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Biology

SILAC-immunoprecipitation मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स का प्रयोग स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन बातचीत भागीदारों की पहचान

Published: July 6, 2014 doi: 10.3791/51656
Automatic Translation
1, 1
1Division of Virology, Department of Pathology, University of Cambridge

Summary

प्रोटीन बातचीत: SILAC immunoprecipitation प्रयोगों उपन्यास प्रोटीन की खोज के लिए एक शक्तिशाली साधन का प्रतिनिधित्व करते हैं. अनुमति से नियंत्रण और परीक्षण के नमूने, सच बातचीत दोनों में प्रोटीन बहुतायत की सटीक रिश्तेदार मात्रा का ठहराव आसानी से प्रयोगात्मक contaminants से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, और कम संबंध में बातचीत कम कड़े बफर शर्तों के उपयोग के माध्यम से संरक्षित.

Abstract

प्रोटीन बातचीत: इम्युनो संबंध शुद्धीकरण, SILAC immunoprecipitation, के साथ संयुक्त मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स उपन्यास प्रोटीन की खोज के लिए एक शक्तिशाली साधन का प्रतिनिधित्व करते हैं. नियंत्रण और परीक्षण के नमूने दोनों में प्रोटीन बहुतायत की सटीक रिश्तेदार मात्रा का ठहराव की अनुमति देकर, सच बातचीत आसानी से प्रयोगात्मक contaminants से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. निम्न संबंध में बातचीत कम कड़े बफर शर्तों के उपयोग के माध्यम से संरक्षित और आसानी से पहचाने रहना जा सकता है. इस प्रोटोकॉल एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री की सुविधा के लिए प्रस्तुत करने के लिए तैयारी द्वारा पीछा ब्याज की प्रोटीन, टैग किए गए एक समानता के स्थिर आइसोटोप लेबल अमीनो एसिड, अभिकर्मक और immunoprecipitation साथ टिशू कल्चर कोशिकाओं की लेबलिंग की चर्चा. इस प्रोटोकॉल फिर ब्याज की एक प्रोटीन के साथ बातचीत सेलुलर भागीदारों की पहचान करने के क्रम में मास स्पेक्ट्रोमीटर से दिए गए डेटा का विश्लेषण और व्याख्या करने के लिए कैसे करें. एक उदाहरण के रूप में इस तकनीक पहचान करने के लिए लागू किया जाता हैeIF4AI और eIF4AII: यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारकों के लिए बाध्य प्रोटीन tify.

Introduction

प्रोटीन समारोह को समझने में एक आवश्यक कदम प्रासंगिक बातचीत प्रोटीन की पहचान है. इस तरह के प्रोटीन अज्ञात हैं जहां उपलब्ध तकनीकों का एक नंबर, अपने गुण और कमियों के साथ प्रत्येक रहे हैं. ये खमीर दो संकर प्रणाली, पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग पुलडाउन assays, साथ ही साथ मिलकर आत्मीयता शुद्धि या नल टैगिंग 1, 2 शामिल हैं.

इन तकनीकों के लिए एक अधिक के अलावा हाल ही (SILAC) 3 सेल संस्कृति में अमीनो एसिड के स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री के बाद प्रासंगिक स्तनधारी सेल लाइन से ब्याज की एक प्रोटीन के संबंध शुद्धीकरण का संयोजन है. यह है कि सेल स्थानीयकरण और बाद translational संशोधनों में खमीर दो संकर दृष्टिकोण से अधिक लाभ अधिक लाभ, साथ ही साथ परेशान नहीं कर रहे है पारंपरिक नल टैगिंग यह वजह उपयोगकर्ता की अनुमति एक मात्रात्मक बजाय गुणात्मक दृष्टिकोण है कि मेंdily विशेष रूप से बाध्य है कि मेजबान कारकों से, प्रोटीन और contaminants बातचीत गैर विशेष रूप से अलग करते हैं. एक नमूना आम तौर पर नहीं बल्कि व्यक्ति के रूप में प्रोटीन बैंड की तुलना में, पूरे विश्लेषण किया जाता है के रूप में आगे, ब्याज की प्रोटीन इसी तरह एक जेल पर प्रोटीन पलायन, और न ही वे आम तौर पर धुंधला के बाद दिखाई देने के लिए पर्याप्त स्तर पर मौजूद होने की जरूरत है, के लिए अग्रणी द्वारा नकाबपोश नहीं कर रहे हैं आत्मविश्वास से पहचान प्रोटीन 4 की बढ़ी संख्या.

इस तकनीक का प्रदर्शन, निकट से संबंधित यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक के GFP fusions eIF4AI और eIF4AII 90% अमीनो एसिड पहचान पर कि शेयर SILAC-immunoprecipitation मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स द्वारा जांच की गई. मानव eIF4AI और द्वितीय GFP eIF4A के एन टर्मिनस से जुड़े हुए है, जहां एक संलयन प्रोटीन के लिए फार्म pEGFP-C1 में क्लोन किया गया. क्षणिक अभिकर्मक स्थिर आइसोटोप लेबल 293T कोशिकाओं को इन निर्माणों देने के लिए इस्तेमाल किया गया था स्थिर सेल लाइनों पैदा करने के लिए जरूरत से बचने के लिए.

(चित्रा 1).

SILAC immunoprecipitation प्रत्यक्ष बातचीत की लेकिन यह भी कम आकर्षण या प्रोटीन परिसरों 4 के साथ अप्रत्यक्ष बातचीत न केवल की पहचान में सक्षम बनाता है. इस प्रणाली का प्रयोग, eIF4AI और द्वितीय immunoprecipitations प्राथमिक बाध्यकारी साथी eIF4G (isoforms मैं / द्वितीय और तृतीय) 5 की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और विश्वास पहचान है, साथ ही eIF4E साथ अप्रत्यक्ष बातचीत, और eIF3 परिसर के कई घटकों की अनुमति दी.

Protocol

1. जनरेशन और SILAC लेबल सेल लाइनों की Passaging

नोट: trypsin नमूनों की अधूरी लेबलिंग के लिए नेतृत्व करेंगे जो unlabeled एमिनो एसिड होता है, हो सकता है के रूप में ट्रिप्सिन-EDTA के उपयोग के विश्लेषण के लिए प्रयोगात्मक नमूने की Passaging और तैयारी के सभी चरणों में बचा जाना चाहिए.

  1. SILAC मीडिया की एक बोतल तैयार करने के लिए (युक्त Arg / लिस मुक्त DMEM के एक 500 मिलीलीटर की बोतल के लिए एक उचित SILAC लेबल arginine (84 मिलीग्राम / पीबीएस में एमएल) और लाइसिन (पीबीएस में 146 मिलीग्राम / एमएल) की एक 0.5 मिलीलीटर विभाज्य जोड़ें एल glutamine).
  2. अगला, 500 मिलीलीटर की बोतल के लिए dialyzed FBS की 50 मिलीलीटर और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
    नोट: HEK 293T कोशिकाओं (ATCC) की कमी DMEM मीडिया में बनाए रखा जाना चाहिए arginine और लाइसिन और प्रकाश (R0K0) के साथ पूरक, मध्यम (R6K4) या भारी (R10K8) अमीनो एसिड, dialyzed भ्रूण गोजातीय सीरम (10 केडीए कटऑफ), और एक प्रकार की दवा / स्ट्रेप्टोमाइसिन. प्रकोष्ठों पूरा सुनिश्चित करने के लिए 5 कोशिका विभाजन की एक न्यूनतम के लिए मीडिया में बनाए रखा जाना चाहिएलेबलिंग. ज्यादातर मामलों में कोशिकाओं को आसानी से ≥ 2 सप्ताह में चिह्नित कर रहे हैं.
  3. Passaging के लिए कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए, कोशिकाओं कुप्पी मार से monolayer से उखाड़ फेंकना चाहिए. वैकल्पिक सेल स्क्रेपर्स की या एंजाइम मुक्त, पीबीएस आधारित सेल हदबंदी बफर का उपयोग करके उपयोग में शामिल हैं.
    नोट: मीडिया के संरक्षण के लिए, कोशिकाओं T25 बोतल में passaged किया जाना चाहिए और बड़ा सेल नंबर ही तुरंत पहले एक प्रयोग करने के लिए उत्पन्न.
  4. पूर्व transfecting कोशिकाओं को 24 घंटे, जांच के तहत प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए एक एकल 10 2 सेमी पकवान में 3.5 x 10 6 SILAC लेबल कोशिकाओं बीज.

PEGFP संलयन constructs के साथ लेबल की कोशिकाओं के 2. अभिकर्मक

  1. कोशिकाओं से मीडिया निकालें और एंटीबायोटिक मुक्त SILAC DMEM (प्रकाश, मध्यम या भारी) मीडिया के 9 मिलीलीटर के साथ बदलें.
    नोट: वे liposome आधारित अभिकर्मक अभिकर्मकों की क्षमता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, क्योंकि एंटीबायोटिक्स मीडिया को नहीं जोड़ा जाना चाहिए.
  2. Prepaउपयुक्त प्लाज्मिड की 10 ग्राम का एक मिश्रण फिर से (epEGFP-C1, pEGFP-eIF4A-मैं, pEGFP-eIF4A द्वितीय) एंटीबायोटिक मुक्त SILAC DMEM के 500 μl में और एंटीबायोटिक मुक्त SILAC DMEM 10 युक्त के 500 μl के साथ मिश्रण अभिकर्मक अभिकर्मक के μl (जैसे, Lipofectamine 2000). यह ऊपर और नीचे pipetting कई बार अच्छी तरह से प्रतिक्रिया मिश्रण.
  3. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं और तब ड्रॉप वार सेल monolayer में जोड़ें. पक्ष की ओर से धीरे थाली रॉक.
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को सेते हैं और 10% सीओ 2 के 24 घंटे के लिए.
    नोट: कोई स्पष्ट विषाक्तता में ब्याज परिणामों के एक प्रोटीन की अभिव्यक्ति है, तो यह ट्रांसफ़ेक्ट प्लाज्मिड की राशि और / या बाद में अभिव्यक्ति की अवधि की अवधि को कम करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

3. फसल काटने सेल lysates

  1. एक सेल खुरचनी का उपयोग कर बर्फ के ठंडे पीबीएस में पकवान से हार्वेस्ट कोशिकाओं. 4, 220 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं लीजिए76, 5 मिनट के लिए सी. ठंडा पीबीएस के 10 एमएल में कोशिकाओं एक और 3x धो लें.
  2. सेल lysis बफर के 200 μl 5 μl पर 1x एकाग्रता और RNase कॉकटेल (वैकल्पिक) में हौसले से जोड़ा protease अवरोध कॉकटेल तृतीय युक्त (10 मिमी TrisCl / 7.5 पीएच, 150 मिमी NaCl, 0.5 मिमी EDTA, 0.5% NP40) में सेल गोली Resuspend मिलीलीटर प्रति.
    नोट: गतिविधि बंधन ज्ञात न्यूक्लिक एसिड के साथ प्रोटीन के लिए, यह पिछले वर्षा के lysate को न्युक्लिअसिज़ जोड़ने के लिए आवश्यक हो सकता है. Nuclease गयी है जहां मामलों में, नमूने हर 10 मिनट pipetting साथ, बर्फ पर 30 मिनट के लिए बर्फ पर incubated किया जाना चाहिए. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा नमूना और विश्लेषण का एक छोटा सा अंश से कुल न्यूक्लिक एसिड निकालने nuclease की प्रभावशीलता की जांच कर सकते हैं.
  3. 13,000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने, 10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस घुलनशील सेल lysate के रूप में सतह पर तैरनेवाला बरकरार रहती है.
  4. सेल lysate की एकाग्रता निर्माता के निर्देशों के अनुसार बीसीए परख द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए.
  5. 500 μl के अंतिम मात्रा में प्रोटीन एकाग्रता मानक के अनुसार protease अवरोध कॉकटेल तृतीय युक्त lysis बफर का प्रयोग करें.
  6. कमजोर पड़ने बफर के 500 μl के अलावा अंतिम 1x एकाग्रता में protease अवरोध कॉकटेल तृतीय युक्त (10 मिमी TrisCl / 7.5 पीएच, 150 मिमी NaCl, 0.5 मिमी EDTA) के साथ 1 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें. नमूने के एक 50 μl विभाज्य नमूना इनपुट के रूप में बनाए रखा जाना चाहिए और lysate (जैसे, GFP जाल) विरोधी GFP मोतियों की तैयारी whilst के बर्फ पर रखा.
    नोट: आमतौर पर पैदावार अंतिम 1 मिलीलीटर नमूने में प्रोटीन की 1-3.5 मिलीग्राम के बीच अलग अलग. ऊपर बफ़र्स हित के कई प्रोटीन के लिए उपयुक्त कला है, दूसरों के लिए यह चारा प्रोटीन solubilized है यह सुनिश्चित करने के लिए और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत बनाए रखने के लिए बफर घटकों को संशोधित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. संभावित परिवर्तन बफरिंग एजेंट (फास्फेट, HEPES), नमक एकाग्रता (150-500 मिमी), डिटर्जेंट का विकल्प है, या अन्य additives शामिल हैं.

4. विरोधी जी के लिए बाइंडिंगएफपी मोती

  1. संक्षेप में मोती resuspend को मनका घोल भंवर. अंत के साथ एक 200 μl विंदुक टिप का उपयोग करना, काट एक ताजा ट्यूब नमूना प्रति मोतियों की 25 μl हस्तांतरण.
    नोट: उपयोगकर्ता नमूना करने वाली नमूना भिन्नता को कम करने के लिए एक mastermix के रूप में एक एकल SILAC प्रयोग के लिए मोती तैयार करना चाहिए.
  2. मनका घोल के प्रत्येक 25 μl के लिए, 5 मिनट के लिए 2700 XG पर मोती कमजोर पड़ने बफर के 20 संस्करणों (75 μl घोल प्रति 1,500 μl) जोड़ने के लिए, और अपकेंद्रित्र. अगला, कमजोर पड़ने बफर के 20 संस्करणों में मोती एक और 2x धो लो.
  3. 25 μl मनका घोल प्रति 100 μl कमजोर पड़ने बफर जोड़ें. अंत के साथ एक 200 μl टिप का उपयोग करना, काट कदम 3.6 से SILAC लेबल नमूनों में से प्रत्येक को इस resuspended घोल का 85 μl हस्तांतरण.
  4. 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर मोती के साथ नमूने सेते हैं.

एमएस विश्लेषण के लिए नमूने के 5. धुलाई, क्षालन, और तैयारी

  1. 2,700 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने, 46, 5 मिनट के लिए सी. सतह पर तैरनेवाला के 50 μl खारिज सतह पर तैरनेवाला के शेष के साथ, अबाध नमूना के रूप में बनाए रखा जाना चाहिए.
  2. 1ml कमजोर पड़ने बफर मोती resuspend करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में जोड़ा जाना चाहिए और नमूना 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, 2700 XG पर centrifuged. सतह पर तैरनेवाला खारिज किया जाना चाहिए. यह दो बार प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
  3. 2x एसडीएस लोड हो रहा है बफर के 50 μl के अलावा द्वारा मोतियों से प्रोटीन Elute, और 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 2700 XG पर centrifugation द्वारा मोती गोली
  4. जब तक आवश्यक है यह तो -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, जहां prelubricated ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला को बनाये रखें. एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री की सुविधा के लिए प्रस्तुत करने के लिए, लेबल के नमूने 01:01:01 (जैसे, प्रत्येक के 10 μl) मिश्रण और मिश्रित नमूना प्रस्तुत करें.
    नोट: इस बिंदु पर नमूने पश्चिमी धब्बा, चांदी धुंधला हो जाना या ज्ञात / अज्ञात बंधन भागीदारों के साथ बातचीत के लिए परीक्षण करने के लिए अन्य तरीकों से परीक्षण किया जा सकता है. एक उदाहरण छवि में दी गई हैवेस्टर्न ब्लॉट द्वारा eIF4G, और ब्याज की एक प्रोटीन से pulldown के नमूने में मौजूद चांदी धुंधला बैंड की उपस्थिति, लेकिन नहीं एक नियंत्रण नमूना - एक ज्ञात बातचीत साथी की विशिष्ट बंधनकारी दिखा ure 2.
  5. LC-MS/MS विश्लेषण के लिए नमूना प्रस्तुत.
    नोट: ब्याज की एक टैग प्रोटीन सफलतापूर्वक बातचीत भागीदारों, प्रत्येक लेबल नमूना के बराबर मात्रा में (प्रकाश, मध्यम और भारी) और संयुक्त LC-MS/MS विश्लेषण के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं बंधन है कि एक बार संतुष्ट. यह विश्लेषण के लिए एक आईपी नमूना के 30 μl कुल जमा करने के लिए सामान्य है. यह एक 30 μl कुल देने के लिए मध्यम लेबल और 10 μl भारी लेबल नमूने के 10 μl के साथ हल्की लेबल नमूना के 10 μl मिश्रण करना पड़ेगा.

6 डेटा विश्लेषण मैं:. परिणाम को समझना, और कम आत्मविश्वास पहचान का हटाया

नोट: Proteome जांच करनेवाला सॉफ्टवेयर से लौटे स्तंभ शीर्षकों की एक सूची तालिका 1 में दी गई है अलग.अलग सॉफ्टवेयर (जैसे, MSQuant, MaxQuant), हालांकि, इनमें से केवल एक सबसेट अलग शीर्षकों वापसी करेंगे विश्लेषण के लिए आवश्यक है और इन विभिन्न सॉफ्टवेयर संकुल के लिए आम हैं. डेटा हमेशा अनुपात के प्रत्येक नमूने अनुपात की तुलना की पहचान की प्रत्येक प्रोटीन के लिए एक परिग्रहण संख्या, (मध्यम बनाम प्रकाश, भारी आदि बनाम भारी, मध्यम बनाम प्रकाश) शामिल होना चाहिए, पहचान अद्वितीय पेप्टाइड्स की संख्या, और झूठी सकारात्मक दर या विश्वास के संकेत के कुछ फार्म.

  1. आंकड़ों के माध्यम से जाने से पहले, पहले एक नई स्प्रेडशीट के लिए कच्चे डेटा की प्रतिलिपि. इस स्प्रेडशीट से परिग्रहण संख्या देने के उन लोगों को छोड़कर सभी स्तंभों को हटा दें, अद्वितीय पेप्टाइड्स की संख्या, नमूने, अनुपात परिवर्तनशीलता, और प्रोटीन विवरण की तुलना अनुपात. प्रतिकृति प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया, तो ये एक प्रयोग एक अलग टैब पर प्रदर्शित होने के साथ, एक ही एक्सेल फाइल में जोड़ा जाना चाहिए.
    नोट: कम आत्मविश्वास डेटा केवल एक ही अद्वितीय पेप्टाइड द्वारा पहचान प्रोटीन शामिल हैं, और उन wयहाँ मात्रा का ठहराव संभव नहीं था.
  2. पेप्टाइड्स की संख्या से डेटा का आदेश और एक से अधिक पेप्टाइड कमी प्रोटीन के लिए प्रविष्टियों को हटाने के लिए excels 'के आधार पर क्रमबद्ध' समारोह का प्रयोग करें. तब अनुपात के आधार पर सॉर्ट और SILAC अनुपात (unquantified प्रोटीन) की कमी है कि प्रोटीन को हटा दें.
  3. 'SILAC अनुपात' सेल पहचानकर्ता के लिए एवजी है जहां '= प्रवेश (SILAC अनुपात, 2)',: सूत्र का उपयोग कर एक प्रवेश 2 मूल्यों को SILAC अनुपात में कनवर्ट करें.
    नोट: 0 और 1 के बीच मूल्यों के लिए प्रतिबंधित किया जा रहा है बहुतायत में कमी दिखा प्रोटीन के लिए किसी भी डेटा में एक SILAC अनुपात के परिणाम के रूप में, यह इस वृद्धि या में कमी हुई दोनों प्रोटीन का मतलब है, के रूप में एक प्रवेश 2 SILAC अनुपात को एक SILAC अनुपात कन्वर्ट करने के लिए सामान्य है एक नमूना 2 या -2 एक 4 गुना वृद्धि या कमी बहुतायत में है, और 3 या -3 एक 9 गुना वृद्धि या क्रमशः बहुतायत में कमी का प्रतिनिधित्व करता है, जहां एक लॉग पैमाने पर प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. इस परिवर्तन के बाद, डेटा एक गा फिट होना चाहिए0 से प्रवेश 2 SILAC अनुपात के आसपास केंद्रित ussian वितरण. इस का एक उदाहरण चित्रा 3 में दी गई है.
  4. एक्सेल फाइल में नए स्तंभ बनाने और सभी नमूना / नकली स्तंभों के लिए 2 SILAC अनुपात लॉग ऑन गणना. "= 1/ratio": एक नमूना / नकली अनुपात करने के लिए एक नकली / नमूना अनुपात के रूपांतरण के लिए, सूत्र का उपयोग करें

7 डेटा विश्लेषण द्वितीय:. आगे अध्ययन के लिए उच्च आत्मविश्वास सहभागिता का चयन

  1. ओपन GraphPad चश्मे, नई> डाटा टेबल और ग्राफ खिड़की के बाएं हाथ की ओर की सूची से ... का चयन करें 'स्तंभ' का चयन करें, और दर्ज / आयात डेटा का चयन करें> कॉलम विकल्पों में खड़ी प्रतिकृति मूल्यों, लिखें. प्रेस 'बनाएँ'.
  2. चुने और नए चश्मे फ़ाइल में एक्सेल स्प्रेडशीट से किसी दिए गए प्रवेश 2 नमूना / मॉक SILAC अनुपात स्तंभ की नकल.
  3. लटकती 'सम्मिलित करें' मेनू पर क्लिक करें और 'नया विश्लेषण' का चयन करें. स्तंभ विश्लेषण के तहत 'का चयनआवृत्ति वितरण '. मूलभूत विकल्पों को ध्यान में रखते हुए 'ओके' पर क्लिक करें.
    नोट: इस कदम के लिए एक निश्चित अनुपात में पहचान प्रोटीन की संख्या illustrating एक हिस्टोग्राम उत्पन्न करता है. यह एक गाऊसी वितरण फार्म चाहिए.
  4. 'परिणाम' फ़ोल्डर में एक नया 'हिस्टोग्राम' अनुभाग उत्पन्न किया गया होगा. आवृत्ति वितरण खंड का चयन करें.
  5. लटकती 'सम्मिलित करें' मेनू पर क्लिक करें और नई विश्लेषण चयन> XY> nonlinear प्रतिगमन (वक्र फ़िट). 'गाऊसी वितरण' पर क्लिक करें और ठीक क्लिक करें.
    नोट: यह कदम बाद में महत्व के लिए थ्रेसहोल्ड की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि मूल्यों से बेदखल कदम 7.3 में उत्पन्न आवृत्ति वितरण डेटा को एक वक्र फिट बैठता है.
  6. प्रतीत होता है कि परिणाम विंडो में, मतलब है और मानक विचलन दिया जाता है. मतलब के लिए 1.96 मानक विचलन जोड़कर एक सीमा से उत्पन्न करें.
    नोट: ये मान मतलब है और गाऊसी जिले के मानक विचलन का प्रतिनिधित्वribution, नहीं कुल डाटासेट. 1.96 मानक विचलन 95% विश्वास सीमा (0.05 ≤ पी) पर एक सीमा जगह होगी. 2.58 एसडी 99%, और 3.3 एसडी 99.9% देना होगा. यह भिन्न हो सकते हैं के रूप में सीमा प्रत्येक प्रतिकृति प्रयोग के लिए व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए.

8 डेटा विश्लेषण III:. प्रतिकृति डेटासेट्स विलय

नोट: एक ठेठ SILAC pulldown प्रयोग आदर्श परिणामों पर मीडिया के किसी भी प्रभाव के लिए नियंत्रित करने के लिए दोहराता से एक के लिए बंद कर मध्यम और भारी लेबल के नमूनों के साथ, तीन बार प्रदर्शन किया जाना चाहिए बातचीत भागीदारों की पहचान करने में विश्वास हो. में आदर्श रूप में इन में से एक का प्रतिनिधित्व 'switched' मीडिया नमूने के साथ तीन प्रयोगों के कम से कम दो, बातचीत के रूप में दिखाता है कि एक प्रोटीन, एक उच्च आत्मविश्वास बातचीत है.

  1. , एक्सेल फाइल पर लौटें 'संयुक्त' नामक एक नया टैब बनाएँ. लेबल स्तंभ A 'विलय' और ओ प्रत्येक से सभी परिग्रहण संख्या को कॉपीइस एक स्तंभ में एफ व्यक्तिगत प्रयोगों.
  2. 'डाटा' टैब, और फिर 'निकालें डुप्लिकेट' विकल्प का चयन करें.
  3. SILAC अनुपात, और प्रत्येक प्रयोग से अनुपात परिवर्तनशीलता के साथ ही प्रोटीन नाम / विवरण स्तंभ के लिए के लिए स्तंभ बनाएँ.
  4. विवरण टैब में, प्रत्येक परिग्रहण संख्या का विवरण एकत्र करने के लिए VLOOKUP सूत्र का उपयोग करें. प्रोटीन विवरण में भरने के लिए स्तंभ नीचे सूत्र खींचें. VLOOKUP सूत्र है: "= VLOOKUP (AccessionNo, WheretoLook, ColumnsAccross, false)", जहाँ:.! AccessionNo एक्स WheretoLook 'प्रयोग टैब का नाम' एक $ 2 $ है पंक्ति संख्या होने के साथ $ कुल्हाड़ी है: $ वाई $ जेड जहां वाई और जेड स्प्रेडशीट संदर्भित किया जा रहा पर डेटा के नीचे सही टुकड़े कर रहे हैं. ColumnsAccross परिग्रहण संख्या से भर स्तंभों की संख्या हैदिसंबर स्तंभ A में एक वांछित मूल्य निहित है.
    नोट: परिग्रहण संख्या स्तंभ A में है, और ब्याज की डेटा स्तंभ ई. में निहित है अगर उदाहरण के लिए, यहाँ मूल्य (स्तंभ 1 के रूप में गिना जाता है) 5 होगा. परिग्रहण संख्या कदम बी में जमा कर रहे थे, यह VLOOKUP एक ​​प्रयोग से सभी आवश्यक नाम प्राप्त नहीं होगा कि सबसे अधिक संभावना है. यह N / A देता है कहां, सभी विवरण प्राप्त कर रहे हैं जब तक बदले में प्रत्येक प्रयोग से विवरण प्राप्त करने के लिए सूत्र संशोधित.
  5. संयुक्त डाटासेट में प्रोटीन बातचीत को उजागर करने के लिए, व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक अनुपात स्तंभ का चयन करें और> सशर्त स्वरूपण> हाइलाइट कोशिकाओं नियमों द्वारा पीछा किया, होम टैब पर अधिक नियमों क्लिक करें.
  6. चयन शैली 'क्लासिक'. 'सेल' मूल्य होते हैं कि प्रारूप केवल कोशिकाओं, 'इससे ​​बड़ा या इसके बराबर'. बॉक्स, 1.96 मानक विचलन मूल्य में टाइप करें, और 'ओके' पर क्लिक करें.
  7. प्रत्येक के लिए सकारात्मक बातचीत के लिए अनुपात परिवर्तनशीलता का आकलन करें. % वर घटाकर हैंiability एक सीमा मूल्य से नीचे 'हिट' छोड़ जाएगा, इस सावधानी के साथ व्यवहार किया जाना चाहिए.
    नोट: यह एक साथ एक प्रोटीन 'SILAC अनुपात को बनाने वाली प्रत्येक पेप्टाइड के लिए व्यक्तिगत अनुपात हैं कैसे संगत का प्रतिनिधित्व करता है, और एक प्रतिशत के रूप में दिया जाता है. अनुपात परिवर्तनशीलता को ध्यान में रखा और एक प्रोटीन सीमा से ऊपर एक SILAC अनुपात देता है, जब इस प्रोटीन के एक हिट का प्रतिनिधित्व करता है. अनुपात परिवर्तनशीलता सीमा से नीचे गिर जाता है कि एक सीमा देता है, 'हिट' एक contaminant प्रतिनिधित्व कर सकते हैं.
  8. परिणाम स्तंभों में से प्रत्येक के लिए इस दोहराएँ और प्रयोगों भर की तुलना करें. दो या दो से अधिक प्रयोगों में पहचान पर प्रकाश डाला प्रोटीन एक उच्च आत्मविश्वास बातचीत का प्रतिनिधित्व करते हैं.
    नोट: अलग प्रयोगों में एक प्रोटीन एक अलग, या यहां तक ​​कि कई परिग्रहण संख्या के तहत पहचान की गई है हो सकता है, प्रोटीन परिग्रहण संख्या आवंटित करने के लिए इस्तेमाल किया डेटाबेस पर निर्भर करता है. यह प्रोटीन गलती से लोप नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए इस की जांच जरूरी है.

Representative Results

एक ठेठ SILAC pulldown प्रयोग में, पहचान प्रोटीन (> 90%) के विशाल बहुमत contaminants के साथ ही आत्मीयता मैट्रिक्स को गैर विशेष रूप से बाध्यकारी प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करते हैं और धोने प्रोटोकॉल cytoplasmic contaminants के बहुमत को दूर भी जब यह, चित्रा 2B में सचित्र है ऐसे GAPDH (2A चित्रा) के रूप में. हालांकि, गैर विशेष रूप से एक सामान्य वितरण में प्रोटीन की बाइंडिंग क्लस्टरिंग विशेष रूप से इन के रूप में प्रतिष्ठित किया जा करने के लिए ब्याज की एक प्रोटीन के लिए बाध्य प्रोटीन है कि पृष्ठभूमि से अधिक नमूना / नकली अनुपात की अनुमति देता है. Contaminants को सैद्धांतिक रूप से 0 से प्रवेश 2 SILAC अनुपात के आसपास क्लस्टर चाहिए Whilst, यह जरूरी मामला नहीं है, इसका एक उदाहरण चित्रा 3 में दी गई है. इसके संभावित कारणों पर असमान मात्रा में या lysate के सांद्रता लोड हो रहा है, कोशिकाओं के अपूर्ण SILAC लेबलिंग शामिल विरोधी GFP मोती, शुद्धि या असमान मिश्रण के दौरान मोतियों की आकस्मिक नुकसानशुद्धिकरण प्रक्रिया 3 के अंत में नमूनों की आईएनजी. हालांकि, यह सोचते डेटा सामान्य रूप से वितरित contaminants के माध्य से एक सीमा मानक विचलन के आधार पर विश्लेषण कर रहे हैं, डेटा के एकत्रित में मामूली बदलाव के परिणामों की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं होना चाहिए.

दो संबंधित प्रोटीन के बीच बातचीत प्रोटीन में मतभेद की तुलना करते समय ब्याज की एक प्रोटीन (या तो कारण अभिकर्मक दक्षता में परिवर्तन, या प्रोटीन या mRNA की एक आंतरिक गुण के लिए) एक दूसरे से कोशिकाओं के भीतर उच्च स्तर पर उत्पादन किया जाता है जहां, एक इसी तरह की स्थिति उत्पन्न हो सकती है . कुछ अभिव्यक्ति में परिवर्तन (जैसे, चित्रा 2A) इन दो नमूने लिए SILAC अनुपात का विश्लेषण करके के लिए सुधारा जा सकता है. इस उदाहरण में इन GFP-eIF4AI और GFP eIF4AII नमूने होगा. धारा 7 में चर्चा के रूप में 4AI/4AII SILAC अनुपात का विश्लेषण करके, यह जिसका बाध्यकारी isoforms के बीच काफी भिन्न होता है प्रोटीन की पहचान करने के लिए संभव है.

चित्रा 4 में वर्ग = "jove_content">, आयोजित प्रतिकृति प्रयोगों में से एक में पहचान eIF4A बाध्यकारी प्रोटीन का प्रतिनिधित्व इस प्रोटोकॉल हासिल की दीक्षा कारक परिसर के कवरेज illustrating दिखाया गया है. उच्चतम अनुपात आम तौर पर दूर eIF4A बाध्यकारी साइट से एक साइट पर eIF4G को बांधता है जो eIF4E, के लिए कम अनुपात के साथ, eIF4A के लिए सीधे बांध जो eIF4G, साथ मनाया गया. लोअर अनुपात eIF3 परिसर के सदस्यों के लिए मनाया गया. हालांकि, यह स्पष्ट रूप से प्रयोग संतोषजनक ढंग eIF4AI और द्वितीय के प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष दोनों बंधन भागीदारों की पहचान की है कि दिखाता है. उनके उच्च अनुक्रम पहचान 6, से उम्मीद की जा सकती है के रूप में प्रोटीन: प्रोटीन बातचीत काफी हद तक इस प्रायोगिक प्रणाली 7, 8 में दो isoforms के बीच संरक्षित दिखाई दिया. बातचीत के दौरान प्रोटीन के कुछ का डेटा स्वरूप illustrating, 2 टेबल में दिए गए हैं.

स्तंभ शीर्ष विवरण
परिग्रहण दृश्य के लिए परिग्रहण संख्या प्रदर्शित करता है
कवरेज पहचान पेप्टाइड्स द्वारा कवर प्रोटीन अनुक्रम के अनुपात
♯ पी एस एम पेप्टाइड वर्णक्रमीय मैच
पेप्टाइड्स ♯ एक प्रोटीन के लिए पहचान की अनूठी पेप्टाइड्स की कुल संख्या
♯ आस अमीनो एसिड में एक प्रोटीन की लंबाई
मेगावाट (डीए) Daltons में एक प्रोटीन की आणविक भार. संशोधनों को शामिल नहीं
Calc. गड़बड़ी एक प्रोटीन की सैद्धांतिक isoelectric बिंदु
स्कोर व्यक्ति की राशि का प्रतिनिधित्व करता है जो एक प्रोटीन (कुल स्कोरidual पेप्टाइड स्कोर). महत्व के लिए आवश्यक सटीक स्कोर प्रयोगों के बीच अलग अलग होंगे. एक MS सुविधा आमतौर पर एक 5% झूठे खोज दर कटऑफ लागू होगी.
अनुक्रम प्रोटीन का गठन अमीनो एसिड के अनुक्रम
अनुपात एक दूसरे लेबल नमूना की तुलना में एक नामित लेबल नमूना में पेप्टाइड्स के रिश्तेदार तीव्रता,
अनुपात गणना किसी दिए गए प्रोटीन अनुपात की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि पेप्टाइड अनुपात की संख्या
अनुपात परिवर्तनशीलता (%) किसी दिए गए प्रोटीन अनुपात की गणना करने के लिए इस्तेमाल व्यक्तिगत पेप्टाइड अनुपात की परिवर्तनशीलता
विवरण प्रोटीन का नाम

तालिका 1. एक के proteome जांच रिपोर्ट से मानक स्तंभ शीर्ष.उपयोगी जानकारी इन स्तंभों में से सब से प्राप्त किया जा सकता है, whilst इस विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण उन बोल्ड में दिखाया गया.

परिग्रहण पेप्टाइड्स 4AI/Mock 4AII/Mock नाम SILAC विश्लेषण
A8K7F6 21 100 1 eIF4AI 'चारा' प्रोटीन
Q14240 22 0.01 90.855 eIF4AII
G5E9S1 25 47.575 30.53 eIF4GI प्रोटीन बातचीत
Q59GJ0 5 11.778 10.619 eIF4GII60;
P06730 3 7.22 7.57 eIF4E
Q5T6W5 4 0.685 0.646 hnRNPK गैर विशेष रूप से बाध्यकारी contaminants
P62805 1 0.531 0.498 Histone H4
H6VRG2 18 - - केरातिन 1 पर्यावरण contaminants
P35527 11 0.01 0.01 केरातिन, 1 cytoskeletal 9

तालिका 2. एक SILAC immunoprecipitation प्रयोग से विशिष्ट डेटा. ब्याज / चारा के एक प्रोटीन के लिए उदाहरण डेटा देने (उच्च पेप्टाइड्स, उच्च अनुपात), ब्याज (उच्च / कम पेप्टाइड्स, उच्च अनुपात) के एक प्रोटीन के साथ बातचीत के दौरान प्रोटीन, गैर विशेष रूप से बाध्यकारी प्रोटीन (उच्च / कम पेप्टाइड्स) इस प्रयोग 0.96 में, और पर्यावरण contaminants (अक्सर उच्च पेप्टाइड्स, सीमा से नीचे नकारात्मक अनुपात /) - इडस, अनुपात कटऑफ नीचे गिर जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रायोगिक योजना. सबसे पहले कोशिकाओं 2 सप्ताह के लिए arginine और लाइसिन की कमी मीडिया में वृद्धि हुई है और स्थिर आइसोटोप लेबल arginine और लाइसिन साथ प्रतिस्थापित कर रहे हैं (1). (2) कक्ष 10 2 सेमी बर्तन में वरीयता प्राप्त और क्षणिक (नमूने) (नकली) या GFP संलयन प्रोटीन GFP एन्कोडिंग plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं. (3) कोशिकाओं lysed रहे हैं और GFP या GFP संलयन प्रोटीन कोशिका lysates से immunoprecipitated रहे हैं. (4) नमूने एक 1:1 के अनुपात में संयुक्त और LC-MS/MS विश्लेषण के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. डाटा तो कम आत्मविश्वास प्रोटीन अध्यक्ष को हटाने के लिए विश्लेषण किया हैifications और वास्तविक बातचीत प्रोटीन को इसी प्रोटीन संवर्धन का एक स्तर का चयन करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. उपयुक्त immunoprecipitation की स्थिति की पुष्टि. ए) सेल lysates के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण, साथ ही immunoprecipitation से अबाध और बाध्य भिन्न अभिव्यक्ति और ब्याज की प्रोटीन की immunoprecipitation की पुष्टि करता है. GAPDH के खिलाफ एक पश्चिमी धब्बा, eIF4A की एक ज्ञात बातचीत साथी ब्याज की एक प्रोटीन की बातचीत के भागीदारों से नहीं जाना जाता कहां ब्याज. बी का प्रोटीन) के लिए बाध्य प्रोटीन की सफल immunoprecipitation की पुष्टि गैर बातचीत प्रोटीन और एक और वेस्टर्न ब्लॉट की कमी की पुष्टि एक चांदी से सना हुआ जेल बातचीत प्रोटीन की immunoprecipitation पुष्टि कर सकते हैं. इस चांदी पर दाग GFP और GFP-eIF4AI/II के लिए एड जेल बैंड स्पष्ट कर रहे हैं, और eIF4G के लिए सही आकार में पलायन एक बैंड केवल GFP-4AI/II-bound गलियों में और नहीं GFP नियंत्रण लेन में मौजूद है.

चित्रा 3
चित्रा 3. प्रतिनिधि परिणाम है. हिस्टोग्राम (ए) GFP-eIF4AI या (बी) GFP-eIF4AII pulldown के एक दोहराने से प्रोटीन के अनुपात का वितरण दिखा. 1.96 मानक विचलन कटऑफ एक धराशायी लाइन के साथ चिह्नित है. सामान्य रूप से वितरित contaminants बाहर गिरने बातचीत प्रोटीन (बी) में ~ 0.25 और 1 (ए) में, और ~ 0.3-1.5 से स्पष्ट कर रहे हैं.

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चित्रा 4. एक SILAC आईपी प्रयोग की एक एकल प्रतिकृति से EIF जटिल सदस्यों की पहचान. प्रोटीन हरे रंग में प्रोटीन बातचीत pulldown के लिए इस्तेमाल किया ब्याज की प्रोटीन थे लाल के साथ SILAC आईपी में 2 SILAC अनुपात लॉग इन करने के लिए सफेद अनुसार लाल से छायांकित हैं विश्लेषण में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की जा रही है, और सफेद 1.96 एसडी कटऑफ जा रहा है. ग्रे में छायांकित प्रोटीन इस विश्लेषण में पहचान नहीं कर रहे थे.

Discussion

यहाँ वर्णित SILAC pulldown रणनीति उपन्यास प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक बहुत ही संवेदनशील और शक्तिशाली साधन का प्रतिनिधित्व करता है: प्रोटीन बातचीत है, और इसके अलावा ब्याज की बारीकी से संबंधित नमूनों के बीच बदल बाध्यकारी पैटर्न के तेजी से और सरल भेदभाव की अनुमति देता है. EIF4AI और eIF4AII प्रोटीन 6 के प्रोटीन बातचीत: इस उदाहरण में इस तकनीक प्रोटीन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. लेखक का ज्ञान करने के लिए, इस eIF4A के इन दो isoforms की सेलुलर interactome जांच करने के लिए SILAC प्रोटिओमिक्स की उपयोगिता का शोषण साहित्य में पहला अध्ययन है.

जैसा कि ऊपर वर्णित दृष्टिकोण एक GFP टैग और विरोधी GFP मोती 9, 10 और इसलिए संशोधनों टैग एन या कम रखा गया है कि क्या उदाहरण के लिए ब्याज की एक विशिष्ट प्रोटीन, के लिए प्रयोग की जाने वाली इस दृष्टिकोण सक्षम करने के लिए आवश्यक हो सकता है का उपयोग करता है एक प्रोटीन की सी टर्मिनस. जहां संभव हो, पश्चिमी blots या कार्यात्मक assays चाहिएएक ज्ञात प्रोटीन बातचीत साथी के बंधन का पता लगाने के लिए किया जा. एक प्रोटीन एक GFP टैग, अन्य टैगिंग या pulldown रणनीतियों के साथ फ्यूजन बर्दाश्त नहीं करना चाहिए अन्य टैग का उपयोग कर दोनों SILAC pulldowns के लिए लागू किया गया है (फ्लैग 11, बायोटिन 12, strep (स्वयं के डेटा, अप्रकाशित)), या एक प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके ब्याज का लक्ष्य प्रोटीन की siRNA पछाड़ना एक नियंत्रण नमूना 13 प्रदान करता है. इस तरह के प्रयोगों साहित्य में कहीं वर्णित किया गया है, लेकिन संक्षेप में, चरण 1 और कदम 5.4-8 में वर्णित के रूप में बराबर प्रोटीन जानकारी का उपयोग कर चुनाव की अभिव्यक्ति / pulldown सिस्टम के लिए उपयुक्त के रूप में संशोधित कदम 2-5.3 साथ, ऊपर के रूप में लागू किया जाएगा 2.4-2.5 कदम. मात्रा का ठहराव चरणों गैर विशिष्ट बंधनकारी प्रोटीन विश्लेषण स्तर पर हटाया जा करने की अनुमति के रूप में, यह कम आत्मीयता प्रोटीन की रक्षा करने के क्रम में नियंत्रण मोती, या उच्च नमक washes के साथ पूर्व ऊष्मायन चूकना की सिफारिश की है: ब्याज की एक प्रोटीन के साथ प्रोटीन बातचीत . एक nuclease माY शामिल है या एक विशेष रूप से प्रयोग की बारीकियों के अनुसार इस प्रोटोकॉल से लोप हो. उदाहरण के लिए: इस विधि में इस्तेमाल किया प्रोटीन शाही सेना helicases हैं, RNase कॉकटेल शाही सेना (3.2 कदम) के माध्यम से मध्यस्थता अप्रत्यक्ष बातचीत को दूर करने के लिए प्रोटोकॉल में शामिल किया गया था. कुछ मामलों में हालांकि, न्यूक्लिक एसिड निर्भर बातचीत की पहचान करने के लिए nuclease साथ और बिना समानांतर प्रयोगों चलने से वहाँ लाभ हो सकता है.

इस प्रोटोकॉल के भीतर, 'मध्यम' और दोहराने के प्रयोगों में 'भारी' नमूने की स्विचिंग SILAC मीडिया या सेल के विकास में अंतर से शुरू की भिन्नता के लिए नियंत्रित करने के लिए सिफारिश की है. एक वैकल्पिक नियंत्रण प्रतिकृति प्रयोगों में सभी तीन ('प्रकाश', 'मध्यम', और 'भारी') मीडिया की अनुक्रमिक स्विचिंग शामिल है. इस दृष्टिकोण संभवतः और अधिक कठोर है जबकि, यह कम से कम एक दोहराने, ब्याज की एक प्रोटीन w में के रूप में, विश्लेषण की जटिलता में वृद्धि करता हैबीमार 'प्रकाश' लेबल की कोशिकाओं में उत्पादित किया और इसलिए यह लगातार 'प्रकाश' नमूने (जैसे keratins के रूप में पर्यावरण contaminants), और एक प्रोटीन के लिए बाध्य है जब केवल 'प्रकाश' नमूने में समृद्ध कर रहे हैं कि उन में पहचान प्रोटीन के बीच भेद करने के लिए आवश्यक है ब्याज.

मात्रा का ठहराव डेटा का उपयोग की अनुमति देता Whilst एक सीमा के उपयोग के माध्यम से विशिष्ट से गैर विशिष्ट बातचीत की भेदभाव, अनिवार्य रूप से कुछ वास्तविक बातचीत से खारिज किया जा सकता है. ऊपर दृष्टिकोण प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक सरल और तेजी से दृष्टिकोण है: आसानी से नहीं पिछले मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ अनुभव, या बड़े प्रोटीन के विश्लेषण के साथ शोधकर्ताओं द्वारा प्रयास किया जा सकता है कि प्रोटीन बातचीत: प्रोटीन बातचीत डेटासेट. सबसे उपयोगों के लिए इस ब्याज का उपन्यास प्रोटीन की पहचान करने के लिए पर्याप्त से अधिक है. इस डेटा नुकसान को कम करने में मदद करने के लिए इस दृष्टिकोण को आगे संशोधन कहीं और साहित्य में वर्णित है और एक पीआर के उपयोग में शामिल कर रहे हैंप्रयोगात्मक मानकों (सेल लाइन, मनका मैट्रिक्स, बफर शर्तें) की एक विशेष सेट के लिए संदूषक प्रोटीन में जाना जाता है, जहां otein आवृत्ति पुस्तकालय 10, 14 को बाहर रखा जा सकता है. हालांकि, विशेष प्रयोगात्मक मापदंडों के आधार पर यह एक मनका proteome उत्पन्न करने के लिए नियंत्रण प्रयोगों की एक संख्या को चलाने के लिए आवश्यक हो सकता है और यह इसलिए प्रयोग के खर्च और जटिलता दोनों को बढ़ा सकते हैं. इस तकनीक पर अधिक जानकारी www.peptracker.co.uk वेबसाइट 14 से उपलब्ध है.

यह भी प्रोटोकॉल (- मानचित्र SILAC प्रयोग शुद्धि के बाद एक मिश्रण कहा जाता है) immunoprecipitation प्रक्रिया के अंत में अलग लेबल के नमूने शामिल मिश्रण से ऊपर वर्णित है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इस प्रोटीन के रूप में किया जाता है: प्रोटीन बातचीत एक दिया संतुलन 15 पर होते हैं. यह अन्य समूहों के नमूनों की ऊष्मायन के साथ इस प्रोटोकॉल में वर्णित इस नक्शे SILAC दृष्टिकोण संयुक्त है कि ध्यान दिया जाना चाहिएपूर्व pulldown (मिश्रण के बाद शुद्धि - PAM SILAC) को समय के विभिन्न लंबाई के लिए 15, 16 (2 घंटे 20 मिनट साहित्य में इस्तेमाल किया गया है). एक प्रोटीन अनुपात 1:1 की ओर चला जाता है कैसे तेजी के आधार पर यह गुणात्मक बंधन समानताएं जांच करने के लिए और स्थिर या गतिशील बातचीत प्रोटीन के रूप में 15 प्रोटीन को परिभाषित करने के लिए संभव है.

संक्षेप में, SILAC pulldowns एक physiologically प्रासंगिक सेटिंग में, ब्याज की दी प्रोटीन के साथ बातचीत प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली साधन का प्रतिनिधित्व करते हैं. तकनीक बहुत आसानी से ब्याज की किसी भी प्रोटीन के लिए अपने आवेदन की अनुमति, अलग शुद्धि रणनीतियों के एक नंबर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. परिणामों की मात्रा बेहद वास्तविक बातचीत की पहचान सरल और गैर विशिष्ट बाँधने को दूर किया कड़े बफर शर्तों में छूट परमिट, और इस प्रकार कम संबंध में बातचीत को बरकरार रखता है. तीन नमूने ऊपर में तुलना की जा सकती हैंरणनीति, तकनीक अलग प्रोटीन isoforms, उत्परिवर्ती प्रोटीन, या औषधीय inhibitors के प्रभाव के बीच बाध्यकारी प्रोटीन में मतभेद की तुलना में स्पष्ट ताकत है. पूरे जेल स्लाइस बल्कि उस Coomassie से दाग व्यक्ति बैंड से विश्लेषण कर रहे हैं के रूप में, उच्च आत्मविश्वास में पहचान प्रोटीन की संख्या आमतौर पर एक मानक जीएसटी / नल pulldown में पहचान की तुलना में अधिक है, और ब्याज की प्रोटीन निकाल दिया जाता है के चयन में पक्षपात प्रयोगकर्ता. तकनीक इसलिए उपन्यास प्रोटीन बातचीत (खमीर 2 संकर, जीएसटी / उसकी या नल pulldowns) के इस्तेमाल में पहचान अन्य आमतौर पर इस्तेमाल की तकनीक के साथ बहुत कृपापूर्वक तुलना करती है.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम के पुलिस महानिरीक्षक को वेलकम ट्रस्ट और बीबीएसआरसी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. आईजी वेलकम वरिष्ठ फैलो हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium  (DMEM) Dundee Cell Products LM010 DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine)
Dialysed FBS (10 kDa cutoff) 500 ml Dundee Cell Products DS1003
Arginine (R0) 25 g Sigma-Aldrich A8094 Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock)
Arginine (R6) 0.5 g Cambridge Isotope Labs CLM-2265 Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock)
Arginine (R10) 0.5 g Cambridge Isotope Labs CNLM-539 Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock)
Lysine (K0) 25 g Sigma-Aldrich L8662 Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock)
Lysine (K4) 0.5 g Cambridge Isotope Labs DLM-2640 Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock)
Lysine (K8) 0.5 g Cambridge Isotope Labs CNLM-291 Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock)
Penicillin/streptomycin, Liquid. 100 ml Gibco 15140-122
Lipofectamine 2000 transfection reagent Invitrogen 11668-027
GFP-trap Agarose (500 μl resin) Chromotek gta-20
5x SDS Sample loading buffer Fisher Scientific PN39000 The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination.
Protease inhibitor cocktail set III Calbiochem 539134
1.7 ml prelubricated tubes Costar 3207
BCA protein assay kit (1 L) Pierce 23225
Tris (Trizma) Sigma-Aldrich T1503
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E6758
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Rnase cocktail Ambion AM2286
NP-40 alternative Millipore 492016

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References

  1. Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. Protein-protein interactions. Biochem Soc Trans. 38, 875-878 (2010).
  2. Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), (2012).
  3. Trinkle-Mulcahy, L. Resolving protein interactions and complexes by affinity purification followed by label-based quantitative mass spectrometry. Proteomics. 12, 1623-1638 (2012).
  4. Emmott, E., et al. The cellular interactome of the coronavirus infectious bronchitis virus nucleocapsid protein and functional implications for virus biology. J Virol. 87, 9486-9500 (2013).
  5. Li, W., Belsham, G. J., Proud, C. G. Eukaryotic initiation factors 4A (eIF4A) and 4G (eIF4G) mutually interact in a 1:1 ratio in vivo. J Biol Chem. 276, 29111-29115 (2001).
  6. Nielsen, P. J., Trachsel, H. The mouse protein synthesis initiation factor 4A gene family includes two related functional genes which are differentially expressed. EMBO J. 7, 2097-2105 (1988).
  7. Galicia-Vazquez, G., Cencic, R., Robert, F., Agenor, A. Q., Pelletier, J. A cellular response linking eIF4AI activity to eIF4AII transcription. RNA. 18, 1373-1384 (2012).
  8. Zakowicz, H., et al. Mutational analysis of the DEAD-box RNA helicase eIF4AII characterizes its interaction with transformation suppressor Pdcd4 and eIF4GI. RNA. 11, 261-274 (2005).
  9. Rothbauer, U., et al. A versatile nanotrap for biochemical and functional studies with fluorescent fusion proteins. Mol Cell Proteomics. 7, 282-289 (2008).
  10. Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
  11. Dobreva, I., Fielding, A., Foster, L. J., Dedhar, S. Mapping the integrin-linked kinase interactome using SILAC. J Proteome Res. 7, 1740-1749 (2008).
  12. Mittler, G., Butter, F., Mann, M. A SILAC-based DNA protein interaction screen that identifies candidate binding proteins to functional DNA elements. Genome research. 19, 284-293 (2009).
  13. Selbach, M., Mann, M. Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown QUICK. Nat Methods. 3, 981-983 (2006).
  14. Boulon, S., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9, 861-879 (2010).
  15. Wang, X., Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7, 46-57 (2008).
  16. Fang, L., et al. Characterization of the human COP9 signalosome complex using affinity purification and mass spectrometry. J Proteome Res. 7, 4914-4925 (2008).

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Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics. J. Vis. Exp. (89), e51656, doi:10.3791/51656 (2014).

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