Abstract
סוגים מסוימים של כימותרפיה עלולים להפעיל שינויים בכלי הדם חריפים שעלולות להתקדם לתנאים לטווח ארוך החושף את החולה לסיכון מוגבר לתחלואת לב וכלי דם. ובכל זאת, אם כי הראיות קליניות ההרכבה, יש מיעוט מחקרים ברורים של רעילות של כלי דם, ולכן אטיולוגיה של קבוצה הטרוגנית של הפרעות לב וכלי דם לב וכלי דם / עדיין לא הובהר. יתר על כן, המנגנון שעשוי בבסיס רעילות של כלי דם יכול לגמרי שונה מהעקרונות של רעילות לבבית בעקבות כימותרפיה, אשר קשורה לכוון פציעת myocyte. הקמנו בזמן אמת, בפלטפורמת הדמיה המולקולרית vivo כדי להעריך את הרעילות של כלי דם אקוטי הפוטנציאל של טיפולים אנטי-סרטניים.
הקמנו פלטפורמה של in vivo, הדמיה מולקולרית ברזולוציה גבוהה בעכברים, מתאים להדמית כלי דם בתוך איברים מוגבלים וblo ההתייחסותכלי od בתוך אותו האנשים ואילו כל אדם לשמש כשליטה שלו. דפנות כלי דם היו לקויים לאחר מתן דוקסורוביצין, המייצגות את מנגנון ייחודי של רעילות של כלי דם שעשוי להיות האירוע המוקדם לפגיעה באיברי המטרה. במסמך זה, בשיטה של ההדמיה confocal fibered מיקרוסקופ פלואורסצנטי (FCFM) המבוססת מתוארת, המספק מצב חדשני להבין תופעות פיסיולוגיות ברמה התאית ותת-תאית בנושאי בעלי חיים.
Introduction
עדויות קליניות מצביעות על כך שכמה כיתות של כימותרפיה לעורר מגוון רחב של פתולוגיות כלי דם המתבטאות בתופעת Raynaud, יתר לחץ דם, myocardialinfarction, התקפת כלי דם במוח, וVeno-occlusivedisease הכבד 1,2. "תרופות אנטי angiogenic 'בשוגג'" הוא מונח חדש יחסית, המתאר תרופות כימותרפיות קונבנציונליות הפועלות כמעכבי אנגיוגנזה אפשריים, למרות שהם לא פותחו במקור למטרה זו 3-5 אבל שנועדו לחסל את התאים סרטניים על ידי הטלת קטנה כמו "בטחונות נזק "לתאים נורמלים כמו 3 אפשריים. כמה טיפולי הכימותרפיה כבר משתמעים כvasculo-רעלים כפי שנצפו במחקרים קליניים באמצעות סמנים ביולוגיים בסרום. בין אלה אלקילציה סוכנים (כגון cyclophosphamide), תרכובות פלטינה (כגון ציספלטין) וanthracyclines 1,2,5-7.
סיבוכי לב וכלי דם חריפים עלולים להתרחש כresult של רעילות של כלי דם הנגרמת על ידי כימותרפיה. הם עלולים להתקדם למצבים כרוניים כמו טרשת עורקים וחשבון לעלייה בסיכון לתחלואת לב וכלי דם מאוחר. ובכל זאת, למרות ההרכבה ראיות קליניות, יש מיעוט מחקרים המיועדים תוך שימת דגש על המנגנון של רעילות של כלי דם, ולכן, דורש הבהרה נוספת של הפתוגנזה המדויקת שהם גורמים היא מוצדקת.
אתגר גדול בחושפים את המנגנון של רעילות של כלי דם בעקבות כימותרפיה נובע ממורכבות חקירת תפקוד כלי דם in vivo. אנו מתארים זאת פלטפורמה של רזולוציה גבוהה בהדמיה מולקולרית vivo בעכברים המאפשרת ללכוד את זרימת דם ואת המאפיינים של כלי. פלטפורמה זו מאפשרת זיהוי של תופעות של כלי דם הנוצר על-טיפול ישירים: בזמן אמת, כמו גם הקפדה עליהן על פני תקופה של זמן בתוך אותו האנשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: כל הניסויים אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים. טיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות מוסדיות. עכברי ICR נקבה (7-8 שבועות; 25 - 30 גר ') שוכנו בממוזג, מתקני בעלי חיים אור מבוקר של הפקולטה לרפואה ע"ש סאקלר באוניברסיטת תל-אביב. בטווח, חיות היו מורדמים עם מנת יתר של חומרי הרדמה.
1. Fibred Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי כיול (FCFM)
- להפעיל את המכשיר.
- חבר את microprobe (mini0 / 30).
- לכייל את המכשיר בהתאם להוראות יצרן.
2. עכברים הכנת הדמיה
- להרדים על ידי הזרקה תת עורית של שני Ketaset (100 מ"ג / קילוגרם) וXYL-M2 (6 מ"ג / קילוגרם). לאשר הרדמה תקינה על ידי חוסר תגובה לבוהן קמצוץ.
- לחתוך את העור מתחת למפשעה כדי לחשוף את כלי דם הירך. שמור את אתר החתך לח עם מי מלח הבא חתך.
- מחממים את הזנב על ידי שימוש בשקית (או כפפה) מלאים במים חמים (לא חם מדי לגעת) למשך כ -30 שניות. הכן (IV) מחלף תוך ורידי לממשל של dextran FITC (חומר ניגוד) ושל שני מלוחים או סוכן כימותרפיות, על ידי החדרת מחט (30 G, 1/2 אינץ ') לוריד הזנב והצמדת מזרק 1 מ"ל לזה . להבטיח את הווריד פתוח על ידי הזרקת תמיסת מלח.
הערה: ממשל IV של dextran FITC (משקל מולקולרי גבוה; 100 μl; 10 מ"ג / מיליליטר; 2,000 KDA) מקל לדמיין את נימי דם הירך על ידי FCFM. דוקסורוביצין (100 μl; 8 מ"ג / קילוגרם, אדריאמיצין) או מלוח גם להינתן IV לוריד הזנב המחומם מראש מאוחר יותר. - מקם את עכבר supinely על במה קלקר. לאבטח את העכבר למשטח ולשמור על מעמדה באמצעות סרט דביק כירורגי.
הערה: מיקרוסקופ confocal fibered שימש במחקר זה מורכב משתי יחידות: (1) microprobe (mini0 / 30). (; אורך גל nm 488 LSU-488) יחידת סריקת לייזר (2).
- לבצע את כל זמן הקפות ניתוחים באמצעות הלייזר באורך גל nm 488 LSU.
הערה: גלאי היחידה הראשיים מזהה מסוננת - הקרינה (500 650 ננומטר) הנפלטת. התמונות שנרכשו משוחזרות לאחר מכן ומוצגות בשיעור של 12 מסגרות / sec. - נתק בקפידה את המזרק מהמחט ולצרף מזרק חדש המכיל dextran FITC. לנהל של dextran FITC (IV) 100 μl.
- Shift microprobe (mini0 / 30) לשדה מתאים של תצוגה ולקבע אותו, לאחר ההתאמה לZ- הציר, על מנת לקבל את התמונה המקבילה. מחכה לסימן הראשוני לדעוך עד איתות ברורה וממוקדת הוא Visible.
- להקליט את זרימת דם בנקודת ההתחלה לתקופה קצרה ייצוב (~ 30 שניות). לאחר מכן חבר למחט מזרק נוסף, המכיל גם דוקסורוביצין או מלוח. IV לנהל דוקסורוביצין μl 100 או מלוח.
- לפקח על זרימת FITC-dextran מוזרק ברציפות במשך 20 דקות. על התוכנה הקשורים FCFM, להשתמש בלחצן הקוטר על הסרגל העליון כדי למדוד את כלי הדם ולקטלג אותם כקטן (<15 מיקרומטר) או גדול (> 15 מיקרומטר).
- להרדים את החיה עם מנת יתר של חומרי הרדמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהדמיה רציפה vivo בזמן אמת
מנגנון ההדמיה משמש כאן הוא בחדות גבוהה, מיקרוסקופ confocal fibered, מצוידת בבדיקה המאפשרת הדמיה של כלי דם ותגובתה לגירויים שונים כמו כימותרפיה. שיטה זו היא פולשנית מאז למרות שהיא עשויה להקל על הדמיה של כלי איבר או עמוקים, זה דורש חתך קטן לבדיקה. חבילות הבדיקה מורכבות מעשרות אלפי סיבים, אופטיקה מיקרוסקופ ומחבר דיוק קניינית. ייצוג סכמטי מוצג באיור 1.
הדמיה של נימי דם הירך
יש לנו מסווג הרשת של כלי דם דם הירך על פי קוטר כלי (קטן <15 מיקרומטר; גדול> 15 מיקרומטר) על ידי FCFM בעכברים שהוזרקו עם FITC-dextran. התכווצות כלי דם מהירה (2-5 דקות) של כלי דם קטנים היה מושרה על ידי דוקסורוביצין. Disappearan מלאce של ניאון FITC-dextran, טיפול 8 דקות לאחר דוקסורוביצין (למשל איור 2 א, חיצים; 1 וידאו). בכמה עכברים, ירידה של אות הניאון בכלי הדם ולהגביר את האות של סביבתו נצפתה באזור perivascular, כמה שניות לאחר מתן דוקסורוביצין (ז איור 2, חיצים). תוצאות אלו מצביעות כי עלייה בחדירות כלי ודליפה של dextran המשקל המולקולרי הגבוה מכלי הדם לרקמות הסובבות. אין אות הקרינה הייתה ברורה הבאה ממשל של דוקסורוביצין בעכברים שלא הזריקו בעבר עם FITC-dextran. עכברים שטופל בפקליטקסל הפגינו מבנה כלי דם דומה וקצב זרימה לאלו שנצפו בעכברים מוזרקים מלוחים (לא מוצג), לאורך כל תקופת המדידה.
איור 1. FCFM מיקרוסקופ confocal משמש כאן מורכב משתי יחידות: microprobe (mini0 / 30) ויחידת סריקת לייזר (LSU-488; 488 ננומטר אורך גל)..
2. תמונות איור של אות הקרינה FITC-dextran בנימי דם הירך. כלי שייט סווגו dichotomously לקטין (<15 מיקרומטר) או גדול (> 15 מיקרומטר) על פי הרמה שלהם. microvasculature הירך של dextran FITC (100 μl; 10 מ"ג / מיליליטר). הזריקו עכברים היו צילמו לפני ובמהלך ממשל IV של שני דוקסורוביצין או מלוח () כלי הקטין, צילמו על ידי FCFM, התחילו vasoconstricting חריפות 2 דקות לאחר מתן דוקסורוביצין (ו , חץ), מראה צמצום מתמשך של אות הניאון עד היעלמותה המוחלטת, ללא התאוששות ניכרה התאוששות של האות בnשלוחה שמונה דקות של ההדמיה בזמן אמת (ז, חץ). (ב) מראה, בכמה תצלומים, של אזור "מעורפל" סביב חומות כלי דם של עכברים מוזרקי כימותרפיה (חץ ז) מייד לאחר הזרקה, מצביע על פוטנציאל דליפת dextran-FITC. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
וידאו 1. ההדמיה microvasculature עצם הירך. נציג צילם סרט של קטין ניאון FITC-dextran (<15 מיקרומטר קוטר) כלי דם. זמן microvasculature השחלות וירך הקפות צילום: עכברים שהוזרקו עם 100 μl (10 מ"ג / מיליליטר) FITC-dextran הם צילמו וצילמו מרגע ממשל IV של דוקסורוביצין. 2-5 דקות לאחר הזרקת דוקסורוביצין, כלי קטין הראו התכווצות כלי דם דרמטית אחרי ביטולה המוחלט של אות הניאון, כבר 8 דקות לאחר treatment. (AVI) אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הערכת רעילות של כלי דם בעקבות כימותרפיה היא מאתגרת בשל הקושי בלדמיין את הדינמיקה של כלי דם בתגובה לגירויים בזמן אמת. מחקרים קליניים רבים שמעורבים שכמה טיפולי הכימותרפיה לגרום לפגיעה בכלי הדם ישירה, עדיין המנגנון והמאפיינים של רעילות זה עדיין לא הובהרו. הקמנו בזמן אמת, בפלטפורמת הדמיה המולקולרית vivo להערכת הרעילות של כלי דם הפוטנציאל של כימותרפיה בעכברים הכוללים מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal fibered כפי שתואר כאן 8-10. הדמיה מולקולרית זה ברזולוציה גבוהה של עכברים מתאימה להדמית זרימת דם העורקי ואדריכלות 'כלים. זה מאפשר זיהוי של סיבוכים הנגרם על טיפול בבעלי החיים זהים בזמן אמת על פני תקופה ארוכה של זמן. הערכנו שני סוגים של טיפולי הכימותרפיה: דוקסורוביצין אשר ידוע להיות רעיל לתאי אנדותל במבחנה, כמו גם ברקמותs התקבל מבעלי החיים שטופלו בדוקסורוביצין 10-15, ופקליטקסל ככימותרפיה שליטה שחומר הראיות לשעבר לכל השפעה של כלי דם היא מאוד מוגבלות.
טכנולוגית confocal סריקת הלייזר של FCFM מקלה התחקות רקמות עמוקות צבוע הקרינה בזמן אמת ומייצרת וידאו הזמן לשגות תמונות של כלי דם בגוף חי 9. במחקר שלנו FCFM שימש מנת לבחון את ההשפעה האקוטית של כלי דם של דוקסורוביצין, כסוכן vasculotoxic אב הטיפוס. השפעה זו, שהחלה זמן קצר לאחר מתן דוקסורוביצין, הייתה תלויה בגודל כלי דם: קטנה יותר בקוטר כלי הדם, בולט יותר הנזק. אות הקרינה של בקוטר קטן (<15 מיקרומטר) כלי פחתו בהדרגה כתוצאה מהתכווצות כלי קבועה הנגרמת על ידי דוקסורוביצין. אין התאוששות לכאורה אותרה במהלך 8 דקות הבאות של הדמיה בזמן אמת. בקוטר גדול (> 15 מיקרומטר) כלי ניזוקו פחות; השלמותהקיר שלהם נפגע, מציג משטח לא סדיר. השפעות אלו היו ייחודיות לדוקסורוביצין ולא היו ברורים מתי paclitaxel נוצל, מצביעים על כך שמתודולוגיה זו משרטטת בקפידה את ההשפעה הספציפית של התרופה.
שינויים ופתרון בעיות
לאורך כל הפרוטוקול, כוח הלייזר ניתן לשנות במהלך ההקלטה הבסיסית על מנת להמחיש את כלי הדם. עם זאת, כוח הלייזר אין לשנות במהלך הניסוי. בנוסף, כוח לייזר גבוה עלול להלבין את סוכן הקרינה במהלך הזמן. בנוסף, ברגע שהוא סיים הקלטה, ניתן לשנות את הניגודיות של הסרט ולערוך אורך והמהירות שלו. מדידות של כלי עשויים אז להיות שנעשו ושינויים המתרחשים עשויים להיות אחריו.
מגבלות של הטכניקה ושלבים קריטיים
למכשיר יש FCMF כמה מגבלות. האזור של העניין (ROI) עשוי להשתנות במהלךזמן ההדמיה. בנוסף, אזור הדמיה עלול להתייבש; אחד צריך לשמור על אזור התייבשות. סוכן הקרינה עלול להלבין והאות תאבד. שלב קריטי אחד אחד צריך לשים לב להוא לשמור על בעלי החיים וגם הבדיקה קבועה כדי למנוע שינויים של ההחזר על ההשקעה.
יישומי משמעות ועתיד
הפלטפורמה הניסיונית שהוקמה עשויה לשמש כבדיקה מיידית לתגובה לטיפול כימותרפי או לחלופין כסמן ביולוגי פוטנציאלי לאפיין את פרופיל הרעילות של כלי דם הפוטנציאלי. בהתבסס על המנגנון למד מירידת הערך של כלי דם, השיטה יכולה להיות שימושית גם בעתיד להערכת סוכנים פוטנציאליים שצוינה להפחית רעילות של כלי דם הנגרמת על ידי כימותרפיה. הצורך להקטין את הסיבוכים בכלי הדם לטווח ארוך פוטנציאל בניצולי הסרטן מניע אותנו לחקור את המנגנון עומד מאחורי רעילות של כלי דם בעקבות כימותרפיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| general anesthesia | Fort Dodge Animal Health, IA, USA and Biove Laboratories, France | 100 mg/kg ketaset and 6 mg/kg XYL-M2 | |
| depilatory cream (Veet) | ReckittBenckiser, Bristol, UK | ||
| 30 G, 1/2 inch needle attached to 1 ml syringe | |||
| FITC dextran (10 mg/ml; MW 2,000 kDa) | Sigma | FD2000S | 100 μl volume |
| Doxorubicin | Teva, Israel | 8 mg/kg, Adriamycin | |
| paclitaxel | Taro, Israel | 1.2 mg/kg, Medexel | |
| saline |
References
- Chow, A. Y., et al. Anthracyclines cause endothelial injury in pediatric cancer patients: a pilot study. J Clin Oncol. 24 (6), 925-928 (2006).
- Nuver, J., et al. Acute chemotherapy-induced cardiovascular changes in patients with testicular cancer. J Clin Oncol. 23 (36), 9130-9137 (2005).
- Vos, F. Y., et al. Endothelial cell effects of cytotoxics: balance between desired and unwanted effects. Cancer Treat Rev. 30 (6), 495-513 (2004).
- Kerbel, R. S., et al. 'Accidental' anti-angiogenic drugs. anti-oncogene directed signal transduction inhibitors and conventional chemotherapeutic agents as examples.Eur. J Cancer. 36 (10), 1248-1257 (2000).
- Soultati, A., et al. Endothelial vascular toxicity from chemotherapeutic agents: preclinical evidence and clinical implications. Cancer Treat Rev. 38 (5), 473-483 (2012).
- Tempelhoff, G. F., et al. Blood coagulation during adjuvant epirubicin/cyclophosphamide chemotherapy in patients with primary operable breast cancer. J Clin Oncol. 14 (9), 2560-2568 (1996).
- Ben Aharon, I., et al. Doxorubicin-induced vascular toxicity--targeting potential pathways may reduce procoagulant activity. PLoS One. 8 (9), e7515 (2013).
- Laemmel, E., et al. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Al-Gubory, K. H., Houdebine, L. M. In vivo imaging of green fluorescent protein-expressing cells in transgenic animals using fibred confocal fluorescence microscopy. Eur J Cell Biol. 85 (8), 837-845 (2006).
- Bar-Joseph, H., et al. In vivo bioimaging as a novel strategy to detect doxorubicin-induced damage to gonadal blood vessels. PLoS One. 6 (9), e23492 (2011).
- Kaushal, V., Kaushal, G. P., Mehta, P. Differential toxicity of anthracyclines on cultured endothelial cells. Endothelium. 11 (5-6), 253-258 (2004).
- Kim, E. J., et al. Doxorubicin-induced platelet cytotoxicity: a new contributory factor for doxorubicin-mediated thrombocytopenia. J Thromb Haemost. 7 (7), 1172-1183 (2009).
- Walsh, J., Wheeler, H. R., Geczy, C. L. Modulation of tissue factor on human monocytes by cisplatin and adriamycin. Br J Haematol. 81 (4), 480-488 (1992).
- Kotamraju, S., et al. Doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and cardiomyocytes is ameliorated by nitrone spin traps and ebselen. Role of reactive oxygen and nitrogen species. J Biol Chem. 275 (43), 33585-33592 (2000).
- Vasquez-Vivar, J., et al. Endothelial nitric oxide synthase-dependent superoxide generation from adriamycin. Biochemistry. 36 (38), 11293-11297 (1997).
