Summary
SILAC Immunutfällningsexperiment utgör ett kraftfullt medel för att upptäcka nytt protein: protein interaktioner. Genom att låta den exakta relativa kvantifiering av protein överflöd i både kontroll-och testprover, sanna växelverkan lätt kan skiljas från experimentella föroreningar, och låg affinitet interaktioner bevaras genom användning av mindre stränga buffertförhållanden.
Abstract
Kvantitativa proteomik i kombination med immunaffinitetsrening, SILAC immunoprecipitation, utgör ett kraftfullt medel för upptäckten av nytt protein: protein interaktioner. Genom att låta den exakta relativa kvantifiering av protein överflöd i både kontroll-och testprover, kan sanna växelverkan lätt kan skiljas från experimentella föroreningar. Låg affinitet interaktioner kan bevaras genom användning av mindre stringenta buffertbetingelser och vara lätt identifierbara. Detta protokoll diskuterar märkning av vävnadsodlingsceller med stabila isotopmärkta aminosyror, transfektion och immunfällning av en affinitet taggade protein av intresse, följt av förberedelser för att överlämnas till en mass anläggning spektrometri. Detta protokoll diskuterar sedan hur man kan analysera och tolka data som returneras från masspektrometer för att identifiera cellulära samarbetspartners interagerar med ett protein av intresse. Som ett exempel av denna teknik appliceras på identifiera proteiner som binder till de eukaryota translationsinitierings faktorer: eIF4AI och eIF4AII.
Introduction
Ett viktigt steg i att förstå proteiners funktion är att identifiera relevanta interagerande proteiner. Om sådana proteiner är okända finns det ett antal tekniker tillgängliga, alla med sina egna förtjänster och nackdelar. Dessa inkluderar jäst två-hybridsystemet, neddragsvideokällor analyser med hjälp av rekombinant protein, samt tandem affinitetsrening eller TAP-märkning 1, 2.
Ett nyare Utöver dessa tekniker är en kombination av affinitetsrening av ett protein av intresse från en relevant cellinje från däggdjur, följt av kvantitativ masspektrometri med användning av stabil isotopmärkning av aminosyror i cellkultur (SILAC) 3. Detta har fördelar över jäst-två-hybridansats i den cellen lokaliseringen och posttranslationella modifieringar inte störs, såväl som fördelar jämfört med traditionella TAP märkning i det att den är en kvantitativ snarare än kvalitativ metod så att användaren kan reaDily skilja ospecifikt interagerande proteiner och föroreningar, från värdfaktorer som binder specifikt. Vidare, som ett prov är normalt analyseras helhet, snarare än som enskilda proteinband, proteiner av intresse är inte maskeras av liknande sätt migrera proteiner på en gel, och inte heller behöver de oftast att närvara vid tillräckliga nivåer för att vara synliga efter färgning, vilket leder till ökat antal tryggt identifierade proteiner 4.
För att demonstrera denna teknik, GFP fusioner av den närbesläktade eukaryota translationsinitiering faktor eIF4AI och eIF4AII som andel över 90% aminosyraidentitet undersöktes genom SILAC-immunoprecipitation kvantitativa proteomik. Humant eIF4AI och II klonades in i pEGFP-C1 för att bilda ett fusionsprotein där GFP är fuserad till N-terminalen av eIF4A. För att undvika behovet av att generera stabila cellinjer transient transfektion användes för att avge dessa konstruktioner till stabila isotopmärkta 293T-celler.
(figur 1).
SILAC immunoprecipitation möjliggör identifiering av inte bara direkta interaktioner utan även låg affinitet eller indirekt interaktion med proteinkomplex 4. Med detta system eIF4AI och II immunoutfällningar tillåten reproducerbar och säker identifiering av den primära bindningspartnern eIF4G (isoformema I / II och III) 5, liksom indirekta interaktioner med eIF4E, och många komponenter i eIF3 komplex.
Protocol
1. Generering och Passaging av SILAC märkt cellinjer
Observera: användning av trypsin-EDTA måste undvikas i alla stadier av passaging och beredning av experimentella prover för analys som trypsin kan innehålla omärkta aminosyror, vilket skulle leda till ofullständig märkning av prover.
- För att framställa en flaska SILAC media lägga till en 0,5 ml alikvot av en lämpligt SILAC märkt arginin (84 mg / ml i PBS) och lysin (146 mg / ml i PBS) till en 500 ml flaska av Arg / Lys fritt DMEM (innehållande L-glutamin).
- Lägg sedan till 50 ml dialyserat FBS och 5 ml penicillin / streptomycin till 500 ml flaska.
Anm: HEK 293T-celler (ATCC) bör bibehållas i DMEM media som saknar arginin och lysin och kompletteras med ljus (R0K0), medium (R6K4) eller tunga (R10K8) aminosyror, dialyserat fetalt bovint serum (10 kDa gränsvärde) och penicillin / streptomycin. Celler måste upprätthållas i medium under minst fem celldelningar för att säkerställa fullständigmärkning. I de flesta fall celler lätt märks i ≥ 2 veckor. - För att dela upp celler för passaging, bör cellerna rubbas från monolager genom att slå kolven. Alternativ inkluderar användning av cellskrapor eller genom användning av enzymfri, PBS-baserad cell dissociationsbuffert.
OBS: För att spara medier, bör cellerna passe i T25-kolvar och större cell nummer genereras endast omedelbart före ett experiment. - 24 timmar före transfektera celler, frö 3,5 x 10 6 SILAC-märkta celler till en enda 10 cm 2 skålen för varje experimentell tillstånd under utredning.
2. Transfektion av märkta celler med pEGFP-fusionskonstruktioner
- Ta bort materialet från cellerna och ersätta den med 9 ml av antibiotikafria SILAC DMEM (Light, Medium och Heavy) media.
OBS: Antibiotika bör inte läggas till media eftersom de kan störa effektiviteten i liposombaserade transfektionsreagens. - Prepare en blandning av 10 | ig av den lämpliga plasmiden (epEGFP-C1, pEGFP-eIF4A-I, pEGFP-eIF4A-II) i 500 | il av antibiotikafritt SILAC DMEM och blanda den med 500 | il av antibiotikafritt SILAC DMEM innehållande 10 il av transfektionsreagens (t ex lipofektamin 2000). Blanda reaktionen noggrant genom att pipettera upp och ned flera gånger.
- Inkubera reaktionsblandningen vid rumstemperatur under 20 minuter och tillsätt sedan droppvis till cellmonoskiktet. Vicka plattan försiktigt från sida till sida.
- Inkubera de transfekterade cellerna vid 37 ° C och 10% CO2 under 24 timmar.
Obs: Om uttrycket av ett protein av intresse resulterar i någon uppenbar toxicitet, då kan det vara nödvändigt att minska mängden av plasmid transfekteras och / eller varaktigheten av efterföljande uttryck perioden.
3. Skörd cellysat
- Skörda cellerna från skålen in i iskall PBS med användning av en cellskrapa. Samla cellerna genom centrifugering vid 220 x g, 476; C under 5 min. Tvätta cellerna en ytterligare 3x i 10 ml iskall PBS.
- Resuspendera cellpelleten i 200 | il av cell-lys-buffert (10 mM TrisCl / pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5% NP40) innehållande färskt tillsatt proteas inhibitor cocktail III vid 1x koncentration och RNas cocktail (valfritt) vid 5 | il per ml.
Notera: För proteiner med kända nukleinsyra-bindningsaktivitet, kan det vara nödvändigt att lägga till nukleaser till lysatet före utfällning. I de fall där nukleas tillsättes bör proverna inkuberades på is under 30 min på is, med pipettering varje 10 min. Extrahering av total nukleinsyra från en liten del av provet och analys genom elektrofores på agarosgel kan testa effektiviteten av nukleas. - Centrifugera proverna vid 13000 x g, 4 ° C under 10 min behålla supernatanten såsom det lösliga cellysatet.
- Koncentrationen av cellysatet bör bedömas av BCA-analys i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Använd lysbuffert innehållande proteashämmare cocktail III att normalisera proteinkoncentrationen i en slutlig volym av 500 | il.
- Justera volymen till 1 ml med tillsats av 500 pl av spädningsbuffert (10 mM TrisCl / pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) innehållande proteashämmare cocktail III vid slut 1x koncentration. En 50 ul alikvot av provet bör behållas som provingång och lysatet hålls på is samtidigt förbereda anti-GFP pärlor (t.ex. GFP-fälla).
Anm: Normalt avkastningen varierar mellan 1 till 3,5 mg protein i finalen 1 ml prov. Även om ovanstående buffertar är lämpliga för många proteiner av intresse, för andra kan det vara nödvändigt att modifiera buffertkomponenter för att säkerställa att betesproteinet solubiliseras och att upprätthålla protein-proteininteraktioner. Möjliga förändringar inkluderar buffertmedlet (fosfat, HEPES), saltkoncentration (150-500 mM), valet av tvättmedel, eller andra tillsatser.
4. Bindning till Anti-GFP Pärlor
- Vortex kort pärlan slammet att resuspendera kulorna. Med hjälp av en 200 mikroliter pipettspets med änden avskuren, överför 25 | il pärlor per prov till ett nytt rör.
Obs: Användaren bör förbereda pärlorna för en enda SILAC experiment som mastermix att minimera prov-till-prov variation. - För varje 25 ul av vulst uppslamning, tillsätt 20 volymer (1500 | il per 75 pl uppslamning) i spädningsbuffert, och centrifugera pärlorna vid 2700 x g under 5 min. Därefter tvätta pärlorna ytterligare 2x i 20 volymer utspädningsbuffert.
- Tillsätt 100 l spädningsbuffert per 25 pl pärla slurry. Med användning av en 200 | il spets med änden avskuren, överföra 85 | il av detta återuppslammades uppslamningen till vardera av de SILAC märkta prover från steg 3,6.
- Inkubera proverna med pärlor på en rotator vid 4 ° C under 2 timmar.
5. Tvättning, Eluering och Beredning av prover för MS Analysis
- Centrifugera proverna vid 2700 xg, 46; C under 5 min. 50 | il av supernatanten bör bibehållas som den obundna provet, med återstoden av supernatanten kastades bort.
- 1 ml utspädningsbuffert bör läggas till varje rör för att återsuspendera pärlorna och provet centrifugeras vid 2700 x g, 4 ° C under 5 min. Supernatanten skall kasseras. Detta bör utföras två gånger.
- Eluera proteinet från kulorna genom tillsats av 50 pl av 2x SDS laddningsbuffert, och upphettning vid 95 ° C under 10 min. Pelle pärlorna genom centrifugering vid 2700 x g under 2 minuter vid 4 ° C
- Behåll supernatanten i insmorda rör, där den kan lagras därefter vid -80 ° C tills de behövdes. För överlämnande till en masspektrometri anläggning, blanda märkta prover 01:01:01 (t.ex. 10 l av vardera) och skicka in det blandade provet.
Observera: På denna punkt prover kan testas genom Western blot, silverfärgning eller andra medel för att testa för interaktion med kända / okända bindningspartners. Ett exempel ges i figurure 2 visar specifik bindning av en känd interaktion partner - eIF4G genom western blöt, och utseendet av silverfärgning banden närvarande i neddragsvideokällor prover från ett protein av intresse, men inte ett kontrollprov. - Skicka in prov för LC-MS/MS analys.
Obs: en gång övertygad om att ett taggat protein av intresse är framgångsrikt bindande interaktionspartners, lika volymer av varje märkt prov (lätt, medium och tunga) kombineras och lämnas in för LC-MS/MS analys. Det är vanligt att lämna in 30 | il totalt en IP-provet för analys. Detta skulle innebära att blanda 10 l av Light-märkt prov med 10 l av medel märkta och 10 pl tung-märkta prover för att ge en 30 l totalt.
6 Dataanalys I:. Förstå Resultat, och borttagning av låg förtroende identifieringar
OBS: En lista på kolumnrubrikerna returneras av Proteome Discoverer programvaran ges i tabell 1 Dif.ka program (t.ex. MSQuant, MaxQuant) returnerar olika rubriker, dock endast en delmängd av dessa krävs för analys och dessa är gemensamma för de olika programpaket. Data ska alltid innehålla ett referensnummer för varje protein identifierats, förhållandet är att jämföra varje prov förhållande (ljus vs medium, ljus vs tunga, medel vs tung etc.), antalet unika peptider identifieras, och någon form av falsk positiv eller förtroende indikation.
- Innan vi går igenom de uppgifter, först kopiera rådata till ett nytt kalkylblad. Från denna kalkyl bort alla kolumner utom de som ger numret, antal unika peptider, nyckeltal jämföra prover, ratio variabilitet och protein beskrivningen. Om replika experiment utfördes, bör dessa kombineras till en enda Excel-fil, med varje experiment visas på en separat flik.
OBS: Låg förtroende data innehåller proteiner identifieras av endast en enda unik peptid, och de whär kvantifiering var inte möjligt. - Använd Utmärker '"sort"-funktion för att beställa data med antalet peptider och ta bort posterna för proteiner som saknar mer än en peptid. Sedan sortera efter förhållandet och ta bort proteiner som saknar SILAC kvoter (icke kvantifierade proteiner).
- Konvertera SILAC förhållanden till en log 2 värden med formeln: "= log (SILAC Ratio, 2)", där "SILAC Ratio" ersätter cellidentifieraren.
Obs: Som SILAC feldosering ger några data för proteiner som visar en minskning i överflöd begränsas till värden mellan 0 och 1, är det vanligt att konvertera en SILAC förhållande till en logg 2 SILAC förhållande, eftersom detta innebär proteiner både ökas eller minskas i en provet finns representerade på en logaritmisk skala där 2 eller -2 representerar en 4-faldig ökning eller minskning i överflöd, och 3 eller -3 en 9-faldig ökning eller minskning i överflöd respektive. Efter denna omvandling, bör uppgifterna passa en Gaussian fördelning centrerad kring en log 2 SILAC förhållande av 0. Ett exempel på detta ges i figur 3. - Skapa nya kolumner i Excel-fil och beräkna log 2 SILAC nyckeltal för samtliga prov / håna kolumner. För omvandling av en mock / prov förhållande till ett prov / mock-förhållande, används formeln: "= 1/ratio"
7 Dataanalys II:. Välja högt förtroende Interaktioner för vidare studier
- Öppna Graphpad Prism, välj Ny> datatabell och graf ... Välj "kolumnen" i listan till vänster i fönstret och välj ENTER / Importera data> Ange replika värden, staplade i kolumner alternativ. Tryck på "Skapa".
- Markera och kopiera en given log 2 Sample / Mock SILAC förhållande kolumn från Excel-kalkylblad i den nya Prisma filen.
- Klicka på listrutan "Infoga"-menyn och välj "Ny analys". Under kolumnen analys väljer "Frekvensfördelning ". Att hålla standardalternativen klickar på "OK".
OBS: Detta steg skapar ett histogram som illustrerar antal proteiner som identifieras vid ett givet förhållande. Detta bör utgöra en normalfördelning. - I "Resultat"-mappen kommer att ha genererat en ny "Histogram" avsnittet. Välj avsnitt frekvensfördelning på.
- Klicka på listrutan "Infoga"-menyn och välj Ny analys> XY> Icke-linjär regression (kurvanpassning). Klicka på "normalfördelning" och klicka på OK.
OBS: Detta steg passar en kurva till distributionsfrekvens data som genereras i steg 7,3, vilket ger värden som sedan kan användas för att beräkna gränsvärden för betydelse. - I fönstret resultat som visas är medelvärdet och standardavvikelsen som följer. Generera en tröskel genom att tillsätta 1,96 standardavvikelser för medelvärdet.
Anm: Dessa värden representerar medelvärdet och standardavvikelser för Gauss distribution, inte den totala datasetet. 1.96 standardavvikelser skulle placera en tröskel vid konfidensintervallet 95% (p ≤ 0,05). 2,58 SD skulle ge 99% och 3,3 SD 99,9%. Tröskeln bör bestämmas individuellt för varje replik experiment eftersom det kan variera.
8 Data Analysis III:. Sammanslagning Replica datamängder
OBS: För att vara säkra på att identifiera interaktionspartners ett typiskt SILAC pulldown experiment bör helst utföras tre gånger, med medeltunga och tunga märkta prover bytte för en av repetitionerna för att kontrollera om någon effekt av medierna på resultaten. Ett protein som visar sig som interagerar i åtminstone två av de tre experimenten, med "switched'-medieprov idealt representerar en av dessa, är en hög förtroende interaktion.
- Återgå till Excel-filen, skapa en ny flik som heter "Kombinerad". Label kolumn A "anslutning" och kopiera alla anslutnings nummer från varje of de enskilda experimenten i denna enda kolumn.
- Välj "Data" fliken och sedan alternativet "Ta bort dubbletter".
- Skapa kolumner för SILAC förhållanden och förhållandet variabiliteten från varje experiment samt för protein namn / beskrivning kolumnen.
- På fliken beskrivningen använder LETARAD formeln för att samla in en beskrivning av varje nummer anslutningen. Dra formeln får passera genom kolonnen för att fylla i proteinet beskrivning. LETARAD formeln är: "= LETARAD (AccessionNo, WheretoLook, ColumnsAccross, False)", där: AccessionNo är $ aX med X är radnumret WheretoLook är den "fliken Experiment Name" $ A $ 2:.! $ Y $ Z där Y och Z är den nedre högra bit data på kalkylbladet som refereras. ColumnsAccross är antalet kolumner över från num anslutningsber i kolumn A ett önskat värde ligger.
Notera: Om exempelvis antalet för anslutning är i kolumn A, och data av intresse ligger i kolumn E. Värdet här skulle vara 5 (kolumn A räknas som en). Såsom accessionsnummer poolades i steg b, är det mest troligt att VLOOKUP inte kommer att erhålla alla de erforderliga namnen från ett experiment. När den återvänder N / A, ändra formeln för att få en beskrivning av varje experiment i tur och ordning tills alla beskrivningar förvärvas. - För att belysa interagerande proteiner i den kombinerade datasetet, väljer varje förhållande kolumn för sig och klicka på fliken Start, följt av Villkorsstyrd formatering> Markera celler regler> Fler regler.
- Välj stil "Classic". Formatera endast celler som innehåller "cellvärde", "Större än eller lika med". I rutan skriver du in 1,96 standardavvikelse värdet, och klicka på "OK".
- Bedöm förhållandet variabiliteten för varje positivt samspel. Om subtrahera% variability skulle släppa en träff under tröskelvärdet, skall detta behandlas med försiktighet.
OBS: Detta är hur konsekvent de individuella kvoter för varje peptid som tillsammans bildar ett protein "SILAC förhållandet är, och ges som en procentsats. När förhållandet variabiliteten beaktas och ett protein ger en SILAC förhållande över tröskelvärdet, representerar detta protein en träff. Om förhållandet variationen ger ett intervall som faller under tröskelvärdet, det träff får representera en förorening. - Upprepa detta för var och en av resultat kolumner och jämföra mellan experiment. Markerade proteiner identifieras i två eller flera experiment representerar ett högt förtroende interaktion.
Anmärkning: Beroende på vilken databas som används för att tilldela proteinanslutningsnummer, i olika experiment ett protein kan ha identifierats under ett annat, eller till och med flera anslutningsnummer. Det är viktigt att kontrollera detta för att se till att proteiner inte oavsiktligt har utelämnats.
Representative Results
I en typisk SILAC pulldown experiment, det stora flertalet av identifierade proteiner (> 90%) utgör föroreningar såväl som proteiner som binder icke-specifikt till affinitetsmatrisen och detta illustreras i figur 2B, även när tvättprotokoll avsätta en majoritet av cytoplasmiska föroreningar såsom GAPDH (Figur 2A). Dock tillåter klustring av ospecifikt bindande proteiner i en normalfördelning proteiner som specifikt binder till ett protein av intresse att särskilja eftersom de har högre prov / håna förhållanden än bakgrunden. Även föroreningar bör teoretiskt kluster runt en stock 2 SILAC förhållande på 0, är detta inte nödvändigtvis är fallet, är ett exempel på detta ges i figur 3. Möjliga orsaker till detta är ofullkomliga SILAC märkning av celler, lastning ojämlika volymer eller koncentrationer av lysat på anti-GFP pärlor, oavsiktlig förlust av pärlor under rening eller ojämn mixning av prover i slutet av proceduren 3 rening. Emellertid under antagande data analyseras baserat på en tröskel standardavvikelse från medelvärdet av de normalfördelade föroreningar skall mindre förskjutningar i centreringen av datan inte påverka kvaliteten på resultaten.
Vid en jämförelse av skillnader i proteininteraktioner mellan två besläktade proteiner, kan en liknande situation uppstå där ett protein av intresse produceras till högre nivåer i celler än en sekund (antingen på grund av variation i transfektionseffektivitet, eller en inneboende egenskap hos proteinet eller mRNA) . Viss variation i expression (t.ex., Figur 2A) kan korrigeras för genom att analysera SILAC förhållande för dessa två prover. I det här exemplet dessa skulle vara GFP-eIF4AI och GFP-eIF4AII samplar. Genom att analysera 4AI/4AII SILAC förhållandet som diskuteras i avsnitt 7, är det möjligt att identifiera proteiner vars bindning varierar kraftigt mellan isoformer.
| Kolumnrubrik | Beskrivning |
| Anslutnings | Visar numret för sekvensen |
| Täckning | Andel av proteinsekvensen som omfattas av de identifierade peptiderna |
| ♯ PSM | Peptid spektral match |
| ♯ peptider | Totalt antal unika peptider som identifieras för ett protein |
| ♯ AAs | Längden av ett protein i aminosyror |
| MW (Da) | Molekylvikten för ett protein i Dalton. Omfattar inte modifieringar |
| beräkn. PI | Den teoretiska isoelektriska punkten för ett protein |
| Betyg | Den totala poängen för ett protein (vilken representerar summan av individual peptid poäng). Den exakta poäng som krävs för betydelse varierar mellan experimenten. En MS-anläggningen kommer vanligtvis tillämpa en 5% falskt upptäckt ränta cutoff. |
| Sekvens | Den sekvens av aminosyror som utgör proteinet |
| Ratio | Den relativa intensiteten av peptider i en namngiven märkta provet, jämfört med en andra märkt prov |
| Ratio Count | Antalet peptidförhållanden som användes för att beräkna ett visst proteinförhållande |
| Ratio variabilitet (%) | Variabiliteten av de individuella peptid förhållanden som användes för att beräkna ett visst proteinförhållande |
| Beskrivning | Namnet på det protein |
Tabell 1. Standardkolumnrubriker från en Proteome Discoverer rapport.Även användbar information kan fås från alla dessa kolumner, är de avgörande för denna analys visas i fetstil.
| Anslutnings | Peptider | 4AI/Mock | 4AII/Mock | Namn | SILAC analys |
| A8K7F6 | 21 | 100 | 1 | eIF4AI | "Agn" protein |
| Q14240 | 22 | 0,01 | 90,855 | eIF4AII | |
| G5E9S1 | 25 | 47,575 | 30,53 | eIF4GI | Interagerande proteiner |
| Q59GJ0 | 5 | 11,778 | 10,619 | eIF4GII60; | |
| P06730 | 3 | 7,22 | 7,57 | eIF4E | |
| Q5T6W5 | 4 | 0,685 | 0,646 | hnRNPK | Icke-specifikt binder föroreningar |
| P62805 | 1 | 0,531 | 0,498 | Histone H4 | |
| H6VRG2 | 18 | - | - | Keratin-1 | Miljö-föroreningar |
| P35527 | 11 | 0,01 | 0,01 | Keratin-1 cytoskeletal 9 |
Tabell 2. Typiska Data från en SILAC immunoprecipitation experiment. Ge exempeldata för ett protein av intresse / bete (högt peptider, hög kvot), proteiner som interagerar med ett protein av intresse (hög / låg peptider, hög kvot), ospecifikt bindande proteiner (hög / låg Peptides, faller förhållande under cutoff - i detta experiment 0,96) och miljögifter (ofta höga peptider, negativ ratio / under tröskelvärdet).
Figur 1. Experimentell plan. Första cellerna odlas i media som saknar arginin och lysin och substituerad med en stabil isotop märkt arginin och lysin i 2 veckor (1). (2) Celler sås i 10 cm 2 rätter och transient med plasmider som kodar för GFP (Mock) eller GFP fusionsproteiner (Samples). (3) Celler lyseras och GFP eller GFP fusionsproteiner immunprecipiterades från cellysat. (4) Prov kombineras i förhållandet 1:1 och lämnas in för LC-MS/MS analys. Data analyseras sedan för att ta bort låga förtroende protein identtionerna och för att välja en nivå av protein anrikning motsvarande äkta interagerande proteiner.
Figur 2. Bekräftelse lämpliga immunfällningsbetingelser. A) Western blot-analys av cellysat, liksom de obundna och bundna fraktioner från immunoprecipitation bekräftar uttryck och immunutfällning av proteinet av intresse. En Western blöt mot GAPDH bekräftar förbrukning av icke-interagerande proteiner och ytterligare western blöt ett känt samverkande partner eIF4A bekräftar framgångsrik immunoutfällning av proteiner som binder till proteinet av intresse. B) Om interagerande partners till ett protein av intresse inte är kända, en silver-färgade gel kan bekräfta immunoprecipitation av interagerande proteiner. På denna silver fläck ed gelbanden för GFP och GFP-eIF4AI/II är tydliga, och ett band som migrerade vid den korrekta storleken för eIF4G är närvarande endast i de GFP-4AI/II-bound körfält och inte i den GFP-kontrollbanan.
Figur 3. Representativa resultat. Histogram som visar fördelningen av proteinförhållanden från en upprepning av (A) GFP-eIF4AI eller (B) GFP-eIF4AII pulldown. Den 1,96 standardavvikelse cutoff är markerad med en streckad linje. Interagerande proteiner som följaktligen inte normalt fördelade främmande ämnen är uppenbara från ~ 0,25 och 1 i (A), och ~ 0,3 till 1,5 i (B).
les/ftp_upload/51656/51656fig4.jpg "/>
Figur 4. Identifiering av eIF komplexa medlemmar från en enda kopia av en SILAC IP experimentet. Proteiner i grönt var för proteinet av intresse användas för rullgardinsinteragerande proteiner är skuggade från rött till vit enligt log 2 SILAC förhållandet i SILAC IP med röd är den mest förekommande proteinet i analysen, och vitt är den 1,96 SD cutoff. Proteiner skuggade i grått identifierades inte i denna analys.
Discussion
Den SILAC neddragningsstrategi som beskrivs här utgör ett mycket känsligt och kraftfullt sätt att upptäcka nytt protein: protein interaktioner, och dessutom gör det snabbt och enkelt diskriminering av förändrade bindningsmönster mellan närbesläktade prover av intresse. I detta exempel är denna teknik användes för att undersöka protein: protein-interaktioner för eIF4AI och eIF4AII proteiner 6. Till författarens kunskap, är detta den första studien i litteraturen utnyttja nyttan av SILAC proteomik för att undersöka den cellulära interactome av dessa två isoformer av eIF4A.
Den metod som beskrivs ovan använder en GFP-tagg och anti-GFP pärlor 9, 10 och därför modifieringar kan krävas för att denna metod ska användas för ett specifikt protein av intresse, till exempel om taggen är placerad vid N-eller C-terminalen av ett protein. Om möjligt, Western blotting eller funktionella analyser börutföras för att detektera bindning av en känd proteininteraktion partner. Om ett protein inte tolerera fusion med en GFP-tagg, annan märkning eller neddragsvideokällor strategier har tillämpats på SILAC drag med användning av båda andra taggar (FLAG 11, biotin 12, STREP (egna data, opublicerad)), eller genom användning av primära antikroppar mot ett protein av intresse där siRNA knockdown av målproteinet ger ett kontrollprov 13. Sådana försök har beskrivits på andra ställen i litteraturen, men i korthet, steg 1 och steg 5,4-8 skulle tillämpas som ovan, med steg 2-5,3 modifierade såsom är lämpligt för expression / pulldown system för val med hjälp av lika stora protein ingångar, såsom beskrivs i steg från 2,4 till 2,5. Eftersom kvantifieringen stadierna tillåta icke-specifika bindande proteiner tas bort på analysnivå, rekommenderas att utelämna förinkubation med kontrollkulor eller höga salt tvättar för att bevara låga affinitet protein: protein interaktioner med protein av intresse . En nukleas may inkluderas eller utelämnas detta protokoll i enlighet med detaljerna i ett visst experiment. Till exempel: när de proteiner som används i denna metod är RNA helikaser var RNas cocktail med i protokollet för att ta bort indirekt interaktion som förmedlas via RNA (steg 3,2). Men i vissa fall kan det vara nytta av att köra parallella experiment med och utan nukleas att identifiera nukleinsyra beroende interaktioner.
Inom detta protokoll är omkoppling av "medium" och "tunga" prover i upprepade experiment rekommenderas att kontrollera för variation infördes av skillnader i SILAC media eller celltillväxt. En alternativ styrning innebär sekventiell växling av alla tre ("lätt", "medium" och "tunga") media i replika experiment. Även denna metod är potentiellt strängare, det ökar komplexiteten i analysen, som i åtminstone ett replikat, ett protein av intresse wsjuk produceras i light märkta celler och därför är det nödvändigt att skilja mellan proteiner konsekvent identifierats i light prover (miljögifter såsom keratiner), och de som bara är anrikade i light prover när bundet till ett protein av intresse.
Samtidigt som användningen av kvantifiering uppgifter medger diskriminering av specifika-från icke-specifika interaktioner med användning av en tröskel, oundvikligen några äkta interaktioner kan kasseras. Tillvägagångssättet ovan är en enkel och snabb metod för att identifiera protein: protein interaktioner som lätt kan försök av forskare utan tidigare erfarenhet av masspektrometri, eller analys av stora protein: protein interaktionsdatamängder. För de flesta användningar är detta mer än tillräckligt för att identifiera nya proteiner av intresse. Ytterligare modifieringar av denna metod för att bidra till att minska denna förlust av data beskrivs på andra ställen i litteraturen och inkluderar användningen av en protein frekvens bibliotek där kända kontaminerande proteiner för en specifik uppsättning av experimentella parametrar (cellinje pärla matris, buffertförhållanden) kan uteslutas 10, 14. Emellertid, beroende på de särskilda experimentella parametrar kan det vara nödvändigt att köra ett antal kontrollexperiment för att alstra en vulst proteomet och detta kan därför öka både kostnaden och komplexiteten av experimentet. Ytterligare information om den här tekniken är tillgänglig från www.peptracker.co.uk webbplats 14.
Det bör också noteras att den ovan beskrivna protokollet inbegriper blandning olika märkta proverna vid slutet av immunutfällning processen (benämnd en blandning efter Rening - MAP SILAC experiment). Detta görs som protein: protein interaktioner inträffa vid en viss jämvikt 15. Det bör noteras att andra grupper har kombinerat detta MAP SILAC tillvägagångssätt beskrivs i detta protokoll med inkubation av provernaföre-neddragning (Rening Efter blandning - PAM SILAC) under olika lång tid (20 min till 2 h har använts i litteraturen) 15, 16. Baserat på hur snabbt en proteinhalt sjunker mot 1:01, är det möjligt att kvalitativt undersöka bindningsaffiniteter och definiera proteiner som stabila eller dynamiska samverkande proteiner 15.
Sammanfattningsvis SILAC pulldowns utgör ett mycket kraftfullt medel för att identifiera proteiner som interagerar med ett visst protein av intresse, i en fysiologiskt relevant miljö. Tekniken kan mycket enkelt anpassas till ett antal olika strategier för rening, vilket gör dess tillämpning på varje givet protein av intresse. Kvantifiering av resultaten förenklar avsevärt identifiera äkta interaktioner, och tillåter uppmjukning av stränga buffertförhållanden som används för att avlägsna icke-specifika bindemedel, och därmed bevarar låg affinitet interaktioner. Eftersom upp till tre prover kan jämföras i den ovanstrategi, har tekniken klar styrka i att jämföra skillnader i proteinbindningsgraden mellan olika proteinisoformer, muterade proteiner, eller effekten av farmakologiska hämmare. Som hela gelskivor analyseras snarare än enskilda band som fläcken genom Coomassie, antalet proteiner som identifierats vid högt förtroende är oftast högre än de som identifierats i en standard GST / TAP-pulldown, och försöksledaren partiskhet i valet proteiner av intresse avlägsnas. Tekniken jämför därför mycket positivt med andra vanliga tekniker som används i identifiering av nya protein-interaktioner (jäst 2-hybrid, GST / His eller TAP pulldowns).
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från Wellcome Trust och BBSRC till IG. IG är en Wellcome Senior Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
| Dialysed FBS (10 kDa cutoff) 500 ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
| Arginine (R0) 25 g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock) |
| Arginine (R6) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock) |
| Arginine (R10) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock) |
| Lysine (K0) 25 g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock) |
| Lysine (K4) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock) |
| Lysine (K8) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock) |
| Penicillin/streptomycin, Liquid. 100 ml | Gibco | 15140-122 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| GFP-trap Agarose (500 μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
| 5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| 1.7 ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
| BCA protein assay kit (1 L) | Pierce | 23225 | |
| Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
| NP-40 alternative | Millipore | 492016 |
References
- Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. Protein-protein interactions. Biochem Soc Trans. 38, 875-878 (2010).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Trinkle-Mulcahy, L. Resolving protein interactions and complexes by affinity purification followed by label-based quantitative mass spectrometry. Proteomics. 12, 1623-1638 (2012).
- Emmott, E., et al. The cellular interactome of the coronavirus infectious bronchitis virus nucleocapsid protein and functional implications for virus biology. J Virol. 87, 9486-9500 (2013).
- Li, W., Belsham, G. J., Proud, C. G. Eukaryotic initiation factors 4A (eIF4A) and 4G (eIF4G) mutually interact in a 1:1 ratio in vivo. J Biol Chem. 276, 29111-29115 (2001).
- Nielsen, P. J., Trachsel, H. The mouse protein synthesis initiation factor 4A gene family includes two related functional genes which are differentially expressed. EMBO J. 7, 2097-2105 (1988).
- Galicia-Vazquez, G., Cencic, R., Robert, F., Agenor, A. Q., Pelletier, J. A cellular response linking eIF4AI activity to eIF4AII transcription. RNA. 18, 1373-1384 (2012).
- Zakowicz, H., et al. Mutational analysis of the DEAD-box RNA helicase eIF4AII characterizes its interaction with transformation suppressor Pdcd4 and eIF4GI. RNA. 11, 261-274 (2005).
- Rothbauer, U., et al. A versatile nanotrap for biochemical and functional studies with fluorescent fusion proteins. Mol Cell Proteomics. 7, 282-289 (2008).
- Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
- Dobreva, I., Fielding, A., Foster, L. J., Dedhar, S. Mapping the integrin-linked kinase interactome using SILAC. J Proteome Res. 7, 1740-1749 (2008).
- Mittler, G., Butter, F., Mann, M. A SILAC-based DNA protein interaction screen that identifies candidate binding proteins to functional DNA elements. Genome research. 19, 284-293 (2009).
- Selbach, M., Mann, M. Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown QUICK. Nat Methods. 3, 981-983 (2006).
- Boulon, S., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9, 861-879 (2010).
- Wang, X., Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7, 46-57 (2008).
- Fang, L., et al. Characterization of the human COP9 signalosome complex using affinity purification and mass spectrometry. J Proteome Res. 7, 4914-4925 (2008).
