SILAC免疫实验指用于发现新蛋白的有力手段:蛋白质相互作用。通过使蛋白质丰度的控制和测试样品,真相互作用的精确相对定量可以很容易地从实验的污染物区分开来,并且低亲和力相互作用,通过使用较少的严格的缓冲条件下保存。
定量蛋白质组学结合免疫亲和纯化,SILAC免疫沉淀,代表了新型蛋白质的发现的有力手段:蛋白质相互作用。通过使蛋白质丰度的控制和测试样品中的准确的相对定量,真相互作用可容易地从实验的污染物区分开来。低亲和力相互作用可以通过使用不太严格的缓冲液条件予以保留,并保持易于识别。这个协议讨论的组织培养细胞与亲和稳定同位素标记的氨基酸,转染和免疫沉淀的标签标记的蛋白质的兴趣,其次是制备以提交质谱设施。该协议随后将讨论如何分析和解释从质谱仪,以确定细胞伙伴感兴趣的蛋白相互作用返回的数据。作为一个例子该技术被应用到鉴定者TIFY蛋白结合到真核细胞翻译起始因子:eIF4AI和eIF4AII。
在了解蛋白质功能的一个重要步骤是识别相关的蛋白质相互作用的。如该蛋白是未知有许多技术可用,每个都有自己的优点和缺点。这些包括酵母双杂交系统中,使用重组蛋白的下拉测定法,以及串联亲和纯化或TAP-标记1,2。
更近期除了这些技术是目的蛋白质的亲和纯化的自相关的哺乳动物细胞系的结合,随后定量质谱法使用的氨基酸稳定同位素标记的细胞培养(SILAC)3。这个拥有在细胞中的定位和翻译后修饰的酵母双杂交方法的优点是不被干扰,以及超过传统优势TAP-标签,因为它是一个定量而非定性的方法,允许用户意图dily区分非特异性相互作用的蛋白质和污染物,从特异性结合宿主因素。此外,作为一个示例,通常分析的整体,而不是作为单独的蛋白质条带,感兴趣的蛋白质没有通过类似地迁移的蛋白质在凝胶上,它们也不是通常需要存在于足够水平的染色后是可见的,从而屏蔽自信地鉴定蛋白质4的数量增加。
为了演示这种技术,与之密切相关的真核翻译起始因子的GFP融合eIF4AI和eIF4AII的份额超过90%的氨基酸同一性被SILAC-免疫定量蛋白质组学研究。人类eIF4AI和II分别克隆到pEGFP-C1,以形成其中的GFP融合到eIF4A的N-末端的融合蛋白。为了避免需要用于产生稳定细胞系的瞬时转染来提供这些构建以稳定同位素标记的293T细胞。
<p class=“jove_content”>细胞第一标记为两周SILAC细胞培养基中,随后的质粒DNA编码目的蛋白的转染。然后将细胞裂解,蛋白浓度归一化,裂解液和亲和力的等量纯化的抗GFP琼脂糖。然后洗出液等量混合,并提交LC-MS/MS分析。这个分析的结果然后被处理以识别高置信蛋白:蛋白相互作用( 图1)。SILAC免疫沉淀使之不仅直接相互作用也低亲和力或蛋白质复合物4间接的相互作用的鉴定。使用这个系统,eIF4AI和Ⅱ免疫沉淀使重现性好,有信心识别的主要结合伴侣eIF4G(异构体的I / II和III)5,以及与eIF4E的间接的相互作用,以及eIF3复合体的许多组件。
这里所描述的SILAC下拉战略是一个非常敏感和强大的新型检测手段的蛋白质:蛋白质相互作用,进而允许改变的结合模式的利益密切相关的样本之间的快速和简单的歧视。在这个例子中该技术被用来研究蛋白质:该eIF4AI和eIF4AII蛋白6蛋白的相互作用。据作者所知,这是文献利用SILAC蛋白质组学的效用研究eIF4A这两种亚型的细胞相互作用组的第一个研究。
如上面所描述的方法使用GFP-标记和抗GFP珠9,10,因此,可能需要修改以使这种方法可用于感兴趣的特定蛋白质,例如该标记是否被放置在N-或C-末端的蛋白质。如果可能的话,蛋白质印迹或功能试验应被执行以检测已知蛋白质相互作用伴侣的结合。应的蛋白不耐受融合与GFP标记,其它的标记或下拉策略已经被同时使用其它标记施加到SILAC下拉(FLAG 11,生物素12,链球菌(自己的数据,未发表)),或者通过使用第一抗体与蛋白的兴趣,其中siRNA敲除靶蛋白提供了一个控制样品13。这样的实验已经在文献中其它地方进行了描述,但简单地说,步骤1和步骤5.4-8将如上适用,步骤2-5.3修改以适合所选择的使用等于蛋白质输入中所描述的表达/下拉系统步骤2.4-2.5。作为量化阶段允许非特异性结合的蛋白,以在分析级被移除时,建议以省略预温育与对照珠,或高盐冲洗,以保持低亲和力的蛋白质:蛋白质相互作用与感兴趣的蛋白。核酸酶马为y包含或根据特定实验的具体细节在此省略了协议。例如:在本方法中使用的蛋白是RNA解旋酶,RNA酶鸡尾酒被列入协议,除去通过核糖核酸(步骤3.2)介导的间接的相互作用。在某些情况下,但是,也可以受益于并行运行试验有和无核酸酶的识别核酸依赖的相互作用。
在这个协议中,“中”和在重复实验“重”样品的交换建议控制为变异通过在SILAC培养基或细胞生长的差异引入。另一种控制涉及所有三个('光','中'和'重')媒体复制实验的顺序切换。虽然这种方法有其潜在的更为严格,但它增加了分析的复杂性,因为在至少一个重复,目的蛋白质瓦特生病产生的“光”标记的细胞,所以它是必要的'轻'的样品(环境污染物如角蛋白),以及那些当绑定到一种蛋白质,只是丰富了“光”的样品在一贯的蛋白质鉴定区分兴趣。
而使用量化数据的允许特定的非特异性相互作用,通过使用阈值判别,难免有些真正的相互作用可能被丢弃。上面的方法是一种简单,快速的方法来识别蛋白质:蛋白质相互作用,可以由研究人员没有以往的经验与质谱,或大蛋白的分析可以很容易地尝试:蛋白质相互作用数据集。对于大多数的用途,这是绰绰有余的识别感兴趣的新蛋白质。进一步的修改,以这种方式来帮助减少这种数据丢失,在文献中其它地方描述的,并且包括使用PR的其中对于特定的一组实验参数(细胞株,胎圈基质,缓冲液条件)已知污染蛋白质otein频率文库可以被排除10,14。然而,这取决于具体的实验参数,可能需要执行一系列的控制实验来产生珠蛋白组,因此,这样可以提高实验的两个的费用和复杂性。可从www.peptracker.co.uk网站14上这一技术的进一步信息。
还应当指出的是,协议上述涉及混合不同地标记的样品在免疫过程结束(称为混合纯化后 – MAP SILAC实验)。这样做是因为蛋白质:蛋白质相互作用发生在一给定的平衡15。但应注意的是,其他团体已经联合在该协议与样品孵育描述这张地图SILAC方法前向下拉(纯化后混合- PAM SILAC),用于不同的时间长度(20分钟至2小时,已在文献中使用)15,16。根据如何迅速的蛋白质比下降朝向1:1,因此能够定性地调查的结合亲和力,并确定蛋白质作为稳定的或动态的相互作用蛋白15。
总之,SILAC下拉代表一个非常强大的识别蛋白与感兴趣的特定蛋白质相互作用,在生理学相关的设定的装置。该技术可以很容易地适用于许多不同的纯化策略,允许其应用到感兴趣的任何给定的蛋白质。结果的量化大大简化了识别真正的相互作用,并且允许使用以除去非特异性结合严格缓冲液条件放松,从而保持低亲和力相互作用。如最多三个样品可以在上面进行比较策略,该技术具有在比较中蛋白质的差异不同蛋白同种型,突变体蛋白,或药理学抑制剂的效果之间的结合清楚的长处。作为整个凝胶切片进行了分析,而不是单个波段即污点通过考马斯,确定在高置信度的蛋白质的数量通常比那些在一个标准的GST / TAP-下拉确定更高,实验者偏压在选择感兴趣的蛋白被删除。该技术因此相比,毫不逊色与鉴定新的蛋白质相互作用(酵母双杂交,GST /他或TAP下拉)使用其他常用的技巧。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由赠款从威康信托基金会和BBSRC到IG的支持。中空玻璃是一种惠康高级研究员。
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |