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Immunology and Infection

El uso de proteínas fluorescentes de Seguimiento glicosoma Dinámica en el tripanosoma africano

doi: 10.3791/51647 Published: August 19, 2014

Abstract

Trypanosoma brucei es un parásito kinetoplastid que causa tripanosomiasis humana africana (THA), o enfermedad del sueño, y una enfermedad degenerativa, nagana, en el ganado bovino 1. Los suplentes de parásitos entre el torrente sanguíneo del huésped mamífero y el vector de la mosca tsetsé. La composición de muchos orgánulos celulares cambia en respuesta a las diferentes condiciones extracelulares 2-5.

Glycosomes son los peroxisomas altamente especializados en los que muchas de las enzimas que intervienen en la glucólisis son compartimentados. Cambios en la composición glicosoma de una manera regulada en el desarrollo y el medio ambiente 4-11. Actualmente, las técnicas más comunes que se utilizan para estudiar glicosoma dinámica es la microscopía electrónica y de fluorescencia; técnicas que son caros, tiempo y mano de obra intensiva, y no adaptarse fácilmente a los análisis de alto rendimiento.

Para superar estas limitaciones, un sistema indicador fluorescente en glicosomaque mejoró la proteína fluorescente amarilla (eYFP) se fusiona a una secuencia de peroxisomas focalización (PTS2), que dirige la proteína de fusión a glycosomes 12, se ha establecido. Sobre la importación de la proteína de fusión PTS2eYFP, glycosomes vuelven fluorescentes. Orgánulos la degradación y los resultados de reciclaje en la pérdida de la fluorescencia que puede ser medido por citometría de flujo. Un gran número de células (5000 células / seg) se pueden analizar en tiempo real sin extensa preparación de la muestra tales como la fijación y el montaje. Este método ofrece una forma rápida de detectar cambios en la composición orgánulo en respuesta a las fluctuaciones de las condiciones ambientales.

Introduction

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Trypanosoma brucei causa la enfermedad del sueño africana en los seres humanos y una enfermedad degenerativa, nagana, en el ganado bovino. Los fármacos utilizados en el tratamiento de estas enfermedades son anticuadas y extremadamente tóxico, las vacunas no están disponibles, y el potencial para el desarrollo de resistencia a los medicamentos requiere la búsqueda de nuevas dianas farmacológicas 1.

Durante su ciclo de vida, T. brucei, se alterna entre un insecto vector y hospedador mamífero; dos hosts que se presentan muy diferentes entornos en los que el parásito tiene que sobrevivir. Una serie de cambios metabólicos y morfológicos se producen como el parásito está expuesto a diferentes condiciones ambientales. Algunos de los cambios más dramáticos se observan en parásitos microcuerpos específicos de una sola membrana limitada, denominada glycosomes 13.

Los niveles de glucosa son relativamente altos (~ 5 mm) en el torrente sanguíneo y parásitos en el torrente sanguíneo (BSF) generan ATP exclusivamente a través de wh glucólisisile metabolismo mitocondrial es reprimida 14. A diferencia de otros eucariotas en el que la glucólisis se produce en el citoplasma, T. brucei compartimenta mayoría de las enzimas glucolíticas en glycosomes 14,15. Los parásitos son absorbidos por la mosca tsetsé durante una harina de sangre y experimentan una caída en la glucosa, que cae a niveles indetectables en los 15 minutos de ser ingerido por la mosca. El metabolismo de los insectos, la forma procíclica (PCF), parásitos es más flexible y glucosa, así como aminoácidos tales como prolina, se pueden utilizar en la síntesis de ATP 16-18. Estudios proteómicos comparativos revelan cambios de ciclo de vida que dependen en glicosomal y proteínas mitocondriales con proteínas glucolíticos aumento en los parásitos del torrente sanguíneo y proteínas mitocondriales implicadas en el ciclo TCA y la cadena respiratoria 13,19. Mientras que muchos estudios se han centrado en las diferencias entre BSF y glycosomes PCF, se sabe poco sobre los cambios en glycosomes PCF que se producen en respuesta a envcambios ironmental.

En el intestino grueso de la marcha, los niveles de glucosa son bajos con aumentos transitorios durante una alimentación 20. En la mayoría de los estudios in vitro, los parásitos PCF se cultivan en medios que contienen glucosa. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los cambios del metabolismo PCF significativamente en respuesta a glucosa disponibilidad 17. En ausencia de glucosa, la captación de prolina y prolina aumento de la actividad deshidrogenasa 18. Este cambio en el metabolismo mitocondrial es probable que acompañado por un cambio en la composición y la morfología glicosoma, sin embargo, esto no ha sido evaluado directamente.

Electron y microscopía de fluorescencia se utilizan técnicas comunes para estudiar la dinámica glicosoma en T. brucei 2,21-24. Estos protocolos son el tiempo y mano de obra intensiva, caro, y difícil de adaptar a los estudios en tiempo real y protocolos de alto rendimiento. Para superar esta limitación, un sistema indicador fluorescente u orgánulosed para estudiar orgánulos en los sistemas de mamíferos y levaduras se ha modificado para su uso en T. brucei 12.

Sistemas de indicador fluorescente orgánulos se han utilizado ampliamente en eucariotas superiores tales como levadura, planta, y células de mamífero 25-27. En tales sistemas, una proteína fluorescente se fusiona a una secuencia de aminoácidos que se dirige a la proteína a orgánulos específicos. La degradación o síntesis de las proteínas específicas se mide a través de la fluorescencia y los cambios en la composición del orgánulo se reflejan en cambios en la fluorescencia celular.

Cuando la fase de lectura abierta de la proteína fluorescente amarilla mejorada (eYFP) se fusiona con una secuencia focalización peroxisomal tipo II (PTS2) 12, la proteína PTS2eYFP se importa a, glycosomes maduros-importación competente y de fluorescencia pueden ser monitoreados mediante citometría de flujo. Las variaciones en la composición glicosoma se reflejan en cambios en la fluorescencia celular. Este sistema puede ayudar a resolving los mecanismos que regulan los cambios inducidos por el medio ambiente en glicosoma composición.

Este manuscrito describe la generación de un sistema reportero glicosoma en los parásitos PCF en conjunción con la citometría de flujo para controlar la dinámica de glicosoma en tiempo real en parásitos vivos y proporciona un ejemplo de cómo se ha utilizado para seguir los cambios en glicosoma composición en respuesta a diferentes entornos. En resumen, glicosoma composición está influenciada por las concentraciones de glucosa extracelular y paso de cultivos en fase logarítmica en medio fresco provoca cambios en glicosoma composición. Este sistema puede ser modificado para estudiar el comportamiento dinámico de otros orgánulos en tripanosomas y otros parásitos.

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Protocol

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1. general Tripanosoma Ganadería

  1. Pesar sólidos para la preparación de medios SDM79 (Tabla 1).
  2. Almacenar a 4 ° C en 50 ml cónico o una bolsa Ziploc. NOTA: Los reactivos son estables durante al menos 6 meses.
  3. Descongelar el suero fetal bovino (FBS) en un baño de agua a 37 ° C, y mezclar periódicamente por inversión. NOTA: FBS se recibe del proveedor como una solución estéril. Filtro esterilización FBS reduce su capacidad para apoyar el crecimiento del parásito.
  4. Una vez que la botella entera se descongela, el calor inactiva suero durante 30 min en un baño de agua a 56 ° C, mezclando periódicamente para minimizar la precipitación de los componentes del suero.
  5. Descongelar penicilina / solución de estreptomicina (pen / strep), hemina (2 mg / ml en NaOH 50 mM), y la solución de vitamina medio basal de Eagle a temperatura ambiente.
  6. Para unos 1000 ml probeta graduada, añadir 20,2 g de sólidos SDM79 (Tabla 1) a los componentes líquidos (Tabla 2) y mezclar bien en una placa de agitación.
  7. Ajustar el pH a 7,35, y llevar el volumen a 850 ml con agua.
  8. Filtrar esterilizar medios por conectar una manguera de vacío a la parte inferior de una botella de filtro. Aplicar vacío hasta que se filtra la solución.
  9. Retire la parte superior del filtro en la cabina de bioseguridad y añadir 150 ml de FBS inactivado por calor. Quite cubierta de plástico de la tapa y la botella estéril de medios de sellado.
  10. Preparar medios SDM80 de la misma manera como SDM79 con las siguientes excepciones; no agregue la glucosa o la glucosamina y utilizar MEM sin glutamina. En lugar de 150 ml de FBS inactivado por calor, añadir 135 ml de dializado, FBS inactivado por calor, y 15 ml de FBS inactivado por calor.
  11. Cultura parásitos PCF en 25 cm 2 matraz con 10 ml de medio apropiado a 27 ° C y 5% de CO 2. Nota: Las celdas deben contarse todos los días usando un hemocitómetro o un citómetro de flujo (ver sección 6) y las culturas deben mantenerse en densidades entre 1 x 10 5 y 5 x 10 6 células / ml.

2. Transfection de PCF parásitos con el constructo indicador fluorescente

NOTA: Para seguir glicosoma dinámica, una proteína indicadora que contiene la secuencia de dirección peroxisomal (PTS2) de aldolasa fusionado a la proteína fluorescente amarilla mejorada se expresa en los parásitos. La secuencia que codifica la proteína de fusión se clonó en pXS2bla 12, que contiene el promotor procyclin y las regiones intergénicas de tubulina, que la recombinación homóloga directa en el genoma y el gen de resistencia a blasticidina para la selección. Líneas celulares que albergan procíclico los genes que codifican la polimerasa y la tetraciclina represor T7 (PF29-13) se transforman con la construcción de la orientación, pXS2: PTS2eYFP.

  1. Preparar citomix mezclando los componentes enumerados en la Tabla 3. Filtro esterilizar y almacenar a temperatura ambiente.
  2. Linealizar el ADN plásmido con MluI pipeteando 10 l de ADN (1 mg / l), 5 l de tampón de enzima de restricción, agua 33 l, y 2 μ; L de enzima MluI en un tubo de microcentrífuga. Incubar a 37 ° C durante 1 hr.
  3. Purifica la digestión de restricción mediante la adición de 1 volumen de tampón de unión a la enzima de digestión de restricción. Mezclar tampón de unión y el ADN digerido mediante agitación con vórtex. Centrifugar brevemente para recoger la muestra en la parte inferior del tubo.
  4. Inserte un ADN vinculante columna en un tubo de recogida de 2 ml, y la transferencia de ADN digerido / solución tampón a la columna de unión.
  5. Centrifugar para 10.000 xg durante 1 min. Después de la centrifugación, desechar el tubo de recogida de filtrado y devolver la columna para el tubo de recogida.
  6. Añadir 700 l de tampón de lavado SPW y se centrifuga a 10.000 xg durante 1 min.
  7. Descartar filtrado de tubo de recogida, de regreso a la columna del tubo de recogida y repetir SPW etapa de lavado y centrifugación.
  8. Descartar filtrado, la columna de retorno a tubo de recogida, y se centrifuga la columna de vacío durante 3 min a 10.000 xg para eliminar el etanol residual.
  9. En un gabinete de bioseguridad, deseche coltubo de recolección y la columna a cabo en un tubo de microcentrífuga estéril.
  10. Para eluir el ADN, añadir 25 l de agua estéril a la columna y se incuba a temperatura ambiente durante 2 min. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min.
  11. Añadir otros 25 l de agua estéril en la campana de bioseguridad a la columna y se incuba a temperatura ambiente durante 2 min.
  12. Se centrifuga a 10.000 xg velocidad durante 1 min.
  13. En una cabina de bioseguridad transferir la totalidad de volumen de ADN a un tubo nuevo de microcentrífuga estéril. NOTA: Este paso evita la contaminación de la tapa abierta durante la centrifugación.
  14. Añadir la,, el ADN linealizado estéril purificada (10 g) a 400 l de Cytomix esterilizada por filtración.
  15. Contar las células como se describe en la sección 6 y cosechar 5 7 -10 8 x10 células por centrifugación a 800 g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
  16. Retirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 450 l de ADN + citomix usando un 1 ml pipeta serológica.
  17. Solución de transferencia que contiene ce LLS, ADN, y Cytomix a una cubeta de 4 mm brecha y lugar cubeta estéril en la cámara de electroporación.
  18. Seleccione "decaimiento exponencial" e introduzca manualmente los siguientes parámetros: Voltaje: 1,5 kV, la capacitancia: 25 mF, Resistencia: Ω, y la cubeta: 4 mm. Prensa pulso. Una vez que el pulso es completa, Sacar la cubeta de la cámara de electroporación y volver a la cabina de bioseguridad.
  19. En un nuevo frasco estéril, una pipeta 10 ml de SDM79. Transferencia de las células transformadas al matraz con 10 ml de SDM79.
  20. Incubar sin selección de drogas durante 24 horas a 27 ° C, 5% de CO 2. Después de 24 horas, añadir G418 (15 mg / ml), higromicina (50 g / ml), y blasticidina (10 g / ml). Pase 1 ml de células transformadas con el fármaco en 9 ml de SDM79 con el fármaco.
  21. Analizar las células diaria como se describe en las secciones 6 y 7 Cuando las células son fluorescentes, y han alcanzado una densidad celular de 1 x 10 7 / ml, hacer estabilizados para almacenamiento a largo plazo (3.1 a 3.3).
ve_title "> 3. Hacer estabilizados

  1. Para hacer que la congelación de los medios de comunicación, añadir un volumen igual de glicerol al 100% a Cytomix y el filtro de esterilizar.
  2. Añadir 200 l de los medios de congelación a 800 l de células (1 x 10 7) en un criovial, mezclar suavemente por inversión y el lugar entre dos bastidores de espuma de poliestireno y congelar a -80 ° C.
  3. Una vez congelado (~ 24 horas), las células de transferencia a nitrógeno líquido. NOTA: Es importante mover celdas en LN 2 después de 24 horas, como un almacenamiento más prolongado a -80 ° C conduce a una disminución de la viabilidad celular.

4. Existencias descongelar

  1. Eliminar vial congelado de -80 ° C y descongelación a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 min.
  2. Pipetear 9 ml de SDM79 con drogas en un nuevo frasco estéril. Añadir las células descongeladas a este frasco. Pasar las células 1:10 añadiendo 1 ml de este cultivo a 9 ml de SDM79 en un nuevo matraz (concentración final de 1 x 10 5 / ml).
  3. Antes de que las células alcanzan una densidad de 10 7 / ml, comience a establecer citómetroy ensayos de dilución.

5. citómetro de configuración

  1. Encienda el citómetro de flujo y abrir el programa CFlow Plus. NOTA: Antes de ejecutar cualquier muestra, los fluidos deben ser toma retroactiva y enjuagarse de acuerdo a los pasos 5.2 a 5.7.
  2. Vuelva a colocar el tubo de agua nanopura en la que la SIP se almacena con un tubo vacío.
  3. Seleccione el botón de "autolimpieza".
  4. Una vez que toma retroactiva, retire el tubo de microcentrífuga de sorbo y descarte.
  5. Colocar un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 1 ml de agua nueva nanopura en el SIP.
  6. Seleccione un nuevo pozo en el programa CFlow. En "Límites Run" establecer el tiempo de 2 min. En "Fluidics" seleccione "rápida" y "Run".
  7. Una vez que el límite de tiempo de 2 min se haya completado, haga clic en el botón "Eliminar datos de ejemplo".

6. Recuento celular utilizando el citómetro de flujo

  1. Reemplazar el agua con la muestra a ser contado. Ajuste "Límites Run "a 30 seg," Fluidics "a" rápida "y seleccione" Ejecutar ".
  2. Después de que el límite de tiempo de 30 segundos es completa, CFlow además proporcionará los eventos / l en "Última ejecución." Conteo de repetición para cada cultura. NOTA: Antes de células alcanzan 1 x 10 7 células / ml, proceder con el ensayo de dilución. Las células deben ser descontinuados después de completar un ensayo de dilución. Las células cultivadas durante períodos más largos pierden su capacidad de responder a las condiciones ambientales.

7. midiendo la fluorescencia usando el citómetro de flujo

  1. Para evaluar la fluorescencia, establecer "límites Run" a 10.000 eventos, y "Fluidics" a "lentas". Seleccione "umbral de Ajuste". En "umbral básico", seleccione "Permanentemente eliminar eventos en", "FSC-H" (en caja de abajo) y entrar a menos de 30.000. Haga clic en "Aplicar", luego en "Cerrar".
  2. Seleccione el220; "botón en una de las nuevas ventanas de trazado y seleccione" Histograma FSC-A "Desde la lista desplegable, seleccione" FL1-A ". NOTA: medidas FL1-A fluorescencia en la longitud de onda de 530 nm.
  3. Seleccione "Ejecutar" y repita para todas las culturas.
  4. Ejecutar la solución de limpieza a través de la línea de fluidos durante 2 min y el agua durante 2 min.

8. dilución ensayos

  1. Pasar las células a una densidad de 1 x 10 5 células / ml en 3 ml de SDM79 en un matraz de 25 cm 2 cultura y medir fluorescencia inmediatamente después del paso y luego a 3 hr y 24 hr.

Análisis de datos 9.

  1. Seleccione "Analyze" pestaña en CFlow Plus.
  2. Haga clic aparecerá el botón "Histograma" en "Hacer una nueva parcela". Seleccione "FSC-A" y una lista desplegable. Seleccione el canal "FL1-A."
  3. Resalte un bien de analizar. Seleccione el botón "Gate", y dibujar manualmente una puertapara la población de interés.
  4. Flow Plus proporcionará celular "Count" dentro de esta puerta y "% de esta trama".

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Representative Results

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En este sistema, se observó un cambio dependiente de la glucosa en glicosoma composición. Cuando las células se cultivan en medios que contienen glucosa, se observaron dos poblaciones; uno brillante y una tenue (Figura 2A). Células Dim albergan glycosomes inmaduras, que no han importado la PTS2eYFP mientras que las células brillantes albergan una mezcla de glycosomes maduros e inmaduros 12. Cuando la glucosa está presente en los medios de comunicación, mislocalization de glicosoma proteínas es letal 15,28 y glicosoma expresión de la proteína es probable que acopla estrechamente con la importación. Esta regulación estricta es responsable de la aparición de células oscuras en la que glicosoma expresión de la proteína se suprime cuando las células carecen de la capacidad de importación suficiente. Una vez que la maquinaria glicosoma importación está totalmente montado y funcional, las células expresan glicosoma proteínas, que luego se importan a glycosomes, produciendo células fluorescentes. En los medios de comunicación-glucosa agotan, la deslocalización de glicosoma proteínas es tolerard 15, y la distribución de la población bimodal se sustituye por un único pico con una gama más amplia de la fluorescencia (Figura 2B).

Este sistema se ha utilizado para identificar las condiciones que desencadenan cambios en glicosoma composición. Cuando los cultivos de alta densidad que contienen ~ 10% de células DIM (Figura 3A) se pasan en medio fresco, hay un aumento transitorio en el porcentaje de células DIM (Figura 3B). Por 24 horas. la distribución de la población original se restablece (Figura 3C).

SDM79 Sólidos Peso (g / l)
Graces célula de insecto polvo Los medios de 2
Glucosa 1
HEPES 8
MOPS 5
NaHCO3 2
Piruvato de sodio 0,1
L-Alanina 0,2
L-Arginina 0,1
L-Glutamina 0.3
L-Methonine 0.07
L-fenilalanina 0.08
L-prolina 0,6
L-serina 0.06
L-Taurina 0,16
L-Treonina 0.35
L-tirosina 0,1
La adenosina 0.01
Guanosina 0.01
Glucosamina HCl 0.05
El ácido fólico 0.004
ácido r-aminobenzoico 0.002
Biotina 0.0002

Tabla 1. SDM79 componentes sólidos. Componentes de medios sólidos y la cantidad (g / l) se proporcionan.

SDM79
MEM con glutamina 600 ml
Pen / Strep 10 ml
Solución de vitamina BME 10 ml
MEM solución de aminoácidos 8 ml
Solución de aminoácido no esencial MEM 6 ml
Hemin 3,75
Agua 162,25 ml

Se dan Tabla 2. SDM79 componentes líquidos. Volúmenes ml.

Durante 20 ml
120 mM KCl 1,4 ml (1 M)
0,15 mM CaCl 2 3 ml (1 M)
10 mM K 2 HPO 4 400 ml (0,5 M)
25 mM HEPES 500 ml (1 M)
EDTA 2 mM 80 ml (0,5 M)
5 mM MgCl2 100 ml (1 M)
Agua 16.52

Tabla 3. receta Cytomix.

Figura 1
Figura 1. reportero sistema glicosoma fluorescente. A) la integración construcción de expresión PTS2eYFP. Tripanosomas PCF se transformaron con el pXS2PTS2eYFP plásmido linealizado con la enzima de restricción MluI. Este constructo se integra mediante recombinación homóloga en el locus tubulina (Tub) y las secuencias de PARP (PARP) incluye el promotor que conduce la expresión constitutiva de PTS2eYFP y las secuencias requeridas para el procesamiento de ARN. B) PTS2eYFP de importación. PTS2eYFP se sintetiza en el citoplasma donde se une el receptor soluble, PEX7, que entrega la proteína indicadora para los glycosomes. Una vez entregado a la membrana glicosoma, la proteína ha sido importada. Orgánulos maduros contienen maquinaria de importación PTS2eYFP importación y de fluorescencia, mientras que los que no contienen maquinaria de importación funcional siguen siendo tenue.

Figura 2
Figura 2.-glucosa dependiente glicosoma composición. PCF células fueron cultivadas en SDM79 (+ Glc) o SDM80 (-Glc) yanalizada por citometría de flujo. Histogramas de 10.000 eventos. A) análisis de las células cultivadas en SDM79 revela consistentemente dos picos. Células fluorescentes albergan una mezcla de orgánulos maduros e inmaduros con células de la intensidad de fluorescencia superiores que tienen glycosomes más maduros. En SDM79, mislocalization de glicosoma proteínas es letal y glicosoma expresión de proteínas y de importación debe ser estrechamente controlada. Esto se refleja en la ausencia de células con intensidades de fluorescencia intermedios. B) En SDM80, la deslocalización de glicosoma proteínas se tolera, la distribución de la población bimodal se pierde, y se observan las células de fluorescencia intermedia.

Figura 3
Figura 3. glicosoma remodelación. Remodelación de glycosomes es provocada por el paso en medio fresco. 6 / ml). B) 3 horas después de la dilución en SDM79 fresco hay un aumento en la proporción de células con dim glycosomes inmaduros que caen dentro de la puerta izquierda C ) Histograma del cultivo diluido después de 24 horas. Después de 24 horas, la distribución de la población ha vuelto a la normalidad, como los glycosomes inmaduros ahora contienen las proteínas de peroxisomas necesarios para importar la proteína fluorescente.

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Discussion

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Glycosomes son, orgánulos específicos del parásito esenciales y dinámicos. Los procesos que regulan la biogénesis, mantenimiento, proliferación y remodelación de estos orgánulos probable incluyen objetivos farmacológicos que podrían ser explotadas con fines terapéuticos. A pesar de la posibilidad de alta abundancia de tales objetivos farmacológicos, el campo de glicosoma biogénesis se ha quedado atrás el estudio de procesos similares en otros organismos, principalmente debido a la falta de un sistema de alto rendimiento manejable por el cual, para supervisar, respuestas orgánulos dinámicos rápidos en células vivas.

Los sistemas indicadores fluorescentes orgánulo se han utilizado para estudiar la dinámica de orgánulos en eucariotas superiores tales como levaduras, plantas, hongos y mamíferos 23-25. Hemos generado una cepa transgénica de parásitos PCF que expresan PTS2eYFP que está dirigida a madurar glycosomes, produciendo orgánulos fluorescentes. Los cambios en la composición glicosoma pueden ser monitoreados a través siguiente fluorescencia celular. Utilizando este sistema, se ha encontrado que las condiciones ambientales, en particular de glucosa, regulan glicosoma composición 12.

En contraste a la microscopía métodos utilizados a menudo para estudiar la dinámica de orgánulos en kinetoplastid parásitos, este sistema reportero ofrece un método por el cual para cribar rápidamente compuestos y condiciones que influyen en la dinámica general glicosoma. Sin embargo, los cambios en la fluorescencia reflejan cambios en las composiciones generales de orgánulos. Se necesitan más experimentos bioquímicos y microscópicos para definir las diferencias moleculares específicas entre las poblaciones de células que presentan diferentes intensidades de fluorescencia.

Hemos identificado una serie de pasos críticos en los ensayos de remodelación. Curiosamente, hemos encontrado que a medida que las células se cultivan durante períodos más largos (más de dos pasadas), su comportamiento en respuesta a los cambios ambientales es impredecible. Después del cultivo prolongado, las células pasan de altas densidades en m frescaedia, exhiben un aumento temporal de la población tenue, lo que indica que todavía son capaces de remodelar glycosomes, pero mueren después de 24 horas. También nos hemos encontrado con situaciones en las que no se observe una remodelación. La razón de este comportamiento está clara, pero se ha encontrado que cuando las células se tratan como se describe aquí (limitando el número de pases celulares a dos y mantener los cultivos por debajo de 1 x 10 7 / ml), glicosoma remodelación es reproducible. Cuando las células ya no son sensibles a las condiciones ambientales, retransformar las células con el plásmido reportero constructo generalmente remedios a esta situación.

Si bien este sistema ha sido utilizado para estudiar el comportamiento glicosoma en tripanosomas africanos, también puede ser adoptada para el estudio de los orgánulos en otros parásitos mediante la fusión de las proteínas fluorescentes a secuencias de aminoácidos que la proteína de localización directa a otros compartimentos celulares.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine Avocado Research Chemicals Ltd A10781 SDM79 Ingredient
L-Alanine Avocado Research Chemicals Ltd A15804 SDM79 Ingredient
L-Arginine CalBiochem 1820 SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid ICN Biomedicals 102569 SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x) Sigma B6891 SDM79 Ingredient
Biotin Fisher BP232-1 SDM79 Ingredient
Calcium chloride VWR BDH0224 Cytomix
EDTA Fisher S311-100 Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit Omega Biotek D2500-01 DNA purifiation
Research grade Serum Fisher 03-600-511 SDM79 Ingredient
Folic acid ICN Biomedicals 101725 SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl ICN Biomedicals 194671 SDM79 Ingredient
Glucose GIBCO 15023-021 SDM79 Ingredient
L-Glutamine CalBiochem 3520 SDM79 Ingredient
Glycerol Acros Organics Ac15892-0010 Freezing media
Graces insect cell media powder GIBCO 11300-043 SDM79 Ingredient
Hemin MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Guanosine Avocado Research Chemicals Ltd A11328 SDM79 Ingredient
HEPES MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Magnesium chloride Fisher BP214-500 Cytomix ingredient
L-Methionine Fisher BP388-100 SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x) Cellgro 25-030-CI SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x) Lonza 13-114E SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine Cellgro 10-010-CM SDM79 Ingredient
MOPS Fisher BP308-500 SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate Fisher S233-500 SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution Cellgro 30-002-CI SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine ICN Biomedicals 102623 SDM79 Ingredient
Potassium chloride Fisher P217-500 Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisheer P290-212 Cytomix ingredient
L-Proline Fisher BP392-100 SDM79 Ingredient
L-Serine Acros Organics 56-45-1 SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt Acros Organics 113-24-6 SDM79 Ingredient
L-Taurine TCI America A0295 SDM79 Ingredient
L-Threonine Acros Organics 72-19-5 SDM79 Ingredient
L-Tyrosine ICN Biomedicals 103183 SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit Omega Biotek D6492-02 DNA purification
Binding buffer Omega Biotek PDR041 DNA purification
SPW wash buffer Omega Biotek PDR045 DNA purification
Gene Pulser Xcell Biorad 165-2660 Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes VWR Trypanosome transformation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
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  3. Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
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El uso de proteínas fluorescentes de Seguimiento glicosoma Dinámica en el tripanosoma africano
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Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).More

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).

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