Använda fluorescerande proteiner till Monitor Glycosome Dynamics i den afrikanska trypanosom

Summary

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Abstract

Trypanosoma brucei är en kinetoplastidsjukdomar parasit som orsakar afrikansk trypanosomiasis (HAT), eller sömnsjuka, och en wasting disease, nagana, hos nötkreatur ^1. De parasit alternerar mellan blodomloppet hos däggdjursvärden och tsetseflugan vektorn. Sammansättningen av många cellulära organförändringar som svar på dessa olika extracellulära förutsättningar ^2-5.

Glycosomes är högt specialiserade peroxisomerna där många av de enzymer som är involverade i glykolysen är fack. Glycosome sammansättning förändringar i en utvecklande och miljö reglerat sätt ^4-11. För närvarande är de vanligaste tekniker som används för att studera glycosome dynamik elektron och fluorescensmikroskopi; tekniker som är dyra, tid och arbetskrävande, och inte enkelt anpassas till hög genomströmning analyser.

För att övervinna dessa begränsningar, en fluorescerande-glycosome reporter systemvilket förbättrade gul fluorescerande protein (EYFP) är sammansmält med en peroxisom målsekvens (PTS2), som dirigerar fusionsproteinet till glycosomes ^12, har fastställts. Vid import av PTS2eYFP fusionsprotein, glycosomes blir fluorescerande. Organell nedbrytning och återvinning leder till förlust av fluorescens som kan mätas med flödescytometri. Stora antal celler (5000 celler / sekund) kan analyseras i realtid utan omfattande provberedning såsom fixering och montering. Denna metod ger ett snabbt sätt att upptäcka förändringar i organell sammansättning som svar på varierande miljöförhållanden.

Introduction

Trypanosoma brucei orsakar afrikansk sömnsjuka hos människor och en wasting disease, nagana, hos nötkreatur. Läkemedel som används vid behandling av dessa sjukdomar är föråldrade och extremt giftiga, vacciner är inte tillgängliga, och potentialen för utveckling av resistens kräver sökandet efter nya läkemedelsmål ^1.

Under sin livscykel, T. brucei, växlar mellan en insektsvektor och däggdjursvärd; två värdar som uppvisar mycket olika miljöer där parasiten ska överleva. Flera metabola och morfologiska förändringar som parasiten är exponerad för olika miljöförhållanden. Några av de mest dramatiska förändringar observeras i enkelmembranbundna parasitspecifika mikrokroppar, sk glycosomes ^13.

Glukosnivåerna är relativt höga (~ 5 mM) i blodet och blodomloppet parasiter (BSF) genererar ATP uteslutande genom glykolys while mitokondriemetabolism förträngs ^14. Till skillnad från andra eukaryoter där glykolys sker i cytoplasman, T. brucei compartmentalizes flesta glykolytiska enzymer i glycosomes ^14,15. Parasiterna tas upp av tsetseflugan under en blodmjöl och uppleva en nedgång i glukos, som faller till omätbara nivåer inom 15 min av att förtäras av flugan. Metabolismen av insekt, är mer flexibel och glukos, samt aminosyror, såsom prolin, kan användas i syntesen av ATP ^16-18 procyclic formen (PCF) parasiter. Jämförande proteomik studier visar livscykelberoende förändringar i glycosomal och mitokondriella proteiner med glykolytiska proteiner ökade i blodomloppet parasiter och mitokondriella proteiner involverade i TCA cykeln och andningskedjan ^13,19. Medan många studier har fokuserat på skillnaderna mellan BSF och PCF glycosomes, lite är känt om de förändringar i PCF glycosomes som sker som svar på environmental förändringar.

I hindgut av flugan, glukosnivåerna är låga med gående ökningar under en matning ^20. I de flesta in vitro-studier är PCF parasiter odlas i medier innehållande glukos. Dock har nya studier visat att PCF metabolism förändringar väsentligt som svar på glukos tillgänglighet ^17. I frånvaro av glukos, prolin upptag och prolin dehydrogenasaktivitet ökning ^18. Denna förändring i mitokondriell metabolism är sannolikt åtföljs av en förändring i glycosome sammansättning och morfologi, men detta har inte direkt bedömas.

Electron och fluorescensmikroskopi är vanliga tekniker för att studera glycosome dynamik i T. brucei ^2,21-24. Dessa protokoll är tid och arbetskrävande, dyrt och svårt att anpassa sig till realtidsstudier och hög kapacitet protokoll. För att övervinna denna begränsning, en fluorescent-organell reportersystem used att studera organeller i däggdjurs och jästsystem har ändrats för att användas i T. brucei ^12.

Fluorescerande-organell reportersystem har i stor utsträckning använts i högre eukaryoter såsom jäst, växt, och däggdjursceller ^25-27. I sådana system är en fluorescerande proteinet smält till en aminosyrasekvens som riktar proteinet till specifika organeller. Nedbrytningen eller syntes av de riktade proteiner mäts via fluorescens och förändringar i organell sammansättning avspeglas av förändringar i cellens fluorescens.

När den öppna läsramen för förstärkt gult fluorescerande protein (EYFP) är sammansmält med en typ II peroxisomal målinriktning sekvens (PTS2) ^12, är den PTS2eYFP proteinet importeras till mogna, importkompetenta glycosomes och fluorescens kan övervakas via flödescytometri. Variationer i glycosome sammansättning avspeglas av förändringar i cellulär fluorescens. Detta system kan hjälpa till resolving de mekanismer som reglerar miljö inducerade förändringar i glycosome sammansättning.

Detta manuskript beskriver generering av ett glycosome reportersystem i PCF parasiter i samband med flödescytometri för att övervaka realtids glycosome dynamik i levande parasiter och ger ett exempel på hur den har använts för att följa förändringar i glycosome sammansättning som svar på olika miljöer. Sammanfattningsvis är glycosome sammansättning påverkas av extracellulära glukoskoncentrationer och passage av log-fas kulturer i färskt medium utlöser förändringar i glycosome sammansättning. Detta system kan modifieras för att studera dynamiska beteendet hos andra organeller i trypanosomer och andra parasiter.

Protocol

1. Allmänt trypanosom Husbandry Väg fasta ämnen för SDM79 media beredning (tabell 1). Förvara vid 4 ° C i 50 ml konisk eller en plastpåse. OBS: Reagenser är stabila under minst 6 månader. Thaw fetalt bovint serum (FBS) i en 37 ° C vattenbad, och blanda periodvis genom inversion. OBS: FBS tas emot från leverantören som en steril lösning. Filter sterilisering FBS minskar dess förmåga att stödja parasit tillväxt. När hela flaskan tinas, värme inak…

Representative Results

I detta system har ett glukosberoende förändring glycosome sammansättning observerats. När cellerna odlas i glukosinnehållande media, är två populationer observeras; en ljus och en mörk (Figur 2A). Dim celler hamnen omogna glycosomes, som inte har importerat den PTS2eYFP medan ljusa celler hyser en blandning av mogna och omogna glycosomes 12. När glukos är närvarande i media, är livsfarlig 15,28 mislocalization av glycosome proteiner och glycosome proteinuttryck är san…

Discussion

Glycosomes är viktiga, dynamiska, parasitspecifika organeller. De processer som reglerar biogenesis, underhåll, spridning och ombyggnad av dessa organeller inkluderar sannolikt läkemedelsmål som skulle kunna utnyttjas i terapeutiskt syfte. Trots den potentiellt hög förekomst av sådana läkemedelsmål, har området glycosome biogenesis släpat efter studier av liknande processer i andra organismer, huvudsakligen på grund av avsaknaden av en lätthanterlig, hög genomströmning system för att övervaka snabba, dy…

Materials

Adenosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 Ingredient
L-Alanine	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 Ingredient
L-arginine	CalBiochem	1820	SDM79 Ingredient
p-aminobenzoic acid	ICN Biomedicals	102569	SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X)	Sigma	B6891	SDM79 Ingredient
Biotin	Fisher	BP232-1	SDM79 Ingredient
Calcium Chloride	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit	Omega Biotek	D2500-01	DNA purifiation
Research grade Serum	Fisher	03-600-511	SDM79 Ingredient
Folic acid	ICN Biomedicals	101725	SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 Ingredient
Glucose	GIBCO	15023-021	SDM79 Ingredient
L-glutamine	CalBiochem	3520	SDM79 Ingredient
Glycerol	Acros Organics	Ac15892-0010	Freezing media
Graces insect cell media powder	GIBCO	11300-043	SDM79 Ingredient
Hemin	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Guanosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 Ingredient
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Magnesium Chloride	Fisher	BP214-500	Cytomix ingredient
L-methionine	Fisher	BP388-100	SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50X)	Cellgro	25-030-CI	SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100X)	Lonza	13-114E	SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine	Cellgro	10-010-CM	SDM79 Ingredient
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 Ingredient
Sodium Biocarbonate	Fisher	S233-500	SDM79 Ingredient
Penicillin-Streptomycin Solution	Cellgro	30-002-CI	SDM79 Ingredient
L-phenylalanine	ICN Biomedicals	102623	SDM79 Ingredient
Potassium Chloride	Fisher	P217-500	Cytomix ingredient
Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisheer	P290-212	Cytomix ingredient
L-proline	Fisher	BP392-100	SDM79 Ingredient
L-serine	Acros Organics	56-45-1	SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt	Acros Organics	113-24-6	SDM79 Ingredient
L-taurine	TCI America	A0295	SDM79 Ingredient
L-threonine	Acros Organics	72-19-5	SDM79 Ingredient
L-tyrosine	ICN Biomedicals	103183	SDM79 Ingredient
E.Z.N.A.Cycle Pure kit	Omega Biotek	D6492-02	DNA purification
Binding buffer	Omega Biotek	PDR041	DNA purification
SPW wash buffer	Omega Biotek	PDR045	DNA purification
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	Trypanosome transformation
4 mm electroporation cuvettes	VWR		Trypanosome transformation