Abstract
Bestimmte Arten von Chemotherapien können akute Gefäßveränderungen, die in langfristigen Bedingungen, die den Patienten zu einem erhöhten Risiko von vaskulären Erkrankungen begünstigen können, fortschreiten kann auszuüben. Doch wenn auch der Befestigungs klinische Beweise, gibt es einen Mangel an klaren Studien des vaskulären Toxizität und daher der Ätiologie einer heterogenen Gruppe von Gefäß / kardiovaskulären Störungen noch aufgeklärt werden. Darüber hinaus kann der Mechanismus, der vaskulären Toxizität zugrunde liegen vollständig unterscheiden sich von den Grundsätzen der Chemotherapie-induzierter Kardiotoxizität, die in Beziehung steht zu Myozyten Verletzungen zu lenken. Wir haben eine Echtzeit eingerichtet, in vivo molekularen Bildgebung Plattform, um die mögliche akute vaskuläre Toxizität von Antikrebstherapien zu bewerten.
Wir haben eine Plattform für in vivo, hochauflösende molekulare Bildgebung bei Mäusen, die für die Visualisierung Gefäßsystem im geschlossenen Organe und Referenz blo eingestelltod Gefäße innerhalb derselben Personen während jedes einzelnen dienen als seine eigene Kontrolle. Wände der Blutgefäße wurden nach Doxorubicin Verwaltung beeinträchtigt, was einen einzigartigen Mechanismus von vaskulären Toxizität, die der frühes Ereignis in der Endorgane Verletzung sein kann. Hierbei wird das Verfahren zum fibered konfokale Fluoreszenzmikroskopie (FCFM) basierend Abbildungs beschrieben, die einen innovativen Modus bietet den physiologischen Phänomenen auf zellulärer und subzellulärer in Tier Themen zu verstehen.
Introduction
Klinische Daten zeigen, dass verschiedene Klassen von Chemotherapien zu entlocken eine Vielzahl von Gefäßerkrankungen von Raynaud-Phänomen, Bluthochdruck, myocardialinfarction, zerebrovaskuläre Angriff und Lebervenen occlusivedisease 1,2 manifestiert. "'Unbeabsichtigter' anti-angiogenen Drogen" ist ein recht neuer Begriff, der herkömmliche Chemotherapeutika, die als mögliche Angiogenese-Inhibitoren wirken beschreibt, obwohl sie ursprünglich nicht für diesen Zweck entwickelt, aber 3-5 entwickelt, um Tumorzellen zu eliminieren durch Auferlegung so wenig "Sicherheiten Schaden "zu normalen Zellen wie möglich 3. Mehrere Chemotherapien wurden als vasculo-Giftstoffe angedeutet worden, wie in klinischen Studien mit Serum-Biomarkern beobachtet. Unter diesen sind Alkylierungsmittel (wie Cyclophosphamid), Platin-Verbindungen (wie Cisplatin) und Anthrazyklinen 1,2,5-7.
Akute kardiovaskulären Komplikationen können als resul auftretent von vaskulären Toxizität durch Chemotherapie. Sie können in chronischen Erkrankungen wie Arteriosklerose und machen erhöhtes Risiko für Spät vaskulären Morbidität Fortschritt. Trotz Montage klinische Beweise, gibt es einen Mangel an bezeichneten Studien, in der der Mechanismus der Gefäß Toxizität und daher ist eine weitere Erläuterung der genaue Pathogenese sie anrichten gerechtfertigt.
Eine große Herausforderung bei der Aufdeckung des Mechanismus der Chemotherapie-induzierter vaskulärer Toxizität ergibt sich aus der Komplexität der Untersuchung von Gefäßfunktion in vivo. Wir beschreiben hier eine Plattform für hochauflösende in vivo molekulare Bildgebung bei Mäusen, die den Blutfluss und Schiffe Eigenschaften erfassen können. Diese Plattform erleichtert den Nachweis der direkten Behandlung induzierten vaskulären Wirkungen: in Echtzeit, sowie die folgenden sie über eine Zeitdauer, innerhalb der gleichen Individuen.
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Protocol
Ethics Statement: Alle Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Tierpflege war gemäß gültiger Richtlinien. ICR weibliche Mäuse (7-8 Wochen alt, 25 bis 30 g) wurden in Klimaanlage, Licht gesteuert Tiereinrichtungen des Sackler Fakultät für Medizin in Tel-Aviv Universität untergebracht. Am Begriff wurden die Tiere mit Narkosedosis euthanasiert.
1. Fibred konfokale Fluoreszenzmikroskopie (FCFM) Kalibrierung
- Schalten Sie das Gerät EIN.
- Schließen Sie die Mikrosonde (mini0 / 30).
- Kalibrieren der Vorrichtung nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Mäuse Vorbereitung für Imaging
- Anesthetize durch eine subkutane Injektion von sowohl Ketaset (100 mg / kg) und XYL-M2 (6 mg / kg). Überprüfen Sie die Betäubung durch Teilnahmslosigkeit bis Fuß-Prise.
- Inzision der Haut unter der Leiste, um zeigen die Oberschenkel arteriellen Gefäße. Halten Sie die Inzisionsstelle feucht mit Kochsalzlösung nach Einschnitt.
- Heizen Sie den Schwanz durch die Verwendung eines Beutels (oder einen Handschuh) mit warmem Wasser (nicht zu heiß zum Anfassen) für ca. 30 sec gefüllt. Vorbereiten eines intravenösen (IV) Shunt zur Verabreichung von FITC-Dextran (ein Kontrastmittel) und entweder Kochsalzlösung oder chemotherapeutisches Mittel, durch Einführen einer Nadel (30 G, 1/2 Zoll) in die Schwanzvene und Anbringen einer 1 ml Spritze, um es . Achten Sie darauf, die Ader ist durch die Injektion von Kochsalzlösung auf.
Hinweis: eine IV-Verabreichung von FITC-Dextran (mit hohem Molekulargewicht; 100 & mgr; l; 10 mg / ml; 2.000 kDa) erleichtert die Visualisierung des Oberschenkel Mikrovaskulatur von FCFM. Doxorubicin (100 ul, 8 mg / kg Adriamycin) oder Kochsalzlösung wird ebenfalls später verabreicht werden IV in die vorgewärmte Schwanzvene. - Bewegen Sie die Maus supinely auf einer Polystyrol-Bühne. Sichern Sie die Maus auf dem Pad und zu pflegen, die mithilfe von chirurgischen Klebeband.
Anmerkung: (1) Mikrosonde (mini0 / 30): Die Fasern versehenen Konfokalmikroskop in dieser Studie verwendet wird, aus zwei Einheiten zusammengesetzt ist. (2) Laserscaneinheit (LSU-488; 488 nm Wellenlänge).
- Führen Sie alle Zeit-Runden-Analysen unter Verwendung der LSU 488 nm Wellenlängen-Laser.
HINWEIS: Das Hauptgerät Detektor die gefiltert (500 bis 650 nm) emittierte Fluoreszenz. Die aufgenommenen Bilder werden anschließend wieder aufgebaut und mit einer Geschwindigkeit von 12 Bildern / s angezeigt. - Trennen Sie vorsichtig die Spritze von der Nadel und fügen Sie eine neue Spritze mit FITC-Dextran. Verwalten (IV) 100 ul FITC-Dextran.
- Verschieben Sie die Mikrosonde (mini0 / 30) an eine geeignete Sichtfeld und fixiert es, nach Anpassung an die z-Achse, um das entsprechende Bild zu erhalten. Warten Sie auf das Anfangssignal zu verblassen, bis eine klare und fokussierte Signal visible.
- Nehmen Sie eine Grundlinie Blutfluss für kurze Stabilisierungsphase (~ 30 sec). Schließen Sie dann auf die Nadel eine andere Spritze, die entweder Doxorubicin oder Kochsalzlösung. IV verwalten 100 ul Doxorubicin oder Kochsalzlösung.
- Überwachung der Strömung des eingespritzten FITC-Dextran kontinuierlich für 20 min. Auf der FCFM-zugehörige Software, verwenden Sie die Schaltfläche Durchmesser am oberen Lineal, um die Blutgefäße zu messen und kategorisieren sie als kleine (<15 um) oder große (> 15 um).
- Euthanize das Tier mit Narkosedosis.
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Representative Results
In-vivo-Bildgebung bei kontinuierlichen Echtzeit-
Die bildgebende Vorrichtung verwendet, hier ist ein hochauflösendes, fibered konfokalen Mikroskop, mit einer Sonde, die Visualisierung des Gefäßsystems und ihre Reaktion auf verschiedene Stimuli, wie Chemotherapie ermöglicht. Dieses Verfahren ist minimal-invasiv, da, obwohl es Bildgebung der tiefen Gefäße oder Organe zu erleichtern, einen kleinen Einschnitt für die Sonde erfordert. Die Sondenbündel bestehen aus Zehntausenden von Fasern, Mikroskopoptiken und einem proprietären Präzisions-Anschluss. Eine schematische Darstellung ist in Figur 1 gezeigt.
Imaging von Oberschenkel Mikrovaskulatur
Von FCFM bei Mäusen mit FITC-Dextran injiziert; Wir haben das Netz der Oberschenkelblutgefäßsystem nach Schiffen Durchmesser klassifiziert (15 & mgr; klein <groß 15 & mgr;>). Eine schnelle Vasokonstriktion (2-5 min) kleiner Gefäße wurde von Doxorubicin induziert. Eine vollständige disappearance des FITC-Dextran fluoreszierende, 8 min nach Behandlung mit Doxorubicin (2A zB Pfeile, Video 1). In einigen Mäusen, Reduktion des Fluoreszenzsignals in das Blutgefäß und zu erhöhen Signal seine Umgebung wurde im perivaskulären Bereich, wenige Sekunden nach Verabreichung von Doxorubicin (2B g, Pfeile) beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Erhöhung der Gefäßpermeabilität und die Leckage des Hochmolekularen Dextrans aus dem Blutgefäß zu dem umgebenden Gewebe. Kein Fluoreszenzsignal war offensichtlich nach der Verabreichung von Doxorubicin in Mäusen, die zuvor nicht mit FITC-Dextran injiziert. Paclitaxel behandelten Mäuse zeigten ähnliche Blutgefäße Struktur und Fließgeschwindigkeit wie in physiologischer Kochsalzlösung injizierten Mäusen (nicht dargestellt) beobachtet wird, in der gesamten Messperiode.
Abbildung 1. Die FCFM Das konfokale Mikroskop verwendet wird hier aus zwei Einheiten: die Mikrosonde (mini0 / 30) und der Laser-Abtasteinheit (LSU-488; 488 nm Wellenlänge)..
Abbildung 2. Bilder von FITC-Dextran Fluoreszenzsignal in Oberschenkel Mikrovaskulatur. Die Gefäße wurden dichotom, kleinere (<15 um) oder erheblich klassifiziert (> 15 um) gemäß ihres Kalibers. Oberschenkel Mikrovaskulatur von FITC-Dextran (100 ul; 10 mg / ml). Injizierten Mäusen wurde vor und während der IV Verabreichung von entweder Doxorubicin oder Kochsalzlösung abgebildet wird (A) Die kleinen Gefäße, durch FCFM abgebildet begann gefäßverengende akut 2 min nach Doxorubicin Verwaltung (f , Pfeil), welches eine kontinuierliche Verengung des Fluoreszenzsignals bis zu ihrer vollständigen Verschwinden, ohne Rückgewinnung-Wiederfindung des Signals während der next acht Minuten die Echtzeit-Bildgebung (g, Pfeil). (B) Aussehen in einigen Schnappschüssen eines "verschwommenen" Fläche um die Blutgefäße Wände des Chemotherapie-injizierten Mäusen (g Pfeil) unmittelbar nach der Injektion, zeigt potentielle Dextran-FITC Leckage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Video 1. Oberschenkelmikrogefäßbildgebung. Ein Vertreter fotografierte Film FITC-Dextran fluoreszierende kleinere (<15 & mgr; m im Durchmesser) der Blutgefäße. Eierstock- und Oberschenkel Mikrovaskulatur Zeitraffer photography: Mäuse, die mit 100 & mgr; l FITC-Dextran (10 mg / ml) injiziert wurden abgebildet und von dem Zeitpunkt der IV-Verabreichung von Doxorubicin fotografiert. 2-5 Minuten nach der Injektion Doxorubicin zeigte kleinere Gefäße dramatischen Vasokonstriktion gefolgt von einer vollständigen Abschaffung des Fluoreszenzsignals, bereits 8 Minuten nach treatment. (AVI) Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.
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Discussion
Auswerten Chemotherapie-induzierter vaskulärer Toxizität stellt aufgrund der Schwierigkeit bei der Visualisierung der Dynamik der Vaskulatur in Antwort auf Stimuli in Echtzeit. Zahlreiche klinische Studien haben impliziert, dass mehrere Chemotherapien verursachen direkte Gefäßverletzung, aber der Mechanismus und Besonderheiten dieser Toxizität ist noch nicht geklärt. Wir haben eine Echtzeit für die Bewertung der potentiellen Gefäß Toxizität der Chemotherapie in Mäusen, umfassend von gefaserten konfokale Fluoreszenzmikroskopie, wie hierin 8-10 beschrieben, befindet sich in vivo molekularen Bildgebung Plattform. Diese hochauflösende molekulare Bildgebung von Mäusen eignet sich zur Visualisierung arteriellen Durchblutung und Schiffe Architektur. Es ermöglicht eine Echtzeitdetektion von Behandlung induzierten Komplikationen im gleichen Tier über einen längeren Zeitraum. Wir untersuchten zwei Klassen von Chemotherapien: Doxorubicin die bekanntlich toxisch für Zellen in vitro endotheliale zu sein als auch in Gewebes von Tieren mit Doxorubicin 10-15, und Paclitaxel als Kontrolle Chemotherapie, für die die früheren Hinweise auf eine vaskuläre Wirkung ist sehr begrenzt behandelt worden sind.
Die konfokalen Laserrastertechnologie von FCFM erleichtert Verfolgung fluoreszenzgefärbte tiefen Gewebe in Echtzeit und produziert Zeitraffer-Videobilder der Blutgefäße in vivo 9. In unserer Studie FCFM wurde verwendet, um die akute vaskuläre Wirkung von Doxorubicin als Prototyp vaskulotoxischen Mittels beobachten. Dieser Effekt, der kurz nach der Doxorubicin Verwaltung begann, war abhängig von Blutgefäßen Größe: je kleiner der Schiffe Durchmesser, desto prominenter der Schaden. Das Fluoreszenzsignal von kleinem Durchmesser (<15 um) Gefäße allmählich als Folge der konstanten Gefäße Einschnürung durch Doxorubicin verursacht vermindert. Keine scheinbare Erholung wurde während der nächsten 8 min von Echtzeit-Bildgebung erfasst. Großer Durchmesser (> 15 um) Gefäße waren weniger beschädigt; die Integritätihrer Mauer war beeinträchtigt, eine unregelmäßige Oberfläche aufweisen. Diese Effekte waren einzigartig für Doxorubicin und waren nicht erkennbar, wenn Paclitaxel verwendet wurde, was darauf hinweist, dass diese Methodik abgrenzt sorgfältig die spezifische Wirkung des Arzneimittels.
Änderungen und Fehlersuche
Während des gesamten Protokolls kann die Laserleistung während der Grundlinienaufzeichnung, um die Behälter zu veranschaulichen geändert werden. Jedoch muss die Laserleistung während des Versuchs geändert werden. Darüber hinaus kann eine hohe Laserleistung der Fluoreszenzmittel während der Zeit ausbleichen. Zusätzlich, wenn die Aufzeichnung beendet ist, ist es möglich, den Kontrast des Films zu ändern und seine Länge und Geschwindigkeit zu bearbeiten. Messungen der Behälter kann dann vorgenommen werden, und Änderungen, die auftreten können, eingehalten werden.
Grenzen der Technik und kritischen Schritte
Das Gerät verfügt über FCMF paar Einschränkungen. Die Region of Interest (ROI) kann während änderndie Aufnahmezeit. Darüber hinaus könnte der abgebildete Bereich austrocknen; sollte man den Bereich mit Feuchtigkeit versorgt. Das Fluoreszenzmittel könnten bleichen und das Signal verloren. Ein entscheidender Schritt sollte man beachten muss, ist, das Tier und die Sonde gut fest, um Änderungen des ROI zu vermeiden halten.
Bedeutung und zukünftige Anwendungen
Die etablierte Versuchsplattform kann als unmittelbare Untersuchung über das Ansprechen auf Chemotherapie oder alternativ als potentielle biologische Marker, um das Potential Gefäßtoxizitätsprofil charakterisieren dienen. Auf der Grundlage der untersuchten Mechanismus der Gefäßstörungen, kann das Verfahren auch in der Zukunft nützlich zur Bewertung der potenziellen Agenten angegeben, um vaskuläre Toxizität durch Chemotherapie zu reduzieren. Die Notwendigkeit, die möglichen langfristigen vaskulären Komplikationen in den Krebsüberlebenden zu verringern treibt uns, den Mechanismus hinter der Chemotherapie-induzierten vaskulären Toxizität zu erkunden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| general anesthesia | Fort Dodge Animal Health, IA, USA and Biove Laboratories, France | 100 mg/kg ketaset and 6 mg/kg XYL-M2 | |
| depilatory cream (Veet) | ReckittBenckiser, Bristol, UK | ||
| 30 G, 1/2 inch needle attached to 1 ml syringe | |||
| FITC dextran (10 mg/ml; MW 2,000 kDa) | Sigma | FD2000S | 100 μl volume |
| Doxorubicin | Teva, Israel | 8 mg/kg, Adriamycin | |
| paclitaxel | Taro, Israel | 1.2 mg/kg, Medexel | |
| saline |
References
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