Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Använda fluorescerande proteiner till Monitor Glycosome Dynamics i den afrikanska trypanosom

doi: 10.3791/51647 Published: August 19, 2014

Abstract

Trypanosoma brucei är en kinetoplastidsjukdomar parasit som orsakar afrikansk trypanosomiasis (HAT), eller sömnsjuka, och en wasting disease, nagana, hos nötkreatur 1. De parasit alternerar mellan blodomloppet hos däggdjursvärden och tsetseflugan vektorn. Sammansättningen av många cellulära organförändringar som svar på dessa olika extracellulära förutsättningar 2-5.

Glycosomes är högt specialiserade peroxisomerna där många av de enzymer som är involverade i glykolysen är fack. Glycosome sammansättning förändringar i en utvecklande och miljö reglerat sätt 4-11. För närvarande är de vanligaste tekniker som används för att studera glycosome dynamik elektron och fluorescensmikroskopi; tekniker som är dyra, tid och arbetskrävande, och inte enkelt anpassas till hög genomströmning analyser.

För att övervinna dessa begränsningar, en fluorescerande-glycosome reporter systemvilket förbättrade gul fluorescerande protein (EYFP) är sammansmält med en peroxisom målsekvens (PTS2), som dirigerar fusionsproteinet till glycosomes 12, har fastställts. Vid import av PTS2eYFP fusionsprotein, glycosomes blir fluorescerande. Organell nedbrytning och återvinning leder till förlust av fluorescens som kan mätas med flödescytometri. Stora antal celler (5000 celler / sekund) kan analyseras i realtid utan omfattande provberedning såsom fixering och montering. Denna metod ger ett snabbt sätt att upptäcka förändringar i organell sammansättning som svar på varierande miljöförhållanden.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trypanosoma brucei orsakar afrikansk sömnsjuka hos människor och en wasting disease, nagana, hos nötkreatur. Läkemedel som används vid behandling av dessa sjukdomar är föråldrade och extremt giftiga, vacciner är inte tillgängliga, och potentialen för utveckling av resistens kräver sökandet efter nya läkemedelsmål 1.

Under sin livscykel, T. brucei, växlar mellan en insektsvektor och däggdjursvärd; två värdar som uppvisar mycket olika miljöer där parasiten ska överleva. Flera metabola och morfologiska förändringar som parasiten är exponerad för olika miljöförhållanden. Några av de mest dramatiska förändringar observeras i enkelmembranbundna parasitspecifika mikrokroppar, sk glycosomes 13.

Glukosnivåerna är relativt höga (~ 5 mM) i blodet och blodomloppet parasiter (BSF) genererar ATP uteslutande genom glykolys while mitokondriemetabolism förträngs 14. Till skillnad från andra eukaryoter där glykolys sker i cytoplasman, T. brucei compartmentalizes flesta glykolytiska enzymer i glycosomes 14,15. Parasiterna tas upp av tsetseflugan under en blodmjöl och uppleva en nedgång i glukos, som faller till omätbara nivåer inom 15 min av att förtäras av flugan. Metabolismen av insekt, är mer flexibel och glukos, samt aminosyror, såsom prolin, kan användas i syntesen av ATP 16-18 procyclic formen (PCF) parasiter. Jämförande proteomik studier visar livscykelberoende förändringar i glycosomal och mitokondriella proteiner med glykolytiska proteiner ökade i blodomloppet parasiter och mitokondriella proteiner involverade i TCA cykeln och andningskedjan 13,19. Medan många studier har fokuserat på skillnaderna mellan BSF och PCF glycosomes, lite är känt om de förändringar i PCF glycosomes som sker som svar på environmental förändringar.

I hindgut av flugan, glukosnivåerna är låga med gående ökningar under en matning 20. I de flesta in vitro-studier är PCF parasiter odlas i medier innehållande glukos. Dock har nya studier visat att PCF metabolism förändringar väsentligt som svar på glukos tillgänglighet 17. I frånvaro av glukos, prolin upptag och prolin dehydrogenasaktivitet ökning 18. Denna förändring i mitokondriell metabolism är sannolikt åtföljs av en förändring i glycosome sammansättning och morfologi, men detta har inte direkt bedömas.

Electron och fluorescensmikroskopi är vanliga tekniker för att studera glycosome dynamik i T. brucei 2,21-24. Dessa protokoll är tid och arbetskrävande, dyrt och svårt att anpassa sig till realtidsstudier och hög kapacitet protokoll. För att övervinna denna begränsning, en fluorescent-organell reportersystem used att studera organeller i däggdjurs och jästsystem har ändrats för att användas i T. brucei 12.

Fluorescerande-organell reportersystem har i stor utsträckning använts i högre eukaryoter såsom jäst, växt, och däggdjursceller 25-27. I sådana system är en fluorescerande proteinet smält till en aminosyrasekvens som riktar proteinet till specifika organeller. Nedbrytningen eller syntes av de riktade proteiner mäts via fluorescens och förändringar i organell sammansättning avspeglas av förändringar i cellens fluorescens.

När den öppna läsramen för förstärkt gult fluorescerande protein (EYFP) är sammansmält med en typ II peroxisomal målinriktning sekvens (PTS2) 12, är den PTS2eYFP proteinet importeras till mogna, importkompetenta glycosomes och fluorescens kan övervakas via flödescytometri. Variationer i glycosome sammansättning avspeglas av förändringar i cellulär fluorescens. Detta system kan hjälpa till resolving de mekanismer som reglerar miljö inducerade förändringar i glycosome sammansättning.

Detta manuskript beskriver generering av ett glycosome reportersystem i PCF parasiter i samband med flödescytometri för att övervaka realtids glycosome dynamik i levande parasiter och ger ett exempel på hur den har använts för att följa förändringar i glycosome sammansättning som svar på olika miljöer. Sammanfattningsvis är glycosome sammansättning påverkas av extracellulära glukoskoncentrationer och passage av log-fas kulturer i färskt medium utlöser förändringar i glycosome sammansättning. Detta system kan modifieras för att studera dynamiska beteendet hos andra organeller i trypanosomer och andra parasiter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Allmänt trypanosom Husbandry

  1. Väg fasta ämnen för SDM79 media beredning (tabell 1).
  2. Förvara vid 4 ° C i 50 ml konisk eller en plastpåse. OBS: Reagenser är stabila under minst 6 månader.
  3. Thaw fetalt bovint serum (FBS) i en 37 ° C vattenbad, och blanda periodvis genom inversion. OBS: FBS tas emot från leverantören som en steril lösning. Filter sterilisering FBS minskar dess förmåga att stödja parasit tillväxt.
  4. När hela flaskan tinas, värme inaktivera serum under 30 min i ett 56 ° C vattenbad, blandning periodiskt för att minimera utfällning av serumkomponenter.
  5. Thaw penicillin / streptomycin-lösning (pen / strep), hemin (2 mg / ml i 50 mM NaOH), och basalmedium lösning örn vitamin vid rumstemperatur.
  6. Till en 1000 ml mätcylinder, tillsätt 20,2 g SDM79 fasta ämnen (tabell 1) och de flytande komponenterna (tabell 2) och blanda väl på en omrörningsplatta.
  7. Justera pH till 7,35, och en volym på 850 ml med vatten.
  8. Filtrera sterilisera mediet genom att fästa en vakuumslangen till botten av en filterflaska. Applicera vakuum tills lösningen filtreras.
  9. Ta bort filtret överst i biosäkerhet skåpet och tillsätt 150 ml värmeinaktiverad FBS. Ta bort plasthöljet från sterila lock och tätningsmedieflaskan.
  10. Förbered SDM80 media på samma sätt som SDM79 med följande undantag; lägg inte till glukos eller glukosamin och använd MEM utan glutamin. I stället för 150 ml värmeinaktiverat FBS, tillsätt 135 ml dialyserat, värmeinaktiverat FBS och 15 ml värmeinaktiverad FBS.
  11. Kultur PCF parasiter i 25 cm 2-kolv med 10 ml lämpligt medium vid 27 ° C och 5% CO2. OBS: Celler bör räknas dagligen med hjälp av en hemocytometer eller flödescytometer (se avsnitt 6) och kulturer bör hållas vid densiteter mellan 1 x 10 5 och 5 x 10 6 celler / ml.

2. Transfection av PCF Parasiter med den fluorescerande reporterkonstruktionen

OBS: För att följa glycosome dynamik, en reporterprotein innehållande peroxisomal målinriktning sekvensen (PTS2) av aldolas fuserad till förstärkt gula fluorescerande proteinet uttrycks i parasiterna. Den sekvens som kodar för fusionsproteinet klonas in pXS2bla 12, som innehåller procyclin promotorn och de tubulin intergena regioner som direkt homolog rekombination in i genomet och blasticidin resistensgen för selektion. Procyclic cellinjer som härbärgerar de gener som kodar för T7-polymeras och tetracyklin-repressorn (PF29-13) transformeras med den målriktade konstruktionen, pXS2: PTS2eYFP.

  1. Förbered cytomix genom att blanda de komponenter som anges i tabell 3. Filtrera sterilisera och förvara vid RT.
  2. Linjärisera plasmid-DNA med Mlul genom pipettering 10 | il DNA (1 ug / ul), 5 ^ il restriktionsenzym-buffert, 33 | il vatten och 2 μ; L MluI enzym i ett mikrocentrifugrör. Inkubera vid 37 ° C under 1 tim.
  3. Rena den restriktionsnedbrytning genom att tillsätta en volym av bindningsbuffert till restriktionsenzymdigerering. Blanda bindande buffert och digererades DNA: t genom att vortexa. Centrifugera kort för att samla in provet vid botten av röret.
  4. Sätt i ett DNA-bindande kolumn i en 2 ml provrör, och överföring diger DNA / bindningsbuffert lösning på kolumnen.
  5. Centrifugera för 10.000 xg i 1 min. Efter centrifugering, kasta filtrat från provröret och åter kolumnen till uppsamlingsröret.
  6. Lägg 700 l av SPW tvättbuffert och centrifugera vid 10000 xg i 1 min.
  7. Släng filtrat från provröret, tillbaka kolumnen till uppsamlingsröret och upprepa SPW tvättsteg och centrifugering.
  8. Discard filtrat, retur-kolonn till uppsamlingsröret, och centrifugera tom kolumn 3 minuter vid 10.000 x g för att avlägsna rester av etanol.
  9. I en biosäkerhet skåp, kasta bort colling röret och plats kolonn i ett sterilt mikrocentrifugrör.
  10. För att eluera DNA, tillsätt 25 | il sterilt vatten till kolonn och inkubera vid rumstemperatur under 2 min. Centrifugera vid 10000 xg i 1 min.
  11. Lägg till ytterligare 25 | il sterilt vatten i biosäkerhet huva till kolonn och inkubera vid rumstemperatur under 2 min.
  12. Centrifugera vid 10.000 xg hastighet under en min.
  13. I en biosäkerhet skåp överföra hela volymen av DNA till en ny steril mikrocentrifugrör. OBS: Detta steg förhindrar förorening från den öppna locket under centrifugering.
  14. Tillsätt steril, renas, lineariserad DNA (10 ^ g) till 400 | il filtersteriliserade cytomix.
  15. Räkna celler som beskrivs i avsnitt 6 och skörda 5 x10 7 -10 8 celler genom centrifugering vid 800 xg under 15 minuter vid rumstemperatur.
  16. Häll av supernatanten och suspendera cellpelleten i 450 l av DNA + cytomix med hjälp av en 1 ml serologisk pipett.
  17. Transfer lösning innehållande ce lls, DNA och cytomix till en steril 4 mm gap kyvett och plats kyvett i elektrokammaren.
  18. Välj "Exponentiell förfall" och manuellt ange följande inställningar: Spänning: 1,5 kV, kapacitans: 25 mF, Resistance: Ω, och Cuvette: 4 mm. Tryck puls. När pulsen är klar, ta bort kyvetten från elektrokammaren och återgå till biosäkerhet skåp.
  19. In i en ny steril kolv, pipett 10 ml SDM79. Överför de transformerade cellerna till kolven med 10 ml SDM79.
  20. Inkubera UTAN läkemedelsselektion för 24 timmar vid 27 ° C, 5% CO2. Efter 24 h, tillsätt G418 (15 pg / ml), hygromycin (50 | ig / ml) och blasticidin (10 pg / ml). Pass 1 ml transformerade celler med drogen i 9 ml SDM79 med läkemedel.
  21. Analysera celler dagligen som beskrivs i avsnitt 6 och 7 När cellerna är fluorescerande, och har nått en celltäthet av 1 x 10 7 / ml, gör stabilates för långtidslagring (3,1-3,3).
ve_title "> 3. Making Stabilates

  1. För att göra frysning medier, tillsätt en lika volym av 100% glycerol till cytomix och filter sterilisera.
  2. Tillsätt 200 l av frysning media till 800 l av celler (1 x 10 7) i en cryovial, blanda försiktigt genom inversion och rum mellan två frigolitställ och frys vid -80 ° C.
  3. När frysta (~ 24 h), överföra celler till flytande kväve. OBS: Det är viktigt att flytta celler i LN 2 efter 24 timmar, som längre förvaring vid -80 ° C leder till en sänkning av cellernas viabilitet.

4. Upptining Frysta Stocks

  1. Avlägsna fryst ampull från -80 ° C och tining vid RT under cirka 10 min.
  2. Pipettera 9 ml SDM79 med läkemedlet i en ny steril kolv. Lägg tinade cellerna till denna kolv. Passera celler 1:10 genom att tillsätta 1 ml av denna kultur till 9 ml SDM79 i en ny kolv (slutlig koncentration av 1 x 10 5 / ml).
  3. Innan cellerna når en densitet på 10 7 / ml, börjar cytometer inställdupp och utspädningsanalyser.

5. Cytometer Setup

  1. Slå på flödescytometern och öppna CFlow Plus. OBS: Innan du kör några prover bör flödeskunskap skall backspolas och sköljas enligt steg från 5,2 till 5,7.
  2. Ersätt röret av nanorent vatten i vilket SIP är lagrad med ett tomt rör.
  3. Välj "backspolning" knappen.
  4. När back är klar tar mikrocentrifugrör från sip och göra sig av med.
  5. Placera en ny mikrocentrifugrör innehållande 1 ml ny nanorent vatten på sip.
  6. Välj en ny brunn i CFlow programmet. Under "Run Limits" ställa in tiden för 2 min. Under "Fluidics" välj "snabbt" och "Kör".
  7. När 2 min tidsfristen är klar klickar du på "Ta bort exempeldata" knappen.

6. cellräkning med hjälp av flödescytometer

  1. Byt vatten med provet ska räknas. Ställ in "Kör Gränser "till 30 sekunder," Fluidics "till" snabb "och välj sedan" Kör ".
  2. Efter 30 sek tidsfristen är klar CFlow plus ger händelserna / l under "Senaste Kör." Upprepa antalet för varje kultur. OBS: Innan cellerna når 1 x 10 7 celler / ml, fortsätt med utspädningsanalys. Celler bör avbrytas efter ett späd analysen är klar. Celler odlade under längre perioder förlorar sin förmåga att reagera på miljöförhållanden.

7 Mätning Fluorescens hjälp av flödescytometer

  1. För att bedöma fluorescens, ange "Run Limits" till 10000 händelser och "Fluidics" till "långsam". Välj "Set tröskel". Under "Primär Threshold", välj "Permanent eliminera händelserna på", "FSC-H" (i listrutan) och skriv in mindre än 30.000. Klicka på "Apply" och sedan "stänga".
  2. Välj220; Histogram "i en av de nya tomten fönster och välj" FSC-A "från rullgardinsmenyn väljer du" FL1-A ". OBS: FL1-A åtgärder fluorescens i 530 nm våglängd.
  3. Välj "Kör" och upprepa för alla kulturer.
  4. Kör rengöringslösning genom fluidik linje för 2 min och vatten under 2 min.

8. Utspädnings Analyser

  1. Passera celler till en densitet av 1 x 10 5 celler / ml i 3 ml SDM79 i en 25 cm 2 odlingskolv och mäta blomningstid omedelbart efter passagen och sedan vid 3 tim och 24 tim.

9. Data Analysis

  1. Välj "Analysera" fliken på CFlow Plus.
  2. Klicka på "Histogram" under "Gör en ny tomt." Välj "FSC-A" och en rullgardinsmeny visas. Välj kanal "FL1-A."
  3. Markera en brunn att analysera. Välj "Gate" knappen och dra en grind manuelltför befolkningen av intresse.
  4. Flow Plus ger cell "Count" inom denna grind och "% av denna Plot".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I detta system har ett glukosberoende förändring glycosome sammansättning observerats. När cellerna odlas i glukosinnehållande media, är två populationer observeras; en ljus och en mörk (Figur 2A). Dim celler hamnen omogna glycosomes, som inte har importerat den PTS2eYFP medan ljusa celler hyser en blandning av mogna och omogna glycosomes 12. När glukos är närvarande i media, är livsfarlig 15,28 mislocalization av glycosome proteiner och glycosome proteinuttryck är sannolikt nära kopplad med import. Denna snäva reglering är ansvarig för uppkomsten av dunkla celler där glycosome proteinuttryck hämmas när cellerna saknar tillräcklig importkapacitet. När glycosome import maskiner är helt monterade och funktionella, de celler uttrycker glycosome proteiner, som sedan importeras till glycosomes, vilket ger fluorescerande celler. I glukos tömmer medier är mislocalization av glycosome proteiner tolererard 15, och den bimodala populationsfördelning är ersatt av en enda topp med ett bredare område av fluorescens (figur 2B).

Detta system har använts för att identifiera förhållanden som utlöser förändringar i glycosome sammansättning. När höga densitet kulturer som innehåller ~ 10% dim celler (Figur 3A) förs in i nya medier, det finns en övergående ökning av andelen dim celler (Figur 3B). Genom 24 tim. den ursprungliga befolkningsfördelning återupprättas (figur 3C).

SDM79 Solids Vikt (g / l)
Graces insektscellmedie pulver 2
Glukos 1
HEPES 8
MOPS 5
NaHCOs 3 2
Natriumpyruvat 0,1
L-alanin 0,2
L-arginin 0,1
L-glutamin 0,3
L-Methonine 0,07
L-Fenylalanin 0,08
L-prolin 0,6
L-serin 0,06
L-taurin 0,16
L-Treonin 0,35
L-Tyrosin 0,1
Adenosin 0,01
Guanosin 0,01
Glukosamin HCl 0,05
Folsyra 0,004
r-aminobensoesyra 0,002
Biotin 0,0002

Tabell 1. SDM79 fasta komponenter. Solid mediakomponenter och mängden (g / l) tillhandahålls.

SDM79
MEM med glutamin 600 ml
Pen / Strep 10 ml
BME vitaminlösning 10 ml
MEM aminosyror lösning 8 ml
MEM icke essentiell aminosyra lösning 6 ml
Hemin 3,75
Vatten 162,25 ml

Tabell 2 SDM79 flytande komponenter. Volymer ml ges.

För 20 ml
120 mM KCl 1,4 ml (1 M)
0,15 mM CaCl2 3 ml (1 M)
10 mM K 2 HPO 4 400 ml (0,5 M)
25 mM HEPES 500 ml (1 M)
2 mM EDTA 80 ml (0,5 M)
5 mM MgCl2 100 ml (1 M)
Vatten 16,52

Tabell 3. Cytomix recept.

Figur 1
Figur 1. Fluorescerande glycosome reportersystem. A) PTS2eYFP expressionskonstrukt integration. PCF trypanosomer transformerades med pXS2PTS2eYFP plasmid linjär med restriktionsenzymet Mlul. Denna konstruktion integreras via homolog rekombination i tubulin locus (Tub) och PARP-sekvenser (PARP) inkluderar promotorn som driver konstitutivt uttryck av PTS2eYFP och sekvenserna som behövs för RNA bearbetning. B) PTS2eYFP import. PTS2eYFP syntetiseras i cytoplasman där det binder den lösliga receptorn, PEX7 vilken levererar rapportörprotein till glycosomes. När levereras till glycosome membranet, är proteinet importeras. Mogna organeller som innehåller import maskiner import PTS2eYFP och fluorescens medan de som inte innehåller funktionella import maskiner förblir dunkel.

Figur 2
Figur 2. glukosberoende glycosome komposition. PCF-celler odlades i SDM79 (+ Glc) eller SDM80 (-Glc) ochanalyserades med flödescytometri. Histogram för 10.000 evenemang. A) Analys av celler odlade i SDM79 avslöjar gående två toppar. Fluorescerande celler hyser en blandning av mogna och omogna organeller med celler från högre fluorescensintensiteter har mer mogna glycosomes. I SDM79 är mislocalization av glycosome proteiner dödliga och glycosome proteinuttryck och import måste hårt kontrollerad. Detta återspeglas i frånvaro av celler med mellanliggande fluorescensintensiteter. B) I SDM80 är mislocalization av glycosome proteiner tolereras, det bimodala befolkningsfördelningen är förlorat, och celler av mellanliggande fluorescens observeras.

Figur 3
Figur 3 Glycosome ombyggnad. Ombyggnad av glycosomes utlöses av passage in färskt medium. 6 / ml). B) 3 h efter utspädning till frisk SDM79 sker en ökning av andelen dim celler med omogna glycosomes omfattas vänster gate C ) Histogram av den utspädda kulturen efter 24 timmar. Efter 24 timmar har befolkningen fördelningen återgått till det normala, eftersom de omogna glycosomes innehåller nu peroxisom proteiner som krävs för att importera det fluorescerande proteinet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glycosomes är viktiga, dynamiska, parasitspecifika organeller. De processer som reglerar biogenesis, underhåll, spridning och ombyggnad av dessa organeller inkluderar sannolikt läkemedelsmål som skulle kunna utnyttjas i terapeutiskt syfte. Trots den potentiellt hög förekomst av sådana läkemedelsmål, har området glycosome biogenesis släpat efter studier av liknande processer i andra organismer, huvudsakligen på grund av avsaknaden av en lätthanterlig, hög genomströmning system för att övervaka snabba, dynamiska, organell svar i levande celler.

Fluorescerande-organell reportersystem har använts för att studera organell dynamiken i högre eukaryoter såsom jäst, växter, svampar och däggdjur 23-25. Vi har skapat en transgen stam av PCF parasiter som uttrycker PTS2eYFP som riktade till mogna glycosomes, vilket gav fluorescerande organeller. Förändringar i glycosome sammansättning kan övervakas via följande cellulär fluorescens. Med användning av detta system, har vi funnit att miljöförhållanden, i synnerhet glukos, reglera glycosome komposition 12.

I motsats till mikroskopimetoder ofta används för att studera organell dynamiken i kinetoplastidsjukdomar parasiter, erbjuder detta reporter systemet en metod för att snabbt screena föreningar och förutsättningar som påverkar övergripande glycosome dynamik. Men förändringarna i fluorescens spegla förändringar i totalkompositioner organell. Ytterligare biokemiska och mikroskopiska experiment krävs för att fastställa de särskilda molekylära skillnader mellan cellpopulationer uppvisar olika fluorescensintensiteter.

Vi har identifierat ett antal kritiska steg i remodeling analyser. Intressant nog har vi funnit att när cellerna odlas under längre perioder (mer än två pass), är oförutsägbar deras beteende som svar på miljöförändringar. Efter långvarig odling, celler gått från höga tätheter i friska media, uppvisar en tillfällig ökning av det dunkla befolkningen, vilket indikerar att de fortfarande kan renovera glycosomes, men dör efter 24 timmar. Vi har också stött på situationer där ingen ombyggnad observeras. Anledningen till detta beteende är oklart men vi har funnit att när celler hanteras som beskrivs här (begränsa antalet cellpassager till två och odlingarna under 1 x 10 7 / ml), är glycosome ombyggnad reproducerbar. När cellerna inte längre reagerar på miljöförhållanden, retransforming celler med reportern-konstruktionen plasmid oftast rättar till detta.

Även detta system har använts för att studera glycosome beteende i afrikanska trypanosomer, kan det också antas till studier av organeller i andra parasiter genom att smälta fluorescerande proteiner till aminosyrasekvenser som direkt protein lokalisering till andra cellulära avdelningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine Avocado Research Chemicals Ltd A10781 SDM79 Ingredient
L-Alanine Avocado Research Chemicals Ltd A15804 SDM79 Ingredient
L-Arginine CalBiochem 1820 SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid ICN Biomedicals 102569 SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x) Sigma B6891 SDM79 Ingredient
Biotin Fisher BP232-1 SDM79 Ingredient
Calcium chloride VWR BDH0224 Cytomix
EDTA Fisher S311-100 Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit Omega Biotek D2500-01 DNA purifiation
Research grade Serum Fisher 03-600-511 SDM79 Ingredient
Folic acid ICN Biomedicals 101725 SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl ICN Biomedicals 194671 SDM79 Ingredient
Glucose GIBCO 15023-021 SDM79 Ingredient
L-Glutamine CalBiochem 3520 SDM79 Ingredient
Glycerol Acros Organics Ac15892-0010 Freezing media
Graces insect cell media powder GIBCO 11300-043 SDM79 Ingredient
Hemin MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Guanosine Avocado Research Chemicals Ltd A11328 SDM79 Ingredient
HEPES MP Biomedicals 194025 SDM79 Ingredient
Magnesium chloride Fisher BP214-500 Cytomix ingredient
L-Methionine Fisher BP388-100 SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x) Cellgro 25-030-CI SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x) Lonza 13-114E SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine Cellgro 10-010-CM SDM79 Ingredient
MOPS Fisher BP308-500 SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate Fisher S233-500 SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution Cellgro 30-002-CI SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine ICN Biomedicals 102623 SDM79 Ingredient
Potassium chloride Fisher P217-500 Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous Fisheer P290-212 Cytomix ingredient
L-Proline Fisher BP392-100 SDM79 Ingredient
L-Serine Acros Organics 56-45-1 SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt Acros Organics 113-24-6 SDM79 Ingredient
L-Taurine TCI America A0295 SDM79 Ingredient
L-Threonine Acros Organics 72-19-5 SDM79 Ingredient
L-Tyrosine ICN Biomedicals 103183 SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit Omega Biotek D6492-02 DNA purification
Binding buffer Omega Biotek PDR041 DNA purification
SPW wash buffer Omega Biotek PDR045 DNA purification
Gene Pulser Xcell Biorad 165-2660 Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes VWR Trypanosome transformation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
  2. Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
  3. Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
  4. Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
  5. Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
  6. Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
  7. Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
  8. Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
  9. Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
  10. Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
  11. Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
  12. Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
  13. Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
  14. Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
  15. Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
  16. Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
  17. Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
  18. Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
  19. Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
  20. Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
  21. Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
  22. Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
  23. Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
  24. Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
  25. Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
  26. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
  27. Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
  28. Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).
Använda fluorescerande proteiner till Monitor Glycosome Dynamics i den afrikanska trypanosom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).More

Bauer, S., Conlon, M., Morris, M. Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome. J. Vis. Exp. (90), e51647, doi:10.3791/51647 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter