1 мин.
  7. Отменить фильтрат из пробирки, вернуть колонку в пробирку и повторить SPW шаг стирки и центрифугирования.
  8. Откажитесь фильтрата, вернитесь столбце, чтобы пробирку и центрифуги пустой столбец в течение 3 мин при 10000 х г для удаления остаточного этанола.
  9. В биобезопасности кабинета, выбросить цвлекция трубки и место колонка в стерильной трубки микроцентрифужных.
  10. Для элюции ДНК, добавить 25 мкл стерильной воды в колонну и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин. Центрифуга при 10000 мкг в течение 1 мин.
  11. Добавить еще 25 мкл стерильной воды в биобезопасности капотом к колонке и инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин.
  12. Центрифуга при 10000 скорости XG в течение 1 мин.
  13. В кабинете биобезопасности передать весь объем ДНК в новую стерильную пробирку микроцентрифуги. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предотвращает загрязнение от открытой крышкой во время центрифугирования.
  14. Добавить стерильной, очищают, линеаризованной ДНК (10 мкг) в 400 мкл стерилизованным фильтрацией cytomix.
  15. Граф клеток, как описано в разделе 6 и урожай 5 x10 7 -10 8 клеток путем центрифугирования при 800 мкг в течение 15 минут при комнатной температуре.
  16. Слейте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 450 мкл ДНК + cytomix использованием 1 мл серологические пипетки.
  17. Передача раствор, содержащий се заполняет, ДНК, и cytomix в стерильную 4 мм зазор кюветы и кюветы место в камере электропорации.
  18. Выберите "экспоненциальный спад" и вручную ввести следующие параметры: Напряжение: 1,5 кВ, Емкость: 25 MF, сопротивление: Ω и кювет: 4 мм. Пресс импульса. После того, как пульс полный, удалить кювету с электропорации камеры и вернуться к биобезопасности кабинета.
  19. В новый стерильную колбу, пипетки 10 мл SDM79. Передача трансформированных клеток в колбу с 10 мл SDM79.
  20. Выдержите БЕЗ выбора препарата в течение 24 ч при 27 ° С, 5% СО 2. Через 24 ч добавляют G418 (15 мкг / мл), гигромицин (50 мкг / мл), и бластицидин (10 мкг / мл). Pass 1 мл трансформированных клеток с препаратом в 9 мл SDM79 с препарата.
  21. Анализ клеток ежедневно, как описано в разделах 6 и 7, когда клетки флуоресцентной, и достигли плотности клеток 1 х 10 7 / мл, сделать stabilates для долговременного хранения (3.1-3.3).
ve_title "> 3. Создание Stabilates

  1. Для того, чтобы замораживания средств массовой информации, добавляют равный объем 100% глицерина, чтобы cytomix и фильтра стерилизации.
  2. Добавить 200 мкл морозильной СМИ 800 мкл клеток (1 х 10 7) в криопробирку, аккуратно перемешать переворачиванием и место между двумя пенопластовые стойки и заморозить при температуре -80 ° C.
  3. После того, как замороженные (~ 24 ч), Передача клетки жидкого азота. Примечание: Важно, чтобы переместить клетки в LN 2 после 24 часов, а более длительного хранения при -80 ° С приводит к снижению жизнеспособности клеток.

4. Размораживание замороженных запасов

  1. Удалить замороженный флакон от -80 ° С до оттепели при комнатной температуре в течение примерно 10 мин.
  2. Внесите 9 мл SDM79 с препарата в новую стерильную колбу. Добавить оттаивали клетки в этой колбе. Pass клеткам 1:10 добавлением 1 мл этой культуры в 9 мл SDM79 в новую колбу (конечной концентрации 1 × 10 5 / мл).
  3. До того, как клетки достигают плотность 10 7 / мл, начинают цитометра установлени разведение анализы.

5 Цитометр Setup

  1. Включите проточной цитометрии и открыть программу Cflow Plus. ПРИМЕЧАНИЕ: Перед тем как запустить образцы, ГИДРОСИСТЕМЫ следует самоочистку обратным потоком и промыть в соответствии с шагами 5.2-5.7.
  2. Заменить трубку NanoPure воды, в которой хранится SIP с пустой трубы.
  3. Выберите кнопку «обратной промывки".
  4. После обратной промывки удалим микроцентрифужную пробирку с глотка и выбросьте.
  5. Установите новую микроцентрифужную пробирку, содержащую 1 мл новой NanoPure воды на глоток.
  6. Выберите новую скважину в программе Cflow. Под «Пределы Run" установить время в течение 2 мин. Под "ГИДРОСИСТЕМЫ" выберите "быстро" и "Run".
  7. После того, как срок 2 мин будет завершена, нажмите кнопку "Delete Sample Data".

6 подсчета клеток с помощью цитометра

  1. Замените воду с образцом для подсчета. Установите "Запуск Limits "до 30 сек," Fluidics "в" скорую ", а затем выберите" Выполнить ".
  2. По истечении срока, 30 сек завершена, Cflow плюс обеспечит события / мкл под "Last Run". Повторите счета для каждой культуры. ПРИМЕЧАНИЕ: Перед клетки достигают 1 х 10 7 клеток / мл, продолжить разбавления анализа. Клетки должны быть прекращены после одного разведения анализ завершен. Клетки, культивированные в течение более длительных периодов теряют способность реагировать на условия окружающей среды.

7 измерения флуоресценции с помощью цитометра

  1. Для оценки флуоресценции, установить «Выполнение Limits" в 10000 событий, и "FLUIDICS" в "медленные". Выберите "Установить порог". "Первичного Порога", выберите "Постоянно устранить события на", "FSC-H" (в меню), и введите менее 30000. Нажмите "Применить", затем "закрыть".
  2. Выберите220; "кнопку в одном из новых сюжетных окон и выберите" Гистограмма FSC-A "из выпадающего списка выберите" FL1-A ". ПРИМЕЧАНИЕ: меры FL1-A флуоресценции в волны 530 нм.
  3. Выберите "Выполнить" и повторите для всех культур.
  4. Запуск моющего раствора через линию гидросистемы в течение 2 мин и воды в течение 2 мин.

8. разбавления Анализы

  1. Pass клеток до плотности 1 × 10 5 клеток / мл в 3 мл SDM79 в 25 см 2 культуральной колбы и измерить цветение сразу же после прохода и затем в 3 часа и 24 часов.

Анализ 9. данных

  1. Выберите "Анализ" вкладку на Cflow Plus.
  2. Нажмите появится кнопка "Гистограмма" в разделе "Создайте новый сюжет." Select "FSC-A" и выпадающего списка. Выберите канал "FL1-."
  3. Выделите хорошо проанализировать. Выберите кнопку "Выход", и вручную нарисовать воротадля населения интерес.
  4. Flow Plus обеспечит клеток "Count" в пределах этих ворот и "% этого участка".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В этой системе, наблюдалось изменение уровня глюкозы в зависимости от glycosome в композиции. Когда клетки выращивают в глюкозы, содержащего СМИ, наблюдаются две популяции; одна яркая и одна тусклый (2А). Dim клетки укрывает незрелые glycosomes, которые не импортировали PTS2eYFP а яркие клетки укрывает смесь зрелых и незрелых glycosomes 12. Когда глюкоза присутствует в средствах массовой информации, неправильной локализации glycosome белков смертельна 15,28 и выражение glycosome белок, скорее всего, в сочетании тесно с импортом. Это жесткий регулирование отвечает за появление тусклых клеток, в которых экспрессия glycosome белок подавленной, когда клетки не обладают достаточной возможность импорта. После того, как импорт glycosome техника полностью собран и функциональный, клетки выразить glycosome белки, которые затем импортируются в glycosomes, уступая флуоресцентные клетки. В глюкозы-разрушающим СМИ, неправильной локализации glycosome белков терпетьD 15, и бимодальное распределение населения заменены одним пиком с более широкий спектр флуоресценции (фиг.2В).

Эта система была использована для определения условий, которые вызывают изменения в glycosome состава. При культуры высокие плотности, содержащие ~ 10% тусклые клеток (рисунок 3А) передаются в свежей среде, есть преходящее повышение в процентах от тусклых клеток (Рисунок 3В). По 24 часов. Оригинальный распределение населения восстанавливается (3С).

SDM79 Твердые Вес (г / л)
Грации порошок клеток насекомых СМИ 2
Глюкоза 1
HEPES 8
МОПС 5
NaHCO 3 2
Пирувата натрия 0.1
L-аланин 0.2
L-аргинин 0.1
L-глютамин 0.3
L-Methonine 0.07
L-Фенилаланин 0.08
L-пролин 0.6
L-серин 0.06
L-таурин 0.16
L-треонин 0.35
L-тирозин 0.1
Аденозин 0.01
Гуанозин 0.01
Глюкозамин HCl 0.05
Фолиевая кислота 0.004
г-аминобензойной кислоты 0.002
Биотин 0.0002

Таблица 1 SDM79 твердые компоненты. Твердые компоненты среды и количество (г / л) предусмотрены.

SDM79
MEM с глутамина 600 мл
Pen / Strep 10 мл
BME раствор витаминов 10 мл
MEM аминокислоты решение 8 мл
MEM, не важно аминокислотный раствор 6 мл
Хемин 3,75
Вода 162,25 мл

Таблица 2 SDM79 жидкие компоненты. Объемы мл даны.

Для 20 мл
120 мМ КСl 1,4 мл (1 М)
0,15 мМ CaCl 2 3 мл (1 М)
10 мМ K 2 HPO 4 400 мл (0,5 М)
25 мМ HEPES 500 мл (1 М)
2 мМ ЭДТА 80 мл (0,5 М)
5 мМ MgCl2 100 мл (1 М)
Вода 16.52

Таблица 3 Cytomix рецепт.

Рисунок 1
Рисунок 1. Люминесцентная систему glycosome репортер. А) интеграция выражение PTS2eYFP конструкция. ПКФ трипаносомы трансформировали рХS2PTS2eYFP плазмиды линеаризованы рестриктазой MluI. Эта конструкция объединяет посредством гомологичной рекомбинации в тубулина локуса (ванна) и PARP последовательностей (ППА) включает промотор, который управляет конститутивной экспрессии PTS2eYFP и последовательности, необходимые для РНК обработки. B) импорт PTS2eYFP. PTS2eYFP синтезируется в цитоплазме, где он связывается с растворимого рецептора, PEX7, который обеспечивает репортерный белок к glycosomes. После доставки в glycosome мембраны белок импортируется. Зрелые органеллы, содержащие импорт машин PTS2eYFP импорта и флуоресценции, а те, которые не содержат функциональную импортных машин остаются туманными.

Рисунок 2
Фигура 2 Глюкоза в зависимости от композиции. Glycosome PCF клетки выращивали в SDM79 (+ КЗС) или SDM80 (-Glc) ианализировали с помощью проточной цитометрии. Гистограммы 10000 событий.) Анализ клеток, выращенных в SDM79 последовательно показывает два пика. Флуоресцентные клетки укрывает смесь зрелых и незрелых органелл с клеток высших интенсивности флуоресценции, имеющих более зрелые glycosomes. В SDM79, неправильной локализации glycosome белков смертельна и glycosome выражение и импорт белок должен быть под жестким контролем. Это отражено в отсутствие клеток с промежуточными интенсивности флуоресценции. Б) в SDM80, неправильной локализации glycosome белков терпимо, бимодальное распределение населения теряется, и наблюдаются клетки промежуточного флуоресценции.

Рисунок 3
Рисунок 3 Glycosome ремоделирования. Ремоделирование glycosomes инициируется переходом в свежей прессы. 6 / мл). B) 3 ч после разведения в пресной SDM79 есть увеличение доли тусклых клеток с незрелостью glycosomes, входящих в левой ворот C ) Гистограмма разбавленной культуры после 24 часов. После 24 часов, распределение населения вернулась в нормальное состояние, как незрелые glycosomes теперь содержат пероксисома белки, необходимые для импорта флуоресцентный белок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glycosomes являются важными, динамические, паразит-специфический органеллы. Процессы, которые регулируют биогенеза, техническое обслуживание, пролиферацию и ремоделирование этих органелл, вероятно, включать лекарственных целей, которые могли бы быть использованы в терапевтических целях. Несмотря на потенциально высоким обилием таких лекарственных препаратов, поле glycosome биогенеза отстала от изучения аналогичных процессов в других организмов, преимущественно в связи с отсутствием послушный, высокой пропускной системы с помощью которого можно контролировать быстрые, динамичные, органелл ответов в живых клетках.

Флуоресцентные-репортер органелл системы были использованы для изучения динамики органелл у высших эукариот, таких как дрожжей, растений, грибов и млекопитающих 23-25. Мы породили трансгенного штамма ФКП паразитов, которые выражают PTS2eYFP который целевых созревать glycosomes, уступая флуоресцентные органеллы. Изменения в glycosome состава можно контролировать с помощью следующей сотовой флуоресценции. Используя эту систему, мы обнаружили, что условия окружающей среды, в частности, глюкозы, регулирует glycosome состав 12.

В отличие от микроскопии методы часто используются для изучения динамики органелл в kinetoplastid паразитов, этот репортер система предлагает метод, с помощью которого быстро экранировать соединений и условий, которые влияют на общую динамику glycosome. Тем не менее, изменения флуоресценции отражает изменения в общей композиции органелл. Дальнейшие биохимические и микроскопические эксперименты должны определить конкретные молекулярные различия между популяциями клеток, проявляющих различную интенсивность флуоресценции.

Мы определили ряд важнейших шагов в ремоделирования анализов. Интересно, что мы обнаружили, что, как клетки культивируют в течение более длительных периодов (более двух проходов), их поведение в ответ на изменения окружающей среды непредсказуемо. После длительного культивирования клетки передается от высоких плотностях в свежем мEdia, проявляют временное увеличение тусклом населения, указывая, что они все еще в состоянии реконструировать glycosomes, но умирают после 24 часов. Мы также столкнулись с ситуациями, когда не наблюдается ремоделирование. Причина этого не ясна поведения, но мы обнаружили, что, когда клетки обрабатываются так, как описано здесь (ограничение количества клеток до двух пассажей и поддержания культур ниже 1 × 10 7 / мл), glycosome ремоделирование воспроизводима. Когда клетки больше не реагировать на условия окружающей среды, ретрансформации клетки с репортером-конструирования плазмиды обычно средства эта ситуация.

Хотя эта система была использована для изучения glycosome поведение в африканских трипаносом, он также может быть принята для изучения органелл в других паразитов путем слияния флуоресцентные белки аминокислотных последовательностей белков, что прямая локализации других клеточных компартментах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine Avocado Research Chemicals Ltd A10781 SDM79 Ingredient
L-Alanine Avocado Research Chemicals Ltd A15804 SDM79 Ingredient
L-Arginine CalBiochem 1820 SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid ICN Biomedicals 102569 SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x) Sigma B6891 SDM79 Ingredient
Biotin Fisher BP232-1 SDM79 Ingredient
Calcium chloride VWR BDH0224 Cytomix
EDTA Fisher S311-100 Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit Omega Biotek D2500-01 DNA purifiation
Research grade Serum Fisher 03-600-511 SDM79 Ingredient
Folic acid ICN Biomedicals 101725 SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl ICN Biomedicals 194671 SDM79 Ingredient
Glucose GIBCO 15023-021 SDM79 Ingredient
L-Glutamine CalBiochem 3520 SDM79 Ingredient
Glycerol Acros Organics Ac15892-0010 Freezing media
Graces insect cell media powder GIBCO 11300-043 SDM79 Ingredient
Hemin MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Guanosine Avocado Research Chemicals Ltd A11328 SDM79 Ingredient
HEPES MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Magnesium chloride Fisher BP214-500 Cytomix ingredient
L-Methionine Fisher BP388-100 SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x) Cellgro 25-030-CI SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x) Lonza 13-114E SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine Cellgro 10-010-CM SDM79 Ingredient
MOPS Fisher BP308-500 SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate Fisher S233-500 SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution Cellgro 30-002-CI SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine ICN Biomedicals 102623 SDM79 Ingredient
Potassium chloride Fisher P217-500 Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisheer P290-212 Cytomix ingredient
L-Proline Fisher BP392-100 SDM79 Ingredient
L-Serine Acros Organics 56-45-1 SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt Acros Organics 113-24-6 SDM79 Ingredient
L-Taurine TCI America A0295 SDM79 Ingredient
L-Threonine Acros Organics 72-19-5 SDM79 Ingredient
L-Tyrosine ICN Biomedicals 103183 SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit Omega Biotek D6492-02 DNA purification
Binding buffer Omega Biotek PDR041 DNA purification
SPW wash buffer Omega Biotek PDR045 DNA purification
Gene Pulser Xcell Biorad 165-2660 Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes VWR Trypanosome transformation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
  2. Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
  3. Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
  4. Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
  5. Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
  6. Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
  7. Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
  8. Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
  9. Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
  10. Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
  11. Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
  12. Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
  13. Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
  14. Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
  15. Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
  16. Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
  17. Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
  18. Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
  19. Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
  20. Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
  21. Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
  22. Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
  23. Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
  24. Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
  25. Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
  26. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
  27. Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
  28. Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).
Использование флуоресцентных белков для мониторинга Glycosome Динамика в африканском трипаносомы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).More

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter