Summary
SILAC immunpræcipitationseksperimenter repræsenterer et stærkt middel til at opdage nye protein: protein interaktioner. Ved at tillade nøjagtig relative kvantificering af protein overflod i både kontrol og prøver, sande interaktioner let kan skelnes fra eksperimentelle forureninger, og lav affinitetsvekselvirkning bevaret gennem brug af mindre strenge buffer forhold.
Abstract
Kvantitative proteomics kombineret med immuno-affinitet rensning, SILAC immunoprecipitation repræsenterer et stærkt middel til opdagelsen af nye protein: protein interaktioner. Ved at tillade nøjagtig relative kvantificering af protein overflod i både kontrol og prøver, kan sande interaktioner let skelnes fra eksperimentelle forureninger. Lav affinitet interaktioner kan bevares ved brug af mindre strenge buffer betingelser og forbliver let genkendelige. Denne protokol diskuterer mærkning af vævskulturceller med stabil isotop mærkede aminosyrer, transfektion og immunoudfældning af en affinitetsmærket protein af interesse, efterfulgt af forberedelse til forelæggelse for en massespektrometri facilitet. Denne protokol så diskuterer, hvordan man analysere og fortolke data, der returneres fra massespektrometer for at identificere cellulære partnere interagerer med et protein af interesse. Som et eksempel denne teknik anvendes til identificere proteiner binder til de eukaryote translationsinitieringsregioner faktorer: eIF4AI og eIF4AII.
Introduction
Et væsentligt skridt i forståelsen protein funktion er identifikation af relevante interagerende proteiner. Når sådanne proteiner er ukendt der er en række teknikker til rådighed, hver med deres egne fordele og ulemper. Heriblandt gær to-hybrid-system, pulldown assays under anvendelse af rekombinant protein samt tandem affinitetsoprensning eller TAP-tagging 1, 2.
En nyere Ud over disse teknikker er kombinationen af affinitetsoprensning af et protein af interesse fra en relevant mammal cellelinie, efterfulgt af kvantitativ massespektrometri med stabil isotop mærkning af aminosyrer i cellekultur (SILAC) 3. Dette har fordele i forhold til gær to-hybrid tilgang i den celle lokalisering og post-translationelle modifikationer ikke forstyrres, samt fordele frem for traditionelle TAP-tagging på, at det er en kvantitativ snarere end kvalitative tilgang gør det muligt for brugeren at reaDily skelne mellem ikke-specifikt interagerende proteiner og forurenende stoffer fra værten faktorer, der binder specifikt. Yderligere, da en prøve typisk analyseres hele, snarere end som individuelle protein bands, proteiner af interesse er ikke maskeret af tilsvarende migrerer proteiner på en gel, heller ikke de typisk nødt til at være til stede på et tilstrækkeligt højt niveau til at være synlige efter farvning, hvilket fører til øget antal trygt identificerede proteiner 4.
For at demonstrere denne teknik, GFP fusioner af den nært beslægtede eukaryote translationsinitiering faktor eIF4AI og eIF4AII denne andel over 90% aminosyreidentitet blev undersøgt ved SILAC-immunfældningsforsøg kvantitative proteomics. Humant eIF4AI og II, blev klonet ind i pEGFP-C1-til dannelse af et fusionsprotein, hvor GFP fusioneret til N-terminalen af eIF4A. For at undgå behovet for at generere stabile cellelinjer transient transfektion blev brugt til at levere disse konstruktioner til stabile isotop mærkede 293T celler.
(figur 1).
SILAC immunoprecipitation muliggør identifikation af ikke kun direkte interaktioner, men også lav affinitet eller indirekte interaktioner med protein-komplekser 4. Ved hjælp af dette system, eIF4AI og II immunopræcipitationer tilladt reproducerbare og sikker identifikation af den primære bindingspartner eIF4G (isoformer I / II og III) 5 samt indirekte vekselvirkninger med eIF4E og mange komponenter i eIF3 komplekset.
Protocol
1.. Generation og Passage af SILAC-mærket cellelinier
Bemærk: brugen af trypsin-EDTA skal undgås i alle faser af passage og forberedelse af eksperimentelle prøver til analyse som trypsin kan indeholde umærkede aminosyrer, som ville føre til ufuldstændig mærkning af prøver.
- For at fremstille en flaske SILAC medier tilsættes en portion på 0,5 ml af en passende SILAC-mærket arginin (84 mg / ml i PBS) og lysin (146 mg / ml i PBS) i en 500 ml flaske Arg / Lys DMEM (indeholdende L-glutamin).
- Dernæst tilsættes 50 ml dialyseret FBS og 5 ml penicillin / streptomycin til 500 ml flaske.
Bemærk: HEK 293T-celler (ATCC) bør opretholdes i DMEM medier manglede arginin og lysin og suppleret med lys (R0K0), medium (R6K4) eller tunge (R10K8) aminosyrer, dialyseret føtalt bovint serum (10 kDa afskæring) og penicillin / streptomycin. Cellerne skal holdes i medier i mindst 5 celledelinger for at sikre fuldstændigmærkning. I de fleste tilfælde celler let mærkes på ≥ 2 uger. - At opdele celler til passage bør celler fjernes fra monolaget ved at trykke på kolben. Alternativer omfatter anvendelse af celle skraberne eller ved hjælp af enzym-fri PBS-baserede celle-dissociation buffer.
Bemærk: For at spare medier bør celler passeres i T25-flasker og større celletal genereres kun umiddelbart før et eksperiment. - 24 timer før transfektion celler, frø 3,5 x 10 6 SILAC-mærkede celler til en enkelt 10 cm 2 skål for hver eksperimentel tilstand under efterforskning.
2.. Transfektion af mærkede celler med pEGFP-fusionskonstruktioner
- Fjern mediet fra cellerne, og erstatte det med 9 ml antibiotika-fri SILAC DMEM (Let, Medium eller Heavy) medier.
Bemærk: Antibiotika bør ikke tilsættes til medierne, da de kan forstyrre effektiviteten af liposombaserede transfektionsreagenser. - Forbere en blanding af 10 ug af det passende plasmid (epEGFP-C1, pEGFP-eIF4A-I, pEGFP-eIF4A-II) i 500 pi af antibiotika-fri SILAC DMEM og bland det med 500 pi af antibiotika-fri SILAC DMEM indeholdende 10 pi transfektionsreagens (fx lipofectamin 2000). Reaktionen blandes grundigt ved pipettering op og ned flere gange.
- Inkuberes reaktionsblandingen ved stuetemperatur i 20 minutter og derefter tilsættes dråbevis til cellemonolaget. Rock pladen forsigtigt fra side til side.
- Inkuberes de transficerede celler ved 37 ° C og 10% CO2 i 24 timer.
Bemærk: Hvis ekspression af et protein af interesse resulterer i nogen tilsyneladende toksicitet, så kan det være nødvendigt at reducere mængden af transficeres og / eller varigheden af den efterfølgende ekspression periode.
3. Høst Cellelysater
- Harvest celler fra fadet i iskoldt PBS ved hjælp af en celle skraber. Saml cellerne ved centrifugering ved 220 xg, 476; C i 5 min. Vask cellerne yderligere 3x i 10 ml iskold PBS.
- Resuspender cellepelleten i 200 pi cellelysis buffer (10 mM TrisCl / pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5% NP40) indeholder frisk tilsat protease inhibitor cocktail III på 1x koncentration og RNase cocktail (ekstraudstyr) på 5 mikroliter per ml.
Bemærk: proteiner med kendt nukleinsyrebindende aktivitet, kan det være nødvendigt at tilføje nukleaser til lysatet forud for udfældning. I tilfælde, hvor der tilsættes nuklease, bør prøverne inkuberet på is i 30 minutter på is med pipettering hver 10 min. Ekstraktion af total nukleinsyre fra en lille brøkdel af prøven og analyse ved agarosegelelektroforese kan teste effektiviteten af nuklease. - Centrifuger prøverne ved 13.000 xg, 4 ° C i 10 min bevarer supernatanten det opløselige cellelysat.
- Koncentrationen af cellelysatet bør vurderes af BCA-assay i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Brug lysis buffer indeholdende protease inhibitor cocktail III normalisere proteinkoncentrationen i et slutvolumen på 500 pi.
- Juster lydstyrken til 1 ml med tillæg af 500 pi fortyndingsbuffer (10 mM TrisCl / pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) indeholdende proteasehæmmer cocktail III ved den endelige 1x koncentration. En 50 pi alikvot af prøven bør bibeholdes som prøven input og lysatet holdt på is, mens forberede anti-GFP-perler (f.eks GFP-fælde).
Bemærk: Typisk udbytter varierer mellem 1-3,5 mg protein i det endelige 1 ml prøve. Mens de ovennævnte buffere er velegnet til mange proteiner af interesse, for andre kan det være nødvendigt at modificere pufferkomponenter at sikre agn proteinet solubiliseres og opretholde protein-protein interaktioner. Mulige ændringer omfatter buffermidlet (Phosphate, HEPES), saltkoncentration (150-500 mM), valget af detergent eller andre additiver.
4.. Binding til Anti-GFP Beads
- Kortvarigt vortex perlen gyllen for at resuspendere perlerne. Ved hjælp af en 200 gl pipettespids med enden afbrød overføres 25 pi perler pr prøve til et frisk rør.
Bemærk: Brugeren skal forberede perlerne for en enkelt SILAC eksperiment som en mastermiksens at minimere prøve-til-prøve variation. - For hver 25 ul perle gylle, tilsættes 20 volumener (1.500 pi per 75 ul gylle) af fortyndingsbuffer, og centrifuger perlerne ved 2.700 xg i 5 min. Dernæst vaskes perlerne en yderligere 2x i 20 rumfang fortyndingsbuffer.
- Tilsæt 100 pi fortyndingsbuffer per 25 ul perle gylle. Ved hjælp af en 200 gl spids med udgangen afbrød overføres 85 ul af denne resuspenderet opslæmning til hver af de SILAC-mærkede prøver fra trin 3.6.
- Inkuber prøverne med perler på en rotator ved 4 ° C i 2 timer.
5.. Vask, Eluering og klargøring af prøver til MS Analyse
- Centrifugér prøver på 2.700 xg, 46, C i 5 min. 50 ul af supernatanten bør bibeholdes som den ubundne prøve med resten af supernatanten blev kasseret.
- 1ml fortyndingsbuffer bør tilføjes til hvert rør for at resuspendere perlerne, og prøven blev centrifugeret ved 2.700 x g, 4 ° C i 5 min. Supernatanten skal kasseres. Dette skal udføres to gange.
- Eluere proteiner fra perlerne ved tilsætning af 50 pi 2x SDS loading buffer, og opvarmning ved 95 ° C i 10 min. Pelletere kuglerne ved centrifugering ved 2.700 x g i 2 minutter ved 4 ° C
- Fastholde supernatanten i smurt rør, hvor det kan derefter lagret ved -80 ° C indtil brug. Til forelæggelse for en massespektrometri facilitet, bland mærkede prøver 01:01:01 (fx 10 ul af hver) og indsende den blandede prøve.
Bemærk: På dette tidspunkt kan testes ved western blot, sølv-farvning eller andre midler til at teste for interaktion med kendte / ukendte bindende partnere. Et eksempel er givet i figURE 2, der viser specifik binding af en kendt vekselvirkning partner - eIF4G ved Western blot, og fremkomsten af sølvfarvning bånd til stede i pulldown prøver fra et protein af interesse, men ikke en kontrolprøve. - Indsend prøve til LC-MS/MS analyse.
Bemærk: en gang overbevist om, at en kodet protein af interesse med succes er bindende interaktion partnere, lige volumener af hver mærket prøve (lys, medium og tung) er kombineret og indsendt til LC-MS/MS analyse. Det er sædvanligt at indsende 30 pi alt en IP-prøve til analyse. Dette vil indebære at blande 10 ul af Light-mærket prøve med 10 pi medium-mærket og 10 pi tunge-mærkede prøver at give en total 30 ul.
6. Dataanalyse I:. Forstå resultaterne, og fjernelse af Low-tillidsindikatorer Identifikationer
Bemærk: En liste over kolonneoverskrifterne returneres af Proteome Discoverer software er givet i tabel 1. Dif.skellige software (f.eks MSQuant, MaxQuant) vil returnere forskellige overskrifter, men kun en delmængde af disse er nødvendige til analyse, og disse er fælles for de forskellige software pakker. Dataene bør altid omfatte en tiltrædelse nummer for hvert protein identificeret, forholdet er at sammenligne hver prøve ratio (lys vs medium, lys vs tung, medium vs tung osv), antallet af unikke peptider identificeres, og en form for falsk positive sats eller tillid indikation.
- Inden vi går gennem data, først kopiere de rå data til et nyt regneark. Fra dette regneark fjerne alle kolonner med undtagelse af dem, der giver tiltrædelsen, antal unikke peptider, nøgletal sammenligner prøver, forholdet variabilitet og proteinet beskrivelse. Hvis replika forsøg blev udført, bør disse kombineres i en enkelt Excel-fil, hvor hvert eksperiment er opført på en separat fane.
Bemærk: Lav selvtillid data omfatter proteiner identificeret ved kun en enkelt unik peptid, og de wher kvantificering var ikke muligt. - Brug excellerer 'slags' funktionen til at bestille data med antallet af peptider og fjerne oplysningerne for proteiner, der mangler mere end ét peptid. Så sortere efter forholdet og fjerne proteiner, der mangler SILAC nøgletal (kvantificerede proteiner).
- Konverter SILAC nøgletal til en log 2 værdier ved hjælp af formlen: '= log (SILAC Ratio, 2)', hvor 'SILAC Ratio "erstattes celleidentifikationen.
Bemærk: Som SILAC forholdet resulterer i data for proteiner, der viser et fald i overflod er begrænset til værdier mellem 0 og 1, er det normalt at konvertere en SILAC forhold til en log 2 SILAC forholdet, da dette betyder proteiner både steget eller faldet i en prøve er repræsenteret på en logaritmisk skala, hvor 2 eller -2 repræsenterer en 4-fold stigning eller fald i overflod, og 3 eller -3 en 9-fold stigning eller fald i overflod hhv. Efter denne transformation, bør dataene passe en Gaussian fordeling centreret omkring en log 2 SILAC på 0. Et eksempel på dette er givet i figur 3.. - Opret nye kolonner i Excel-fil og beregne log 2 SILAC nøgletal for samtlige udtagne / mock kolonner. For konvertering af en mock / prøve forholdet til en prøve / mock-forholdet, skal du bruge formlen: "= 1/ratio"
7 Data Analysis II:. Valg af stor tillid Interaktioner til yderligere undersøgelse
- Åbent Graphpad Prism, vælg Ny> datatabel og graf ... Vælg 'kolonnen "fra listen på venstre side af vinduet, og vælg på ENTER / Importer data> Indtast replica værdier, stablet i kolonner muligheder. Tryk på 'Opret'.
- Vælg og kopiere en given log 2 Prøve / Mock SILAC forholdet kolonne fra Excel-regneark i den nye Prism fil.
- Klik på dropdown "Indsæt" menuen og vælge "Ny analyse«. Under kolonne analyse vælge 'Frequency distribution «. Holde standardindstillingerne klik på 'OK'.
Bemærk: Dette trin frembringer et histogram, der illustrerer antallet af identificerede proteiner på et givet forhold. Dette bør udgøre en Gaussisk fordeling. - I mappen 'resultater' vil en ny "Histogram" sektionen er blevet genereret. Vælg afsnittet frekvensfordeling.
- Klik på dropdown "Indsæt" menuen og vælg Ny analyse> XY> Nonlinear regression (kurvetilpasning). Klik på 'Gaussisk fordeling', og klik på OK.
Bemærk: Dette trin passer en kurve til data frekvensfordeling genereret i trin 7.3, hvilket giver værdier, der efterfølgende kan anvendes til at beregne tærskler for betydning. - I resultaterne vindue, der vises, er middelværdi og standardafvigelse givet. Generer en tærskel ved at tilsætte 1,96 standardafvigelser til middelværdien.
Bemærk: Disse værdier repræsenterer middelværdien og standardafvigelser af Gauss distribution, ikke det samlede datasæt. 1,96 standardafvigelser vil lægge en tærskel på konfidensgrænse på 95% (p ≤ 0,05). 2,58 SD ville give 99%, og 3,3 SD 99,9%. Tærsklen bør fastsættes individuelt for hver replika eksperiment, da det kan variere.
8. Data Analysis III:. Sammenfletning Replica datasæt
Bemærk: For at være sikker på at identificere interaktionspartnere en typisk SILAC pulldown eksperiment ideelt bør udføres tre gange, med mediet og tunge mærkede prøver skiftede for en af gentagelserne til at kontrollere for eventuelle effekt af medier på resultaterne. Et protein, der viser sig som interagere i mindst to af de tre eksperimenter med 'switched'-media prøve ideelt set repræsenterer en af disse, er en høj interaktion tillid.
- Retur til Excel-fil, skal du oprette et nyt faneblad kaldet »kombineret«. Label kolonne A 'tiltrædelse "og kopiere alle de numre tiltrædelsesforhandlingerne fra hver of de individuelle forsøg i denne enkelt kolonne.
- Vælg 'Data' fanen, og derefter 'fjerne dubletter' muligheden.
- Opret kolonner til SILAC nøgletal, og forholdet variation fra hvert forsøg samt for proteinet navn / beskrivelse kolonne.
- På fanen beskrivelse, bruge LOPSLAG formel til at samle beskrivelsen af hver tiltrædelse nummer. Træk formlen ned gennem kolonnen for at udfylde i proteinet beskrivelse. VLOOKUP formel er: "= VLOOKUP (AccessionNo, WheretoLook, ColumnsAccross, False)", hvor: AccessionNo er $ økse med X er rækkenummeret WheretoLook er fanen 'Experiment Name' $ A $ 2:.! $ Y $ Z, hvor Y og Z er nederst til højre stykke af data i regnearket, der henvises til. ColumnsAccross er antallet af kolonner på tværs af tiltrædelsen number i kolonne A en ønsket værdi ligger.
Bemærk: For eksempel, hvis tiltrædelse nummer er i kolonne A, og data for interesse ligger i kolonne E. Værdien her ville være 5 (kolonne A tæller som 1). Som accessionsnumre blev samlet i trin b, er det mest sandsynligt, at LOPSLAG ikke vil få alle de nødvendige navne fra et eksperiment. Når det vender tilbage N / A, ændre formlen for at få en beskrivelse fra hvert forsøg på skift indtil alle beskrivelserne erhverves. - For at fremhæve interagerende proteiner i den kombinerede datasæt, vælge hver forholdet kolonne individuelt og klik på fanen Startside, efterfulgt af Betinget formatering> Fremhæv celleregler> Flere regler.
- Vælg stil 'Classic'. Kun formatere celler, der indeholder 'Cell værdi «,» Større end eller lig med ". I boksen skal du skrive i 1,96 standardafvigelse værdi, og klik på 'OK'.
- Vurdere forholdet variation for hvert enkelt positivt samspil. Hvis subtrahere% variability ville droppe et "hit" under grænseværdien, bør behandles med forsigtighed.
Bemærk: Dette repræsenterer hvor konsekvent de individuelle forhold for hver peptid, der tilsammen udgør en proteiner 'SILAC forholdet er, og er givet som en procentdel. Når variabilitet forholdet tages i betragtning og et protein giver en SILAC ligger over tærsklen, dette protein er et hit. Hvis variationen forholdet giver et område, der falder under tærsklen, den 'hit' kan repræsentere et forurenende stof. - Gentag dette for hver af de resultater kolonner og sammenligne på tværs af eksperimenter. Fremhævet identificerede proteiner i to eller flere eksperimenter repræsenterer en høj tillid interaktion.
Bemærk: Afhængigt af den database, der anvendes til at tildele protein accessionsnumre, i forskellige eksperimenter et protein kan have været identificeret under et andet, eller endda flere accessionsnumre. Det er vigtigt at kontrollere dette for at sikre, at proteiner, der ikke ved et uheld udeladt.
Representative Results
I et typisk SILAC pulldown forsøg størstedelen af identificerede proteiner (> 90%) repræsenterer forurenende stoffer samt proteiner bindende ikke-specifikt til affinitetsmatrix og dette er illustreret i figur 2B, selv når vask protokoller fjerne et flertal af cytoplasmatiske kontaminanter såsom GAPDH (figur 2A). , At klynger af ikke-specifikt bindende proteiner i en normal fordeling tillader imidlertid proteiner, der specifikt binder til et protein af interesse at skelne mellem disse har højere prøve / mock nøgletal end baggrunden. Mens forureninger teoretisk skulle klynge omkring en log 2 SILAC på 0, er dette ikke nødvendigvis er tilfældet, er et eksempel på dette gives i figur 3.. Mulige grunde til dette bl.a. ufuldkomne SILAC mærkning af celler, ilægning af ulige mængder eller koncentrationer af lysat på anti-GFP-perler, utilsigtet tab af perler under oprensning eller ulige mixning af prøver ved slutningen af oprensningsproceduren 3. Dog antager data analyseres på grundlag af en tærskel standardafvigelse fra middelværdien af de normalt fordelte forureninger bør mindre forskydninger i centrering af data ikke påvirke kvaliteten af resultaterne.
Når man sammenligner forskelle i protein interaktioner mellem to beslægtede proteiner, kan en lignende situation, når en protein af interesse er produceret til højere niveauer inden for celler end et sekund (enten på grund af variation i transfektionseffektiviteten, eller en iboende egenskab af proteinet eller mRNA) . Nogen variation i ekspression (fx figur 2A) kan korrigeres for ved at analysere SILAC forholdet for disse to prøver. I dette eksempel disse ville være de GFP-eIF4AI og GFP-eIF4AII prøver. Ved at analysere 4AI/4AII SILAC forhold som omtalt i afsnit 7, er det muligt at identificere proteiner, hvis binding varierer betydeligt mellem isoformer.
| Kolonneoverskrift | Beskrivelse |
| Tiltrædelse | Viser nummeret på den sekvens tiltrædelse |
| Dækning | Andel af proteinsekvensen, der er omfattet af de identificerede peptider |
| ♯ PSM | Peptid spektral kamp |
| ♯ peptider | Samlet antal unikke peptider identificeret for et protein |
| ♯ AA'ere | Længden af et protein i aminosyrer |
| MW (Da) | Molekylvægten af et protein i Dalton. Omfatter ændringer |
| calc. PI | Den teoretiske isoelektriske punkt af et protein |
| Score | Den samlede score af et protein (der repræsenterer summen af individual peptid scoringer). Den nøjagtige score kræves for signifikans vil variere mellem eksperimenter. En MS facilitet vil normalt anvende en 5% falsk opdagelse sats cutoff. |
| Sequence | Sekvensen af aminosyrer, der udgør proteinet |
| Ratio | Den relative intensitet af peptider i en navngiven mærkede prøve i forhold til en anden mærkede prøve |
| Ratio Count | Antallet af peptid nøgletal, der blev brugt til at beregne en given protein-forhold |
| Ratio variabilitet (%) | Den variation af de enkelte peptid nøgletal anvendes til at beregne en given protein-forhold |
| Beskrivelse | Navnet på proteinet |
Tabel 1.. Standard kolonneoverskrifter fra en rapport Proteome Discoverer.Mens nyttige oplysninger kan opnås fra alle disse kolonner, er de afgørende for denne analyse er vist med fed skrift.
| Tiltrædelse | Peptider | 4AI/Mock | 4AII/Mock | Navn | SILAC analyse |
| A8K7F6 | 21 | 100 | 1 | eIF4AI | "Bait" protein |
| Q14240 | 22 | 0.01 | 90,855 | eIF4AII | |
| G5E9S1 | 25 | 47,575 | 30.53 | eIF4GI | Interagerende proteiner |
| Q59GJ0 | 5. | 11,778 | 10,619 | eIF4GII60; | |
| P06730 | 3 | 7.22 | 7,57 | eIF4E | |
| Q5T6W5 | 4. | 0.685 | 0,646 | hnRNPK | Ikke-specifikt binder forureninger |
| P62805 | 1 | 0.531 | 0,498 | Histon H4 | |
| H6VRG2 | 18 | - | - | Keratin-1 | Miljømæssige forureninger |
| P35527 | 11 | 0.01 | 0.01 | Keratin-1 cytoskelet 9 |
Tabel 2.. Typiske Data fra en SILAC immunoprecipitation eksperiment. Giving eksempel data for et protein af interesse / agn (høj peptider, høj ratio), proteiner interagerer med et protein af interesse (høje / lave peptider, høj ratio), non-specifikt bindende proteiner (høj / lav PeptIDES, nøgletallet falder til under cutoff - i dette eksperiment 0,96), og miljøbelastende stoffer (ofte høje peptider, negativ forholdet / under tærsklen).
Figur 1. Forsøgsplan. Første celler dyrkes i medier manglede arginin og lysin og substitueret med en stabil isotop mærket arginin og lysin i 2 uger (1). (2) Cellerne podes i 10 cm2 skåle og transient transficeret med plasmider, der koder for GFP (Mock), eller GFP-fusionsproteiner (prøve). (3) Cellerne lyseres, og GFP eller GFP fusionsproteiner immunopræcipiteret fra cellelysater. (4) Prøverne kombineres i forholdet 1:1 og forelægges til LC-MS/MS analyse. Data er derefter analyseret for at fjerne lav tillid protein identifications og at vælge et niveau af protein berigelse svarende til ægte interagerende proteiner.
Figur 2. Bekræftelse egnede immunpræcipitation forhold. A) Western blot-analyse af cellelysater, samt ubundne og bundne fraktioner fra immunopræcipiteringen bekræfter ekspression og immunfældning af proteinet af interesse. Et western blot mod GAPDH bekræfter udtømning af ikke-interagerende proteiner og yderligere western blot en kendt interagerende partner eIF4A bekræfter vellykket immunopræcipitation af proteiner, der binder til proteinet af interesse. B) Når interagerende partnere i et protein af interesse, er ikke kendt, en sølv-farvet gel kan bekræfte immunoudfældning af interagerende proteiner. På denne sølv-plet ed gelbånd for GFP og GFP-eIF4AI/II er klare, og et band migrerer ved den korrekte størrelse til eIF4G er kun til stede i de GFP-4AI/II-bound baner og ikke i GFP kontrol vognbane.
Fig. 3. Repræsentative resultater. Histogram, som viser fordelingen af protein-forhold fra en gentagelse af (A) GFP-eIF4AI eller (B) GFP-eIF4AII pulldown. Den 1,96 standardafvigelse cutoff er markeret med en stiplet linie. Interagerende proteiner, der falder uden for de normalt fordelte forureninger er tydelig fra ~ 0,25 og 1 (A), og ~ 0,3-1,5 i (B).
les/ftp_upload/51656/51656fig4.jpg "/>
Fig. 4. Identifikation af EIF komplekse medlemmer fra en enkelt kopi af en SILAC IP eksperiment. Proteiner i grøn var proteinet af interesse anvendes til pulldown interagerende proteiner er skraveret fra rød til hvid ifølge log 2 SILAC forholdet i SILAC IP med rød er den mest udbredte protein i analysen, og hvid er den 1,96 SD cutoff. Proteiner gråskraveret er ikke identificeret i denne analyse.
Discussion
Den SILAC pulldown strategi beskrevet her repræsenterer en meget følsom og effektivt middel til at opdage nye protein: protein interaktioner, og desuden giver mulighed for hurtig og enkel diskrimination af ændrede bindende mønstre mellem nærtbeslægtede prøver af interesse. I dette eksempel denne teknik blev anvendt til at undersøge protein: protein-interaktioner mellem de eIF4AI og eIF4AII proteiner 6. Til forfatterens viden, dette er den første undersøgelse i litteraturen udnytte nytten af SILAC proteomics at undersøge cellulære interactome af disse to isoformer af eIF4A.
Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde anvender en GFP-tag og anti-GFP-perler 9, 10 og kan derfor nødvendige ændringer for at muliggøre denne fremgangsmåde skal anvendes til et specifikt protein af interesse, for eksempel, om mærket er placeret ved N-eller C-terminalen af et protein. Hvor det er muligt, western blots eller funktionelle assays børudføres for at detektere binding af et kendt protein-interaktion partner. Skulle et protein ikke tolerere fusion med et GFP tag, andre tagging eller pulldown strategier er blevet anvendt på SILAC pulldowns hjælp af både andre tags (FLAG 11, Biotin 12 STREP (egne data, upubliceret)), eller ved hjælp af primære antistoffer mod et protein af interesse, hvor siRNA knockdown af target protein giver en kontrolprøve 13. Sådanne eksperimenter er blevet beskrevet andetsteds i litteraturen, men i korte træk, trin 1 og trin 5,4-8 ville blive anvendt som ovenfor, med trin 2-5,3 modificeret som passende for udtrykket / rullemenuen foretrukne system ved hjælp af lige protein indgange, som beskrevet i trin 2,4-2,5. Som kvantificering faser tillade ikke-specifikke bindingsproteiner, der skal fjernes på analyseniveau, anbefales det at udelade præinkubering med kontrolperler eller høje salt vasker for at bevare lav affinitet protein: protein-interaktioner med et protein af interesse . En nuklease may skal medtages eller udelades fra denne protokol i henhold til detaljerne i en bestemt eksperiment. For eksempel: da de proteiner, der anvendes i denne metode er RNA helicaser blev RNase cocktail medtaget i protokollen til at fjerne indirekte vekselvirkninger medieres via RNA (trin 3.2). I nogle tilfælde imidlertid, kan der være en fordel at køre parallelle forsøg med og uden nuklease at identificere nukleinsyre afhængige interaktioner.
Inden for denne protokol, anbefales det at skifte til "medium" og "tunge" prøver i replikere eksperimenter for at kontrollere for variation indført ved forskelle i SILAC medier eller cellevækst. En alternativ kontrol indebærer den sekventielle skift af alle tre ('light', 'medium' og 'tung') medier i replika eksperimenter. Mens denne tilgang er potentielt mere stringent, betyder det øger kompleksiteten af analysen, som i mindst én gentagelse, et protein af interesse wsyg blive produceret i "light" mærkede celler og så er det nødvendigt at skelne mellem proteiner konsekvent identificeret i "light" prøver (miljøbelastende stoffer såsom keratiner), og dem, der kun er beriget med "light" prøver, når de er bundet til et protein af interesse.
Mens brugen af kvantificering af data giver mulighed for diskrimination af specifik-fra ikke-specifikke interaktioner ved brug af en tærskel, uundgåeligt nogle ægte interaktioner kan kasseres. Tilgangen Ovenstående er en enkel og hurtig metode til at identificere protein: protein interaktioner, der let kan forsøges af forskere uden tidligere erfaring med massespektrometri eller analyse af store protein: protein interaktion datasæt. For de fleste anvendelser er det mere end tilstrækkeligt til identifikation af nye proteiner af interesse. Yderligere modifikationer af denne tilgang til at hjælpe med at reducere dette tab af data er beskrevet andetsteds i litteraturen og omfatter anvendelse af en PRotein frekvens bibliotek, hvor kendte forurenende proteiner til et bestemt sæt af eksperimentelle parametre (cellelinie perle matrix, buffer betingelser) kan udelukkes 10, 14. Men afhængigt af de særlige eksperimentelle parametre kan det være nødvendigt at køre en række af kontrol eksperimenter for at generere en perle proteom, og dette kan derfor øge både omkostningerne og kompleksiteten af eksperimentet. Yderligere oplysninger om denne teknik er tilgængelig fra www.peptracker.co.uk hjemmeside 14.
Det bør også bemærkes, at den ovenfor beskrevne protokol involverer blanding af forskelligt mærkede prøver ved slutningen af immunopræcipitation proces (betegnet en Blanding Efter Oprensning - MAP SILAC eksperiment). Dette gøres som protein: protein-interaktioner, ved en given ligevægt 15. Det skal bemærkes, at andre grupper har kombineret denne MAP SILAC fremgangsmåde beskrevet i denne protokol med inkubation af prøvernefør pulldown (Oprensning Efter Blanding - PAM SILAC) for forskellige længder af tid (20 min til 2 timer er blevet anvendt i litteraturen) 15, 16.. Baseret på, hvor hurtigt et protein ratio falder fremad 1:1, er det muligt at kvalitativt undersøge bindingsaffiniteter og definere proteiner som stabile eller dynamiske interagerende proteiner 15.
Sammenfattende SILAC pulldowns repræsenterer et stærkt middel til at identificere proteiner, der interagerer med en bestemt protein af interesse, i en fysiologisk relevant indstilling. Teknikken kan meget let tilpasses til en række forskellige oprensningsstrategier, så dens anvendelse på en hvilken som helst givet protein af interesse. Kvantificering af resultaterne langt forenkler identifikationen af ægte interaktioner og tillader afslapning af strenge pufferbetingelser anvendes til at fjerne ikke-specifikke bindere, og dermed bevarer lav affinitet interaktioner. Som op til tre prøver kan sammenlignes i ovenståendestrategi, teknikken har klare styrker i at sammenligne forskellene i proteinbindingen mellem forskellige protein isoformer, mutant proteiner eller effekten af farmakologiske hæmmere. Som hele gelskiver analyseres i stedet for enkelte bands, pletten ved Coomassie, antallet af identificerede proteiner ved høj tillid er typisk højere end dem, der udpeges i en standard GST / TAP-pulldown, og forsøgslederen skævhed i udvælgelsen af proteiner af interesse fjernes. Teknikken derfor sammenligner meget positivt med andre almindeligt anvendte teknikker, der anvendes i identifikationen af nye protein-interaktioner (gær 2-hybrid, GST / His eller TAP Pulldowns).
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Wellcome Trust og BBSRC til IG. IG er et Wellcome Senior Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
| Dialysed FBS (10 kDa cutoff) 500 ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
| Arginine (R0) 25 g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock) |
| Arginine (R6) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock) |
| Arginine (R10) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock) |
| Lysine (K0) 25 g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock) |
| Lysine (K4) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock) |
| Lysine (K8) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock) |
| Penicillin/streptomycin, Liquid. 100 ml | Gibco | 15140-122 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| GFP-trap Agarose (500 μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
| 5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| 1.7 ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
| BCA protein assay kit (1 L) | Pierce | 23225 | |
| Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
| NP-40 alternative | Millipore | 492016 |
References
- Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. Protein-protein interactions. Biochem Soc Trans. 38, 875-878 (2010).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Trinkle-Mulcahy, L. Resolving protein interactions and complexes by affinity purification followed by label-based quantitative mass spectrometry. Proteomics. 12, 1623-1638 (2012).
- Emmott, E., et al. The cellular interactome of the coronavirus infectious bronchitis virus nucleocapsid protein and functional implications for virus biology. J Virol. 87, 9486-9500 (2013).
- Li, W., Belsham, G. J., Proud, C. G. Eukaryotic initiation factors 4A (eIF4A) and 4G (eIF4G) mutually interact in a 1:1 ratio in vivo. J Biol Chem. 276, 29111-29115 (2001).
- Nielsen, P. J., Trachsel, H. The mouse protein synthesis initiation factor 4A gene family includes two related functional genes which are differentially expressed. EMBO J. 7, 2097-2105 (1988).
- Galicia-Vazquez, G., Cencic, R., Robert, F., Agenor, A. Q., Pelletier, J. A cellular response linking eIF4AI activity to eIF4AII transcription. RNA. 18, 1373-1384 (2012).
- Zakowicz, H., et al. Mutational analysis of the DEAD-box RNA helicase eIF4AII characterizes its interaction with transformation suppressor Pdcd4 and eIF4GI. RNA. 11, 261-274 (2005).
- Rothbauer, U., et al. A versatile nanotrap for biochemical and functional studies with fluorescent fusion proteins. Mol Cell Proteomics. 7, 282-289 (2008).
- Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
- Dobreva, I., Fielding, A., Foster, L. J., Dedhar, S. Mapping the integrin-linked kinase interactome using SILAC. J Proteome Res. 7, 1740-1749 (2008).
- Mittler, G., Butter, F., Mann, M. A SILAC-based DNA protein interaction screen that identifies candidate binding proteins to functional DNA elements. Genome research. 19, 284-293 (2009).
- Selbach, M., Mann, M. Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown QUICK. Nat Methods. 3, 981-983 (2006).
- Boulon, S., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9, 861-879 (2010).
- Wang, X., Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7, 46-57 (2008).
- Fang, L., et al. Characterization of the human COP9 signalosome complex using affinity purification and mass spectrometry. J Proteome Res. 7, 4914-4925 (2008).
