Abstract
Vissa klasser av kemoterapi kan utöva akuta kärlförändringar som kan utvecklas till långvariga förhållanden som kan predisponerar för en ökad risk för vaskulär sjuklighet. Ändå, om än monterings kliniska bevis, det finns en brist på tydliga studier av vaskulär toxicitet och därmed etiologin av en heterogen grupp av vaskulära / kardiovaskulära sjukdomar återstår att klargöra. Dessutom kan den mekanism som kan ligga bakom kärl giftighet skiljer sig från principerna om kemoterapi-inducerad kardiotoxicitet, som är relaterad till direkt myocyt skada. Vi har etablerat en realtids, in vivo molecular imaging plattform för att utvärdera den potentiella akuta vaskulära toxicitet av anti-cancerterapier.
Vi har satt upp en plattform av in vivo, högupplösta molekylär avbildning i möss, som lämpar sig för att visualisera kärl inom trånga organ och referens blood fartyg inom samma individer medan varje enskild tjänar som sin egen kontroll. Blodkärlens väggar var nedsatt efter doxorubicin administration, som representerar en unik mekanism för vaskulär toxicitet som kan vara den tidiga händelsen i slutorganskada. Häri är metoden för fibered konfokal fluorescensmikroskopi (FCFM) baserad avbildning beskrivs, vilket ger en innovativ läget att förstå fysiologiska fenomen på de cellulära och sub-cellulära nivåer i djurförsök.
Introduction
Kliniska bevis tyder på att flera klasser av kemoterapi framkalla en mängd olika vaskulära sjukdomar manifest av Raynauds fenomen, hypertoni, myocardialinfarction, cerebrovaskulär attack, och lever veno-occlusivedisease 1,2. "'Oavsiktliga' anti-angiogena droger" är ett ganska nytt begrepp, som beskriver konventionella kemoterapeutiska medel som fungerar som möjliga angiogeneshämmare, även om de inte ursprungligen utvecklades för detta ändamål 3-5 men utformad för att eliminera tumörceller genom att införa så lite "säkerhet skador "för att normala celler som möjligt 3. Flera kemoterapi har förstådda som vasculo-gifter som observerats i kliniska studier med serum biomarkörer. Bland dessa är alkylerande medel (t.ex. cyklofosfamid), platinaföreningar (t.ex. cisplatin) och antracykliner 1,2,5-7.
Akuta kardiovaskulära komplikationer kan uppstå som en Result av vaskulär toxicitet inducerad av kemoterapi. De kan utvecklas till kroniska sjukdomar som åderförkalkning och står för en ökad risk för sena vaskulär sjuklighet. Ändå, trots ökade kliniska bevis, det finns en brist på utsedda studier betonar mekanismen av vaskulär toxicitet och därför ytterligare klarlägga den exakta patogenesen de tillfogar motiverad.
En stor utmaning i att avslöja mekanismen för kemoterapi-inducerad vaskulär toxicitet härrör från komplexiteten i att undersöka kärlfunktionen in vivo. Vi beskriver häri en plattform av hög upplösning in vivo molecular imaging i möss som gör det möjligt att fånga blodflödet och fartygens egenskaper. Denna plattform underlättar upptäckt av direkta behandlingsutlöst vaskulära effekter: i realtid, samt att följa dem under en tidsperiod inom samma individer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Alla experiment har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén. Djuromsorg var enligt institutionens riktlinjer. ICR honmöss (7-8 veckor gammal, 25-30 g) inhystes i luftkonditionerade, ljusa kontrollerad djuranläggningar i Sackler Medicinska fakulteten i Tel-Aviv University. Vid sikt avlivades djuren med anestesi överdos.
1. fibrösa Konfokal fluorescensmikroskopi (FCFM) Kalibrering
- Slå på enheten.
- Anslut mikrosond (mini0 / 30).
- Kalibrera enheten enligt tillverkarens instruktioner.
2. Möss Förberedelse för Imaging
- Bedöva genom en subkutan injektion av både Ketaset (100 mg / kg) och XYL-M2 (6 mg / kg). Bekräfta korrekt anesthetization med okänslighet till tå-nypa.
- Incise huden nedanför ljumske för att avslöja de femorala arteriella kärl. Håll snittet webbplatsen fuktigt med saltlösning efter snittet.
- Värm svansen genom att använda en påse (eller en handske) fylld med varmt vatten (inte för varmt att röra) för ca 30 sek. Förbered en intravenös (IV) shunt för administrering av FITC-dextran (ett kontrastmedel) och av antingen saltlösning eller kemoterapeutiskt medel, genom att föra in en nål (30 G, 2/1 tum) i svansvenen och fästa en 1 ml spruta till det . Se till venen är öppen genom att injicera koksaltlösning.
ANMÄRKNING: En IV-administrering av FITC-dextran (hög molekylvikt; 100 ul; 10 mg / ml; 2000 kDa) underlättar visualisering lårbens mikrovaskulaturen genom FCFM. Doxorubicin (100 ul; 8 mg / kg, Adriamycin) eller saltlösning kommer också att senare administreras IV in i den förvärmda svansvenen. - Placera musen supinely på en polystyren scen. Säkra musen till dynan och bibehålla positionen med hjälp kirurgisk tejp.
OBS: fibered konfokalmikroskop användes i denna studie består av två enheter: (1) mikrosond (mini0 / 30). (2) Laserskanning enheten (LSU-488, 488 nm våglängd).
- Utför alla tids varv analyser använder LSU 488 nm våglängd laser.
OBS: Huvudenheten detekterar den filtrerade (500-650 nm) emitteras fluorescens. De förvärvade bilderna rekonstrueras efteråt och visas med en hastighet av 12 bilder / sek. - Koppla försiktigt sprutan från nålen och bifoga en ny spruta innehållande FITC dextran. Administrera (IV) 100 pl FITC dextran.
- Förskjut den mikrosond (mini0 / 30) till en lämplig synfält och fixera det, efter justering av z-axeln, för att erhålla den motsvarande bilden. Vänta på första signalen att blekna tills en klar och fokuserad signal är visible.
- Spela en baslinje blodflöde under en kort stabiliseringsperiod (~ 30 sek). Sedan ansluta till nålen annan spruta, innehållande antingen doxorubicin eller saltlösning. IV administrera 100 pl doxorubicin eller saltlösning.
- Övervaka flödet av injicerad FITC-dextran kontinuerligt under 20 min. På FCFM-tillhörande mjukvara, använd knappen diametern på den övre linjalen för att mäta blodkärlen och kategorisera dem så små (<15 nm) eller stor (> 15 um).
- Euthanize djuret med anestesi överdos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo kontinuerlig avbildning vid realtids
Bildalstringsapparaten används här är en högupplöst, fibered konfokalmikroskop, försett med en sond som möjliggör visualisering av kärl och dess svar på olika stimuli som kemoterapi. Denna metod är minimalt invasiv eftersom även om det kan underlätta avbildning av djupa kärl eller organ, det kräver ett litet snitt för sonden. Sond buntar består av tiotusentals fibrer, mikroskopoptik och en patentskyddad precisionskontakt. En schematisk representation visas i figur 1.
Imaging av lårbensmikrocirkulation
Vi har klassificerat det nätverk av lårbens blodvaskulaturen enligt fartyg diameter (liten <15 um; stor> 15 pm) genom FCFM hos möss som injicerats med FITC-dextran. En snabb vasokonstriktion (2 - 5 min) av små fartyg var en följd av doxorubicin. En komplett disappearance av FITC-dextran fluorescerande, 8 min efter doxorubicin behandling (Figur 2A t.ex. pilar; Video 1). I flera möss, reduktion av den fluorescerande signalen i blodkärlet och öka signalen av dess omgivning observerades i den perivaskulära regionen, några sekunder efter doxorubicin administrering (Figur 2B g, pilar). Dessa resultat tyder på att ökning av kärlet permeabilitet och läckage av den högmolekylära dextran från blodkärlet till de omgivande vävnaderna. Ingen fluorescens signalen var tydlig efter administrering av doxorubicin i möss som inte injicerades tidigare med FITC-dextran. Paklitaxelbehandlade möss visade liknande blodkärlen struktur och flödeshastighet som observerats i saltlösning-injicerade möss (ej visat), under hela mätperioden.
Figur 1. FCFM Den konfokalmikroskop används här består av två enheter: den mikrosond (mini0 / 30) och laserskanning enheten (LSU-488, 488 nm våglängd)..
Figur 2. Bilder av FITC-dextran fluorescenssignalen i lårbens mikrovaskulatur. Fartyg var dikotomt klassificerade till mindre (<15 pm) eller större (> 15 um) enligt deras kaliber. Lårbens mikrovaskulatur av FITC-dextran (100 | il; 10 mg / ml). Injicerade möss avbildades före och under intravenös administrering av antingen doxorubicin eller saltlösning (A) De mindre fartyg, avbildade av FCFM, började vasokonstriktiva akut 2 min efter doxorubicin administrering (f , pil), som visar en kontinuerlig minskning av den fluorescerande signalen tills dess fullständiga försvinnande, med ingen återhämtning uppenbar återhämtning av signalen under next åtta minuter av den realtids imaging (g, pil). (B) Utseende i vissa ögonblicksbilder av en "dimmig" området runt blodkärlen väggar kemoterapi-injicerade möss (g pil) omedelbart efter injektion, indikerar potential dextran-FITC läckage. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1. Lårbens mikrovaskulaturen avbildning. En representant fotograferade film av FITC-dextran fluorescerande moll (<15 mikrometer i diameter) blodkärl. Äggstocks och lårbens mikrovaskulaturen tid varv Fotografi: möss injicerade med 100 | il FITC-dextran (10 mg / ml) avbildades och fotograferades från tidpunkten för IV-administrering av doxorubicin. 2-5 min efter doxorubicin injektion, mindre fartyg visade dramatiska vasokonstriktion följt av undanröjdes den fluorescerande signalen, redan 8 min efter treatment. (AVI) Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvärdera kemoterapiinducerad vaskulär toxicitet är en utmaning på grund av svårigheten att visualisera dynamiken i vaskulaturen som svar på en stimuli i realtid. Många kliniska studier har inblandade att flera kemoterapi orsakar direkta kärlskada, men mekanismen och egenskaper av denna toxicitet ännu inte är utredd. Vi har etablerat en realtids, in vivo molekylär imaging plattform för att utvärdera möjligheten vaskulär toxicitet kemoterapi hos möss som består av fibered konfokal fluorescensmikroskopi som beskrivs häri 8-10. Denna högupplösta molekylär avbildning av möss är lämplig för att visualisera arteriellt blodflöde och fartygens arkitektur. Den möjliggör realtidsdetektion av behandlings-inducerade komplikationer i samma djur under en utsträckt tidsperiod. Vi utvärderade två klasser av kemoterapi: doxorubicin som är känd för att vara giftigt för endotelceller in vitro och i vävnads som kommer från djur som behandlats med doxorubicin 10-15, och paklitaxel som en kontroll kemoterapi för vilka den tidigare belägg för någon vaskulär effekt är mycket begränsad.
Den laserskanning konfokala teknik FCFM underlättar spårning fluorescens-färgade djupa vävnader vid realtid och producerar tidsförlopp videobilder av blodkärl in vivo 9. I vår studie FCFM användes för att observera den akuta vaskulära effekten av doxorubicin, som en prototyp vasculotoxic medel. Denna effekt, som började strax efter doxorubicin administration, var beroende av blodkärl Storlek: ju mindre fartygens diameter, desto mer framträdande skadan. Fluorescenssignalen av liten diameter (<15 nm) fartyg minskat gradvis till följd av konstant fartyg förträngning orsakad av doxorubicin. Ingen uppenbar återhämtning upptäcktes under nästa 8 min av realtids avbildning. Stor diameter (> 15 um) fartyg var mindre skadade; integritetenav sin mur var nedsatt, uppvisar en oregelbunden yta. Dessa effekter var unika för doxorubicin och inte var uppenbart när paklitaxel utnyttjades, vilket indikerar att denna metod delineates minutiöst den specifika effekten av läkemedlet.
Ändringar och felsökning
Under hela protokollet, kan lasereffekten ändras under baslinjen inspelning för att illustrera fartygen. Dock får lasereffekt inte ändras under experimentet. Dessutom kan en hög lasereffekt bleka fluorescens medlet under tiden. Dessutom, när inspelningen är klar, är det möjligt att ändra kontrasten på filmen och redigera dess längd och hastighet. Mätningar av fartygen kan sedan göras och förändringar som sker kan följas.
Begränsningar av tekniken och kritiska steg
Den FCMF enheten har få begränsningar. Regionen av intresse (ROI) kan ändras underavbildningstiden. Dessutom kan det avbildade området torka ut; man bör hålla området hydrerad. Den fluorescens ämnet bleka och signalen kommer att gå förlorade. Ett kritiskt steg man bör uppmärksamma är att hålla djuret och sonden väl fast för att undvika förändringar av ROI.
Betydelse och framtida tillämpningar
Den etablerade experimentell plattform kan tjäna som en omedelbar undersökning av responsen för kemoterapi eller alternativt som en potentiell biologisk markör för att karaktärisera den potentiella toxiciteten profilen vaskulär. Baserat på den studerade mekanismen av vaskulär njurfunktion kan metoden också vara användbart i framtiden för utvärdering potentiella agenter specificerade för att minska kärl toxicitet inducerad av kemoterapi. Behovet av att minska de potentiella långsiktiga vaskulära komplikationer i cancer överlevande driver oss att utforska mekanismen bakom kemoterapi-inducerad vaskulär toxicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| general anesthesia | Fort Dodge Animal Health, IA, USA and Biove Laboratories, France | 100 mg/kg ketaset and 6 mg/kg XYL-M2 | |
| depilatory cream (Veet) | ReckittBenckiser, Bristol, UK | ||
| 30 G, 1/2 inch needle attached to 1 ml syringe | |||
| FITC dextran (10 mg/ml; MW 2,000 kDa) | Sigma | FD2000S | 100 μl volume |
| Doxorubicin | Teva, Israel | 8 mg/kg, Adriamycin | |
| paclitaxel | Taro, Israel | 1.2 mg/kg, Medexel | |
| saline |
References
- Chow, A. Y., et al. Anthracyclines cause endothelial injury in pediatric cancer patients: a pilot study. J Clin Oncol. 24 (6), 925-928 (2006).
- Nuver, J., et al. Acute chemotherapy-induced cardiovascular changes in patients with testicular cancer. J Clin Oncol. 23 (36), 9130-9137 (2005).
- Vos, F. Y., et al. Endothelial cell effects of cytotoxics: balance between desired and unwanted effects. Cancer Treat Rev. 30 (6), 495-513 (2004).
- Kerbel, R. S., et al. 'Accidental' anti-angiogenic drugs. anti-oncogene directed signal transduction inhibitors and conventional chemotherapeutic agents as examples.Eur. J Cancer. 36 (10), 1248-1257 (2000).
- Soultati, A., et al. Endothelial vascular toxicity from chemotherapeutic agents: preclinical evidence and clinical implications. Cancer Treat Rev. 38 (5), 473-483 (2012).
- Tempelhoff, G. F., et al. Blood coagulation during adjuvant epirubicin/cyclophosphamide chemotherapy in patients with primary operable breast cancer. J Clin Oncol. 14 (9), 2560-2568 (1996).
- Ben Aharon, I., et al. Doxorubicin-induced vascular toxicity--targeting potential pathways may reduce procoagulant activity. PLoS One. 8 (9), e7515 (2013).
- Laemmel, E., et al. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Al-Gubory, K. H., Houdebine, L. M. In vivo imaging of green fluorescent protein-expressing cells in transgenic animals using fibred confocal fluorescence microscopy. Eur J Cell Biol. 85 (8), 837-845 (2006).
- Bar-Joseph, H., et al. In vivo bioimaging as a novel strategy to detect doxorubicin-induced damage to gonadal blood vessels. PLoS One. 6 (9), e23492 (2011).
- Kaushal, V., Kaushal, G. P., Mehta, P. Differential toxicity of anthracyclines on cultured endothelial cells. Endothelium. 11 (5-6), 253-258 (2004).
- Kim, E. J., et al. Doxorubicin-induced platelet cytotoxicity: a new contributory factor for doxorubicin-mediated thrombocytopenia. J Thromb Haemost. 7 (7), 1172-1183 (2009).
- Walsh, J., Wheeler, H. R., Geczy, C. L. Modulation of tissue factor on human monocytes by cisplatin and adriamycin. Br J Haematol. 81 (4), 480-488 (1992).
- Kotamraju, S., et al. Doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and cardiomyocytes is ameliorated by nitrone spin traps and ebselen. Role of reactive oxygen and nitrogen species. J Biol Chem. 275 (43), 33585-33592 (2000).
- Vasquez-Vivar, J., et al. Endothelial nitric oxide synthase-dependent superoxide generation from adriamycin. Biochemistry. 36 (38), 11293-11297 (1997).
