Bioengineering

От вокселей к знаниям: Практическое руководство по сегментации комплекс электронной микроскопии 3D-данных

Published: August 13, 2014 doi: 10.3791/51673

Wen-Ting Tsai¹, Ahmed Hassan¹, Purbasha Sarkar², Joaquin Correa^1,3, Zoltan Metlagel¹, Danielle M. Jorgens¹, Manfred Auer^1,2

¹Life Sciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, ²Joint Bioenergy Institute, Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, ³National Energy Research Scientific Computing Center, Lawrence Berkeley National Laboratory

Summary

Узким местом для сотовой 3D электронной микроскопии является выделение признаков (сегментация) в очень сложных карт плотности 3D. Мы разработали набор критериев, который обеспечивает руководство в отношении которых сегментация подход (ручной, полуавтоматический или автоматизированная) лучше всего подходит для разных типов данных, обеспечивая тем самым отправной точкой для эффективной сегментации.

Abstract

Современные подходы микроскопии 3D электронов в последнее разрешено беспрецедентный представление о 3D ультраструктурным организации клеток и тканей, что позволяет визуализацию больших макромолекулярных машин, таких как адгезии комплексов, а также более высокого порядка структуры, такие как цитоскелета и клеточных органелл в их соответствующей ячейке и контекст ткани. Учитывая присущие сложность клеточных объемов, важно сначала извлечь особенности интерес, с тем чтобы визуализации, количественного и поэтому понимание их 3D организации. Каждый набор данных определяется различными характеристиками, например, сигнал-шум, четкость (резкость) данных, неоднородность его особенностей, теснота возможностей, наличия или отсутствия характерных форм, которые позволяют легко идентифицировать, и процентных из всего объема, что конкретная область интереса занимает. Все эти характеристики должны быть рассмотреныпри принятии решения, какой подход принять для сегментации.

Шесть различных 3D наборы ультраструктурным данные были получены три различных изображений, представленные подходы: смола встроенные тонированный электронной томографии, сосредоточены ионного пучковыми и серийный блок лицо- сканирующей электронной микроскопии (FIB-SEM, SBF-SEM) мягко пятнами и сильно окрашенных образцов , соответственно. Для этих наборов данных, четыре различных подхода сегментации были применены: (1) полностью ручной модель здания с последующим исключительно визуализации модели, (2) сегментация руководство отслеживание данных с последующим поверхности рендеринга, (3), а затем полуавтоматические подходы по оказанию поверхности, или (4) автоматизированных специально разработанных алгоритмов сегментации с последующим оказанием поверхности и количественного анализа. В зависимости от комбинации набора данных характеристик, было обнаружено, что, как правило, один из этих четырех категориальных подходов превосходит другие, но в зависимости от точной последовательности критериев, MORe, чем один подход может быть успешным. На основании этих данных, мы предлагаем схему TRIAGE что классифицирует как объективные наборов данных характеристик и субъективные личные критерии для анализа различных наборов данных.

Introduction

Традиционно, электронная микроскопия (ЭМ) поле была разделена на 1) структурной биологии отрасли, используя высокую и супер-высоким разрешением ПЭМ, как правило, в сочетании с скрытые или открытые данные в среднем по расследованию трехмерную (3D) структуру макромолекулярных комплексов с определяется состав и, как правило, относительно небольшой размер ^1-4, и 2) отделение клеточного изображений, в котором целые клеточные Сценарии визуализируются ^1,5,6. В то время как структурная биология отрасль претерпела впечатляющее развитие в течение последних четырех десятилетий, клеточная биология отрасль в основном ограничивается двух измерениях, часто на менее чем оптимально сохранившихся образцов. Только с появлением электронного томографии в последнее десятилетие имеет сотовый биологическую ультраструктурную изображений размножены в третьем измерении ^5,7, где, как правило, в среднем не может быть выполнена, как сотовые пейзажи, и, таким образом особенностях интерес, как правило, уникальны.

Хотя визуализируются клеточные сцены часто ошеломляющим для глаз, эффективной добычи из особенностей интереса и последующего количественного анализа таких весьма сложных клеточных объемов отстают, отчасти потому, что точный состав белка обычно неизвестно, поэтому делает его сложным для интерпретации этих клеточных 3D объемы. К этой дате, обширная биологическая экспертиза часто требуется для того, чтобы интерпретировать сложные томограммы, или даже чтобы выявить важные регионы и основные компоненты в объеме 3D. В дальнейших осложнений, визуализация 3D объемов удивительно нетривиальный. 3D объемы можно рассматривать и таким образом представить в виде стопок 2D-изображений. Срез на срез проверка последовательных 2D изображений уменьшает сложность, но также имеют пределы экстракции и, таким образом, количественный анализ в двух измерениях. Тем не менее, для большинства 3D-объектов, изображение 3D объемов, как только стопка последовательных плоскостей приводит к неполнойд перекос проблематику в конкретной системы 3D природе. Альтернативные способы визуального осмотра требуют либо оказание громкости или поверхности рендеринга, который данную зачастую плотный характер клеточном объема-может легко привести к затрудненным видом вложенных объектов или сокрушить пользователя вообще, что делает интерактивный руководство сегментация трудно.

Чтобы исправить эти барьеры, большое разнообразие автоматизированной выделения признаков (сегментации) подходы были разработаны, что, как правило, либо плотностно или градиент на основе ^8-10. Однако, эти методы, как правило, сегмент весь объем вне зависимости от каких областях и функции могут представлять интерес для специалиста, хотя некоторые современные методы могут нацеливания на определенную особенность интереса, таких как нитей актина ^11. Кроме того, программы, осуществляющие автоматическую сегментацию иногда может привести к получению большого количества суб-объема (например, при применении водосборных бассейнов immersioн сегментации), которые часто должны быть объединены вручную обратно в включающий всю функцию интереса или может быть подвергнут дальнейшей сегментации. Это справедливо особенно для сложных и многолюдных наборов данных, таким образом, наиболее рендеринга компьютерных алгоритмов не могут извлечь только особенности интерес с верности и значительные усилия курирование экспертом часто необходимы для получения желаемого сегментированный объем.

Кроме того, пользовательские решения в весьма конкретной задачи, часто публикуются в качестве научной статьи встречи, с практически не упором на что делает их широкое и всеобъемлющих инструментов доступным для исследователей, не имеющих глубокие знания области математики, информатики и / или компьютерная графика. Настраиваемый среда программирования программное обеспечение, содержащее ряд библиотек анализа изображений, может быть мощным набор инструментов позволяет пользователям эффективно создавать свои собственные модули для точного сегментирования. Тем не менее, этот подход требует добensive обучение и фон в информатике для того, чтобы воспользоваться его многочисленных функций или возможностей для анализа изображений. Можно работать в такой разносторонней программной среды для определенных наборов данных, где особенности являются более редкими, например, за счет использования мощных фигур на основе подходов, которые полагаются на уникальной геометрии "шаблонов", чтобы отделить объекты, представляющие интерес с их окружением ^12,13 .

Справедливый выбор пакетов компьютерной графики визуализации существуют для интерактивного ручной сегментации и построения модели. Некоторые пакеты имеются в продаже, в то время как другие имеют академической происхождения и распространяется бесплатно, такие как: Калифорнийский университет в Сан-Франциско Chimera ^14, Университет Колорадо УПМ ^15, и Техасского университета Остина VolumeRover ^16. Тем не менее, широкий спектр и сложность функций и возможностей эти программы обладают круче кривой обучения для еагл. Некоторые программы визуализации обеспечивают простые геометрические модели, такие как шарики и палочки разного размера, которые могут быть размещены в картах плотности для создания упрощенную модель комплексной 3D-объем. Эти модели затем позволить простые геометрические и объемные измерения и, следовательно, выходят за рамки просто "красивая картинка". Такая ручная трассировка объектов хорошо работает для томов, в которых необходимо лишь небольшое количество объектов, чтобы проследить и экстрагируют. Тем не менее, в последнее время развитие большого объема 3D ультраструктурным визуализации с использованием либо сосредоточены ионного пучка сканирующая электронная микроскопия (FIB-SEM) ^17-20 или серийный блок лицо сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) ²¹ представляет дополнительные сложности, что размер 3D данных Наборы могут варьироваться от гигабайт до десятков и сотен гигабайт, и даже терабайт. Поэтому такие крупные 3D объемы практически недоступны в ручной выделения признаков, и, следовательно, эффективность пользователь наведением полуавтоматическое подвигДобыча Юр будет одним из узких мест для эффективного анализа 3D объемов в обозримом будущем.

Здесь представлены четыре различных подхода сегментации, которые обычно используются на большом диапазоне биологических типов изображений. Эти методы затем сравниваются для их эффективности для различных типов наборов данных, что позволяет компиляцию в качестве руководства, чтобы помочь биологам решить, что может быть лучшим сегментация подход для эффективного выделения признаков собственных данных. Как подробно руководства пользователя доступны для большинства программ, описанных, цель состоит в том, чтобы не сделать потенциальные пользователи знакомы с любой из этих определенных пакетов. Вместо этого, целью является продемонстрировать сильные стороны и ограничения этих различных стратегий сегментации, применяя их к шести например наборов данных с различными характеристиками. Благодаря этому сравнению, набор критериев были разработаны, которые либо на основе объективных характеристик образаНаборы данных 3D, такие как противоположность данных, резкости, тесноту, и сложности, или вытекают из субъективных соображений, таких как желаемой цели для сегментации, морфологии особенностей, чтобы быть сегментирован, плотность населения из особенностей интерес, то есть доля объем, занимаемый функции интереса, и, как исходить оптимально с ограниченными ресурсами, таких как время и наличия персонала. Эти различные примеры наборов данных показано, как эти объективные и субъективные критерии могут быть применены последовательно в различных комбинациях, чтобы получить спаривание некоторых подходах извлечения признаков с определенными типами наборов данных. Рекомендации, данные мы надеемся, поможет новичкам сталкиваются с большим разнообразием вариантов сегментации выбрать наиболее эффективный подход сегментации для собственного 3D-объем.

Хотя основное внимание в данной работе является выделение признаков, внимание к сбору данных и предварительной обработки данных имеет решающее значение для эффективных сegmentation. Часто окрашивание образцов может быть неравномерным, и, следовательно, потенциальные артефакты окрашивания следует рассматривать в порядке сегментации. Тем не менее, пятно обычно дает более высокую сигнал-шум, и, следовательно, требует меньше фильтрацию и другие математическую обработку клеточных объемов, которые потенциально могли бы также привести к артефактов. Соответствующие наборы исходные данные изображения должны быть приобретены при правильных настроек контрастности и камера пикселей, выровнен, и реконструирован в 3D-объем. Для томограмм, выровненные изображения реконструируются правило, с использованием взвешенных обратного проецирования, а затем набор данных, как правило, подвергаются алгоритмов шумоподавления, например, нелинейной анизотропной диффузии ^22, двустороннего фильтрации ^23, или рекурсивной медианной фильтрации ^24. Данные изображений FIB-SEM и SBF-SEM выровнены по кросс-корреляции последовательных срезов в XY с использованием таких программ, как ImageJ ^25. Контрастное усиление и фильтрацию можно применять для повышения особенностиинтерес и тем самым де-шум стек изображения. Фильтрация может быть выполнена либо на весь объем до подобъема выбор или от выбранных subvolumes, как фильтрация подходы могут быть вычислительно дорого. Вниз-выборки данных (Binning), который иногда используется для снижения уровня шума и / или уменьшения размера файла, рекомендуется только если данные были значительно выборка по сравнению с ожидаемым разрешением.

После шумоподавления, обработанные изображения могут быть сегментирован различными способами, и в центре внимания в этом исследовании на следующие четыре: (1) ручной абстрактной поколения модели через создание модели мяч и пряника, (2) руководство трассировка особенностей интерес, (3) автоматизированной порогового основе плотности, и (4) Индивидуальный автоматизированной сегментации с помощью сценария для проекта конкретного сегментации. Граница сегментация ⁸ и захватывающий водораздел сегментация ¹⁰ лучшие альтернативы простому порога, но тэй принадлежат к той же категории и не были явно включены в этом обсуждении.

Руководство отслеживание плотности требуется описанием элементов, представляющих интерес, нарезать на-ломтик, что позволяет сохранение оригинального плотности соответствующих субклеточном областях. Такой подход позволяет максимально контролировать процесс сегментации, но это утомительно и трудоемкий процесс.

Автоматизированные пороговые основе (и связанных с ними) подходы сегментации плотность полуавтоматические, где алгоритм выбирает пикселей на основе набора заданных пользователем параметров. Несколько академических (бесплатно) визуализации пакеты, такие как UCSF Химеры, УПМ, Фиджи ²⁶ и VolumeRover доступны, а также коммерческий (требует платных лицензий) пакеты, и оба типа обычно включают один или несколько из этих подходов сегментации. Пакеты программного обеспечения, используемые в этой работе, чтобы проиллюстрировать эти различные методы включают в себя как коммерческие программы и академические открытые секOurce программы для вручную генерации абстрактную модель, а также ручной и автоматизированной сегментации плотности. Тем не менее, программное обеспечение с открытым исходным кодом может иногда предлагают более продвинутые варианты через возможности кастомизации.

Сравнение этих методов с использованием различных типов наборов данных привело к следующему представлению правил и указаний о том, как подойти к сегментации различных объемов 3D биологические данные, которые, насколько нам известно до сих пор не опубликованы. Таким образом, это первый систематический Сравнение различных подходов и их полезность на наборах данных с различной характеристики для пользователей с разными целями.

Protocol

1 Руководство Абстрагированная Модель Поколение

Примечание: Подробная информация о методологии, описанные ниже, характерные для Chimera, но другие программные пакеты могут быть использованы вместо. С помощью этого подхода, когда единственной целью является создание геометрической модели (например, шар и палку модели) для того, чтобы геометрические размеры, вместо отображения объема форму объектов.

Импорт объем данных в подходящую программу для ручного забранной поколения модели.
1. Выберите Файл> Открыть Карта подтянуть диалог открытия файлов. Перейдите к папке файла желаемого карте.
2. Потяните вверх Volume Viewer (Инструменты> Объем данных> Объем Viewer) и выберите Функции> стиля отображения для отображения данных в различных стилях рендеринга.
3. Отрегулируйте порог для дисплея, перетаскивая вертикальную полосу на гистограмме в Volume Viewerокно.
Перемещение по 3D-объем (например, кусочек за кусочком), чтобы выбрать область интереса для сегментации и обрезать согласования меньшей громкости при необходимости.
1. В диалоговом окне просмотра тома нажмите кнопку оси, то выберите X, Y, или Z.
2. В диалоговом окне просмотра том, выберите пункт Функции> Самолеты. Щелкните, чтобы установить Глубина для отображения самолет, соответствующий номеру в левом поле, и нажмите Все, чтобы отобразить все самолеты.
3. В диалоговом окне просмотра тома, выберите Особенности> Выбор субрегиона.
  1. Нажмите и перетащите, чтобы создать прямоугольную рамку вокруг интересующей области.
Поместите маркеры вдоль объекта интереса и соединить их с линкеров в случае необходимости (часто делается автоматически программой), пока модель не будет завершена.
1. В строке Объем меню просмотра, выберите Сервис>Диалоговое Tracer Объем чтобы открыть диалоговое окно Volume Tracer. В диалоговом окне Tracer том, выберите File> New Marker Set.
2. В диалоговом окне Tracer том, проверьте мышь> Место маркеров на высокое качество, место маркеры на самолетах данных, перемещать и изменять размер маркеров, Link новый маркер для выбранного маркера, и Ссылка последовательно выбраны маркеры.
3. Нажмите на цвет маркера образец, и выберите цвет. Повторите этот шаг для цвета Link.
4. Введите радиусы для маркерных и ссылок элементов построения моделей.
5. В Tracer окне тома Выберите пункт маркеры, используя [вправо] кнопку мыши, и вставьте радиусы для маркеров и ссылки.
6. Щелкните правой кнопкой мыши на данных объемных начать устанавливающий маркеры. Маркеры будут подключены автоматически.
7. В диалоговом окне Tracer том, выберите Файл> Сохранить текущий набор маркеров, то Файл> Закрыть маркер набор.
Откройте новый набор маркеров (Step 1.3.1), чтобы начать строить модель в второй требуемой функции интереса. Использование контрастных цветов между маркеров наборов подчеркнуть различия в особенности.

2 Руководство Отслеживание Особенности интересов

Примечание: Подробная информация о методологии, описанные ниже, характерные для Amira, но другие программные пакеты могут быть использованы вместо. Используйте этот подход, когда плотность населения является относительно небольшим и, когда точность выделения признаков имеет первостепенное значение, так как ручной трассировки является трудоемким подход.

Объем импорта данных в программу с ручными вариантов трассировки. Программное обеспечение с этой возможностью обычно предлагают по крайней мере основной инструмент кисти.
1. При больших объемах или томограмм (например, 16-бит 2048 х 2048 или больше .rec или .mrc томограмм генерируется в УПМ): Выберите Open Data> Правый клик на filename.rec> Формат ...> Выберите Raw как LargeDiskData Ok> Load. Выберите соответствующий Raw Параметры данных из информации заголовка> Ok. Переключение и Сохранить как нового filename.am файл для использования в следующих шагов.
2. Для небольших файлов 3D изображений стека (например, 3D .tif или .mrc или .rec): Open Data> Выберите filename.tif или filename.mrc. Переключить и Right Click> Сохранить как filename.am . Если возникает ошибка или программа не отвечает, то файл может быть слишком большим и может быть открыт, следуя шаг 2.1.1.
Навигация по ломтиками, чтобы выбрать 3D суб-объем для сегментации, а затем обрезать, чтобы этой области интереса.
1. В окне 3D-просмотра, выберите Orthoslice открыть файл изображения. Используйте ползунок в нижней части, чтобы перемещаться по ломтиками.
2. Чтобы обрезать большие данные открыты, как LargeDiskData, тумблер имени файла в окне Pool> Щелкните правой кнопкой мыши> LatticeAccess. Enteг желаемый размер коробки> Применить. Сохранить новый файл.
Создать сегментации файл.
1. Переключите файл в окне Pool> Щелкните правой кнопкой мыши> Маркировка> LabelField. Новый файл будет создан и автоматически загружается на вкладке Сегментация Editor.
Трассировка границу первой особенностью интерес, а затем заполнить след от руки или с помощью команды, специфичную для используемого программного обеспечения. Следуйте особенность интерес через все кусочки и повторить сегментацию ручной трассировки. Используйте следующие команды, когда, используя Amira:
1. Чтобы использовать инструмент Кисть, изменять размер кисти по желанию, то с помощью указателя мыши проследить границу особенностью интереса.
2. Заполните прослеживается зона с контекстном "F". Добавьте выбор, нажав на кнопку с символом плюс, или в контекстном «а». При необходимости нажмите "U", чтобы отменить, и "с" вычесть или стереть.
3. Создайте визуализации поверхностей для визуализации и основные качественные или количественного анализа в программной инструкции руководство пользователя.
  1. На вкладке бассейн объектов, переключения имя файла-labels.am в окне Pool> Щелкните правой кнопкой мыши> SurfaceGen.
  2. Выберите желаемые свойства поверхности> Применить. Новый файл filename.surf будет создан в бассейне.
  3. Для визуализации сегментированный объем, переключение filename.surf в окне Pool> Щелкните правой кнопкой мыши> SurfaceView.
  4. Используйте инструменты в окне 3DViewer перемещать, вращать, и увеличения в объеме 3D.
4. Выписка точные плотности и определить измерения, такие как громкость или площади поверхности. Экспорт в другие программы для более продвинутой отображения, анализа и моделирования.
  1. На окне 3DViewer, нажмите Измерение инструмента> Выберите подходящий вариант (2D длину и 2D углом для измерений на одной 2D плоскости, 3D длину и 3D Уголдля измерений на 3D-объем).
  2. Нажмите на поверхности сетки для измерения нужной длины, расстояние и углы. Значения будут перечислены в окне свойств.
3 Автоматизированная Плотность основе сегментации
Примечание: Подробная информация о методологии, описанные ниже, характерные для Amira, но другие программные пакеты могут быть использованы вместо.
1. Используйте этот подход на наборах данных с любой разновидности контраста, четкости, или тесноту вывести плотности интерес.
2. Объем импорта данных в программу, оснащенного порога, волшебной палочки или других инструментов плотности на основе для автоматической сегментации. Выполните действия, описанные в 2.1-2.1.2 в направлениях для ручной трассировки.
3. Навигация по ломтиками и выберите область для сегментации. При необходимости, обрезать меньший 3D суб-объем для сегментации. Выполните действия, описанные в 2.2-2.2.2 в направлениях для ручной трассировки.
4. Выберите плотностьособенностью интерес, как правило, нажав или размещения знака или точку привязки на функции. Если разрешено в программном обеспечении, введите диапазон номеров охватывающий интенсивность для новых функций пикселя и настроить эту терпимость по желанию. Удельный вес, принадлежащие к функции будут подобраны в соответствии с интенсивностью стоимости анкера пикселя или допуска. Используйте следующие команды при использовании Amira.
  1. Используйте Magic Wand Tool для функций с различимых маржи.
    1. Нажмите на область интереса, а затем настроить ползунки на дисплее и маскировки, чтобы захватить правильный диапазон значений, так что функция полностью выделены. Добавить выделение контекстном «а».
  2. Используйте инструмент порога для функций без четко выраженных краев.
  3. Выберите значок Threshold. Отрегулируйте ползунок для настройки плотности в пределах желаемого диапазона, так что только особенности интерес маскируются. Нажмите кнопку Выбрать, затем добавить выбор с ярлыком220; ".
  4. Для сегмента всему объему, выберите Все срезы перед добавлением выбор.
  5. Для удаления шума, выберите Сегментация> Удалить острова и / или сегментации> Smooth этикетки.
5. Создайте поверхность для визуализации и качественного анализа, как описано в разделе ручной трассировки 2.6-2.6.2. При желании, экспорт в другие программы для адекватного отображения 3D, количественного анализа и моделирования.
4 Индивидуальный Автоматизированная Сегментация
Примечание: Используйте этот подход для создания пользовательских скриптов для автоматической сегментации, которая требует фона опыт в области компьютерных наук, но позволяет возможность создать точную модель плотности из большого объема.
1. Инструменты (конкретный пример Shape-Руководил Сегментация в MATLAB ²⁷⁾
  1. Изображение предварительной обработки: Выполните де-зашумления, удаление фона и повышения качества изображенияс помощью следующей трубопровода:
    1. Загрузите изображение с помощью команды imread.
      1. В командной строке введите: >> им = imread ($ image_path), где $ image_path является местоположение изображения, которые будут проанализированы.
    2. С Image Processing Toolbox, звоните фильтр Винера, используя, по оценкам, или известный шума мощности к сигналу соотношение (NSR).
    3. На ранее обработанного изображения, вызовите функцию открытия изображения imopen оценить фоновый слой, затем выделить исход как другой маской.
      1. В командной строке введите:. >> Фон = imopen (им, стрел ($ shape_string, $ размер)), в этом методе, $ shape_string равна 'диск' переменной $ размер задается анализатора т.е. >> фон = imopen (им, стрел ('диск', 15)).
    4. Вычтите фильтрованное изображение с фоном.
      1. В командной строке введите: >> im2 = Im -фон
    5. В зависимости от качества результатов, выполните изображения нормализации с или без метода адаптивной Оцу в ^28, который можно назвать, используя функцию imadjust от Image Processing Toolbox.
      1. В командной строке введите: >> im3 = imadjust (im2)
    6. Подготовьте особенности интерес для сегментации, ограничивая регионы интерес обрезка нормализованное изображение.
      1. Использование команды imtool, исследовать область интереса, который должен быть обрезаны и обеспечить координаты на команду: >> im3_crop = imcrop (im3, [x1 y1 x2 y2]), где вектор [x1 y1 x2 y2] соответствует квадрат область должна быть обрезана.
  2. Форма признания / контролируемой классификации формы: Поезд алгоритм, предоставляя конкретные примеры для каждого различного категории объектов (линейные следы в 2D-изображения через особенностях интерес).
    1. Убедитесь, что VLFEAT ²⁹ API успешно установлен и посетите веб-сайт VLFEAT для более углубленного документации.
    2. В командной строке введите: >> [ДЕРЕВО, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, $ K, $ NLEAVES), где $ K есть число кластера, которые будут использоваться или число классов наблюдатель хочет устроить данные в, и $ NLEAVES является желаемое количество листьев кластеров, то есть >> [ДЕРЕВО, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4100)
    3. Используйте вручную сегментированные черты как вход для VLFeat.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это C-основе открытой библиотеки будет выполнять пикселя исправлений, патч кластеризации, и кластер центр позиционирование в зависимости от типа выбранного метода, работают лучше всего для наборов данных. Доступные опции варьируются от к-средней кластеризации для Texton основе подходов ^30, и на выходе получается численное массив, который описывает особенности желаемого на основе данных экземпляров.
2. Сегментация: Используйте этот фуLLY автоматизирован, хотя больших вычислительных затрат, подход к сегмента нескольких классов одновременно объектов, которые будут записаны в качестве отдельных карт для дальнейшего визуализации и анализа.
  1. Загрузите сгенерированный ранее цифру массив (модель).
  2. Вызов функции опорных векторов (SVM) в VLFeat, с помощью модели и изображения, чтобы быть сегментирован в качестве вклада.
    1. В командной строке введите: >> [ш, Ь] = vl_svmtrain (х, у, 0,1), где х оригинальное кадрирования im2_crop и у объективная изображение, образ, который был сегментирован вручную. Используйте >> ISEG = VL_IMSEG (I, этикетки), чтобы покрасить результаты в соответствии с метками, порожденных кластеризации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На основании характеристик модели, VLFeat будет классифицировать изображение от количества классов (особенности интерес), назначенные с начала. В зависимости от класса точности желаемого, можно объединить этот метод с другими подходами или сметной Clustпараметры эр, такие как корпуса и кластерных центров. Выход алгоритма SVM является вероятностная модель и несколько двоичных масок желаемых классов в новых наборов данных.
  3. Сохранить результаты, введя команду: >> imwrite (IM, $ формат, $ имя файла), где $ формат 'TIFF' и $ имя файла путь для выходного файла.
  4. Для визуализации изображения, введите команду: >> imshow (IM).

Representative Results

На рисунке 1 показан типичный рабочий процесс для 3D электронной микроскопии визуализации клетки, в том числе электронного томографии, FIB-SEM, и SBF-SEM. Рабочий процесс включает сырые сбора данных, выравнивание данных и реконструкции в объеме 3D, шумоподавление путем фильтрации, и при необходимости, обрезка в интересующей области для того, чтобы максимально повысить эффективность выбранной сегментации программного обеспечения. Такая предварительная обработка данных готова к добыче функция / сегментации.

На рисунке 2 показан рабочий процесс выложил на рисунке 1 с четырьмя разными наборами данных (которые будут введены ниже), два из которых являются образцы смол встроенные, записанные с помощью электронного томографии (2А, 2В), с другой два вытекающих из FIB -SEM и SBF-SEM, соответственно (цифры 2C, 2D). Изображения в Рисунок 2 колонки 1 являются проекциейпросмотров (Цифры 2A1, 2B1) и блок изображений поверхности (Рисунки 2C1, 2D1), соответственно, что на выравнивание и реконструкции складываются в 3D-объем. В колонке 2 показаны срезы с помощью таких 3D объемов, которые на фильтрации (колонка 3) показывают значительное снижение шума и, таким образом, часто оказываются более четким. После выбора и обрезка большой объем 3D в интересующей области (столбец 4), 3D визуализации из сегментированных особенностей интерес (колонка 5) можно получить и в дальнейшем проверены, цветом и количественному анализу.

В общей сложности шесть наборов данных 3D, каждый из которых содержит стопку изображений, полученных с помощью любой электронной томографии (3 наборов данных), FIB-SEM (2) наборы данных, или SBF-SEM (1 комплект данных) используются для сравнения, как каждый из четыре метода сегментации выполнить (рисунок 3). Наборы данных проистекают из множества различных научно-исследовательских работ в лабораторных условиях и, следовательно, обеспечивают арeasonably разнообразный набор типичных экспериментальных наборов данных. Все наборы данных были рассмотрены четыре независимых исследователей, каждый из которых наиболее знакомы с одним конкретным подходом, и они были обвинены в предоставлении наилучшего результата для каждой из шести наборов данных.

Объемы данных из образцов следующие: 1 Цифры 3A1-3A5: высокое давление заморозки, стоп-замещенных и смолы встроенные цыпленок внутренний волосы уха стереоцилии клеток ^31, 2. Цифры 3B1-3B5: высокое давление заморозки, замораживании замещенных и смолы встроенные стены растительной клетки (не опубликовано), 3. Цифры 3C1-3C5: высокого давления заморозки, стоп-замещенных и смолы встроен внутренний Киноцилия ухо волосковых клеток (не опубликовано), 4. Цифры 3D1-3D5: высокая давлению замороженные, замораживанием замещенные и смол, встроенных блоков, расположенных в митохондриях человека эпителиальными клетками молочных желез НМТ-3522 S1 ацинусов, которые были культивированы в ламинина богатой extracellулар матрица ^32,33, 5. Цифры 3E1-3E5: запятнано настольный обработаны, смол встроенные блоки сульфат редуктора бактериальных биопленок (рукопись в стадии подготовки), и 6 Цифры 3F1-3F5: мембрана граница соседних клетках ГМТ -3522 S1 ацинусы.

Как видно из фиг.3, различные подходы сегментации может привести к в основном аналогичные результаты для некоторых типов набора данных, но совершенно разные результаты для других типов данных. Например, множество волосковых клеток стереоцилии данных (3А) дает разумные объемы сегментации со всеми четырьмя подходами, с ручной абстрактной модели, порожденной экспертной пользователя, являющегося ярким интерпретировать и мера. В этом случае, такая модель позволяет быстро измерений расстояний нити-нити, считая от числа ссылок, найденных между вытянутой нити, а также определения недостающих частей плотности карте соответствующейв местах, где образец был поврежден во время подготовки проб ^34. Такая информация является гораздо более трудно приобрести с помощью других трех подходов сегментации, хотя индивидуальный автоматизированный сегментация обеспечивает лучшие результаты, чем чисто плотности на основе пороговой.

Для завода клеточной стенки (Рисунок 3B), ручная генерация модели, казалось, будет наиболее эффективным в передавая ощущение того в клеточной стенке, которая ни один из других подходов не достичь. Тем не менее, отведенной модель не отражает тесноту объектов в наборе данных. Вручную трассировки особенности интерес, кажется, дает лучший результат, чем плотность основе или форма-контролируемых подходов. С другой стороны, руководство трассировка очень трудоемкий и определение границы особенностей является несколько субъективным. Поэтому, автоматизированные подходы могут быть предпочтительными для сегментации больших объемов с потенциальным компромисс между точностью иресурсы, расходуемые на ручной сегментации.

Для множества киноцилия данных (Рисунок 3C), ручной отведенной генерации модель дает чистый результат и показывает неожиданную архитектуру трех микротрубочек в центре киноцилии, детали, которые хорошо видна в обрезанные данных, но потерял во всех других подходов , по-видимому, в связи с испачкать неоднородность. Тем не менее, другие потенциально важные особенности плотности карте пропущены в ручном поколения абстрактной модели. Это связано с тем, что субъективный характер формирования ручного модели приводит к идеализации и абстракции фактической плотности наблюдается, и, следовательно, к субъективной интерпретации при формировании модели. Следовательно, этот пример хорошо демонстрирует, как руководство отведенной поколение модель позволяет сконцентрироваться на определенном аспекте объема 3D. Тем не менее, избирательное восприятие и упрощение не дает полный отчет о всех белков соmplexes присутствующие в наборе данных. Таким образом, если цель состоит в том, чтобы показать сложность данных, то лучше подается с любой из других трех подходов.

В случае 3D-матрицы культивируют ацинусов молочной железы (рисунок 3D), высокий контраст митохондрии Географическая всех четырех подходов с легкостью, с ручным отслеживания особенностей не слишком удивительно, дающих лучшие результаты с низкой степени загрязнения ( Рисунок 3D3). Тем не менее, руководство трассировка очень трудоемкий, и поэтому имеет ограниченное применение для больших объемов. Оба пороговая плотность основе и форма под надзором автоматизированная сегментация извлечь митохондрии достаточно хорошо, и приведет к почти идеальной сегментации, если дальнейшие рекомендации для очистки используются (например, ликвидацию всех объектов ниже определенного порога плотности воксельном) как можно в разных пакетах. В этом случае, руководство отведенной модель здания не далиобнадеживающие результаты, в части, потому что митохондрии не может легко быть приближена с шариковыми и палки моделей.

В отношении бактериальной почвы сообщества / биопленки (Рисунок 3E), три из четырех подходов дают разумные результаты, с ручной поколение модели не очень хорошо в связи с проблемой представления биологических объектов, таких как бактерии, от геометрических форм. Внеклеточные придатков, происходящие из бактерий могут быть обнаружены в автоматизированных методов сегментации, но не так хорошо, в ручном отслеживания объектов. Форма под наблюдением индпошив автоматизированные сегментация может дополнительно отделить внеклеточных особенности от бактерий, несмотря на их аналогичные плотности (данные не представлены), что позволяет легко количественно даже чрезвычайно больших наборов данных. Потому что это изначально очень большой набор данных, индпошив автоматизированные сегментации четко outcompeted все другие подходы, но, возможно, выиграли от низкой сложностии относительно редкие распределение интересующих объектов (низкий теснота).

При рассмотрении интерфейс между двумя эукариотических клеток в ткани-как контексте (рис 3F), только механическая отслеживание особенностей интерес хорошие результаты. Автоматизированные плотности подходы сегментации не обнаружить мембраны границу между соседними ячейками в целом, и даже Заказные подходы не удается, отчасти потому, что форма ячейки не легко приблизить или приравнивается форм, несмотря на его очевидный успех для бактерий в биопленки (рисунок 3E5).

Наблюдение из рисунка 3, что подходы сегментации преуспеть на некоторых наборов данных, но не на других привело к вопросу о том, характеризует каждый из этих наборов данных, и можно ли было классифицировать типы характеристик данных или личных целей, что, казалось, хорошо совпадают с их respectivэ подход. Систематическое изучение этой темы ранее не проводили, и, таким образом, в качестве первого шага создание эмпирической список характеристик изображения и личных целей может направлять новичок в их попытке найти наилучший подход для выделения признаков их соответствующего набора данных.

Восемь критерии были определены как значительное показаны на рисунке 4, и их можно разделить на две основные категории: (1) особенности, которые присущи в наборе данных, и (2) личные цели ориентации исследователя и другие соображения, которые являются несколько более субъективным, хотя не менее важно. Примеры, показанные преимущественно взяты из шести наборов данных на рисунке 3, с три дополнительные наборы данных внедряются: один (Рисунок 4A1) является крио-томограмма крио-секции Arabidopsis THALIANA растений клеточной стенки, вторая (Цифры 4A2 , 4B1, 4D1 рисунках 3F1-3F5 но является еще более существенно комплекс, а третий (Рисунки 4B2 , 4D2) представляет собой смолу сечение томограмма внутренней стереоцилиях уха волосковых клеток в поперечном сечении, аналогичный содержания образца, показанного в продольном в Figuress 2A1-2A5 и 3A1-3A5.

Для категории объективных критериев, как характеристики изображения, четыре черты, присущие наборов данных предлагается иметь значение:

Контраст данные могут быть (1) низкая (Рисунок 4A1) как это характерно для крио-ЭМ томограмм, (2) промежуточный (Рисунок 4A2), например, в сотовых пейзажей, не имеющих четкой органеллы или другой характерной особенностью положения, или (3) высокий (Рисунок 4A3), как это имеет место для kinociliary томограмма или стереоцилии в поперечном сечении, в связи с выравниванием четко разделенных нитевидных элементов в Z-направлении.
Данные могут быть нечетким (Рисунок 4B1), без явно четких границ между двумя близко расположенными объектами, такими как клетки в ткани, или хрустящий (рис 4B2), с резко обозначенными границами. Отчасти это зависит от набора данных резолюции, которая по своей сути выше на коэффициент примерно 2-4 для электронных томограмм по сравнению с FIB-SEM. Естественно, более острые границы желательно как для руководства, а также автоматизированных подходов сегментации, но важное значение для второго подхода.
Карты плотности может быть либо переполнены (Рисунок 4С1), как это отражается на плотно расположенными компонентов клеточной стенки растений, или малонаселенных (Рисунок 4С2), как и бактерии в колонии, которая служит примером разделение, которое оказывает автоматизированной сегментации изображения значительно проще.
Карты плотности может быть весьма сложной с абсолютно разными функциями часто неправильной формы, такие как сосудистой полоски ткани вокруг кровеносного сосуда (Рисунок 4D1) или четко определенных органелл, как объектов с аналогичной организации, такие как стереоцилиях в поперечном сечении ( Рисунок 4D2).

Также обратите внимание на совершенно разные масштабы во всех различных примеров, что делает сравнение довольно трудно.

Помимо более объективных критериев, таких как характеристики изображения, четыре очень субъективных критериев, которые будут направлять выбор соответствующий путь также предложил:

Желаемый Цель: Цель может быть визуализировать волос расслоение стереоцилии в его сложности и определить и изучить форму объекта (Рисунок 4E1), или создать упрощенную и абстрагируется мяч и пряника модель, которая встроена в плотности карте и позволяет быстро считаяй измерение геометрических объектов (длина нити, расстояние и количество подключений) (Рисунок 4E2).
Функция морфологии может быть весьма нерегулярно и комплекс подобных клеток, таких как зоны взаимодействия клетка-клетка (рис) 4F1, несколько одинаковой формы с некоторым изменением, например, митохондрий (рисунок 4F2), или в основном идентичную форму, например, актиновых филаментов и кросс Ссылки в волос пучка в продольной ориентации (Рисунок 4F3).
Доля функции процентного (плотность населения) важно, как можно хотеть сегменте все функции в наборе 3D данных, как это имеет место для стенок клеток растений (Рисунок 4G1), или только крошечную долю сотовой объема как в случае митохондрий в гетерогенной клеточной сцены (рисунок 4G2). В зависимости от размера блока данных и в процентах от объема, что требует сегментации, она может быть наиболее эффективно использоватьручные подходы. В других случаях, например, когда человек заинтересован в разнообразных функций, там просто нет альтернативы использованию полуавтоматические подходы сегментации.
Другим ключевым субъективным критерием является количество ресурсов один готов инвестировать в процесс сегментации и какой уровень верности требуется ответить на биологическую вопрос. Можно хотят и должны количественно объемные параметры особенность (такие, как размер, объем, площадь поверхности, длина, расстояние от других функций и т.д.), и в этом случае больше заботы могут быть необходимы для получения точной количественной информации (Рисунок 4х1), или назначения может быть, чтобы просто хватать картину своего 3D формы (Рисунок 4х2). В идеальном мире, где ресурсы неограниченны, один явно не хотели идти на компромиссы, а выбрать для наиболее точного пути ручного пользователем помогал выделения признаков. В то время как это может работать в течение многих наборов данных, в ближайшем будущем 3D объемы Уил л будет в порядке 10k на 10k на 10k или выше, и ручной сегментации больше не будет в состоянии играть важную роль в сегментации такое огромное пространство. В зависимости от сложности данных и другие характеристики данных, полуавтоматическое сегментация может стать необходимостью.

На рисунке 5, сильные и слабые стороны, кратко перечислены для четырех подходов сегментации. Личные цели и характеристики изображения, указанные в Рисунке 4, что может быть сопряжено с каждого подхода изложены также. На рисунке 6, личные цели и изображений характеристики шести наборов данных примером того, как проводить сортировку данных и принять решение о наилучшем подходе. Обе цифры 5 и 6 расширены в обсуждении.

нагрузка / 51673 / 51673fig1highres.jpg "ширина =" 500px "/>
Рис.1 Workflow для биологической реконструкции и анализа изображений. Эта диаграмма дает обзор различных шагах, предпринятых для сбора и обработки изображений, собранных томографии, электронного луча, сфокусированного SEM и серийный блок лицо SEM. Сырье результаты сбора данных в серии наклона 2D или серийных срезов. Эти 2D множества изображений должны быть выровнены и реконструирован в 3D, затем фильтруют, чтобы уменьшить шум и повысить контрастность функций, представляющих интерес. Наконец, данные можно сегментировать и проанализированы, в конечном счете, в результате чего 3D-модели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2.. Примеры процесса для разных типов данных из томографии и FIB-SEM каждом шаге процесса после сбора данных отображается с помощью четырех наборов данных (строки AD): смолы встроенных тонированный томография продольно секционного стереоцилиях, смолы встроенные витражное томографию завод клеточной стенки целлюлоза, FIB-SEM молочной митохондриях эпителиальных клеток, и SBF-SEM Е. бактерии кишечной палочки. 2D срез исходных данных показано в колонке 1, и изображение из данных после выравнивания и 3D реконструкции включает колонку 2. методы фильтрации, применяемые в колонке 3 являются следующие: медианного фильтра (A3), не-анизотропная диффузия фильтр (B3), Gaussian Blur (C3), и imadjust фильтр MATLAB в (D3). Пример из лучших сегментации для каждого набора из посевной площади интереса (колонка 4) данные отображаются как 3D-рендеринга в колонке 5 масштабные линейки: A1-A3 = 200 нм, A4 = 150 нм, A5 = 50 нм, В1-В3 = 200 нм, В4-В5 = 100 нм, C1-C3-= 1 мм, С4-С5 = 500 нм,D1-D3 = 2 мм, D4-D5 = 200 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3 Применение четырех сегментации подходы к примеру наборов данных Шесть примеров наборов данных были Географическая всех четырех подходов:. Ручная отведенной поколения модели, руководство трассировки, автоматизированная плотность основе сегментации, и индивидуальный автоматизированный сегментации. Руководство отведенной поколение модели было эффективным для смолы встроенного витражное томографию стереоцилий (А), а целью было создать модель для количественных целей, а не для извлечения плотности. Для смолы встроен окрашенных томографию клеточной стенки растений (B), автоматизированные плотности на основе segmentaние было наиболее эффективным методом для быстрого извлечения целлюлозы через многие ломтиками, где, как ручные методы принимавших гораздо больше усилий лишь на нескольких ломтиков данных. Руководство отведенной поколение модели генерируются микротрубочек триплет в окрашенных томографии киноцилию (C) в то время как другие методы сегментации не сделал, еще две автоматизированные подходы извлечены плотности быстрее и были поэтому предпочтительным. Благодаря форме митохондрий от FIB-SEM молочной эпителиальных клеток (D), ручная трассировка при условии, что чистый результат, и низкую плотность населения в сочетании с использованием методов интерполяции, разрешенных для быстрой сегментации. Ввиду большого объема, который должен был быть сегментирован, индпошив автоматизированные сегментация оказался наиболее эффективным в сегменте бактерии данных SBF-SEM (E), но оба автоматические подходы были сопоставимы. Хотя много времени, единственный способ извлечь FIB-SEM молочной эпителиальных клеточной мембраны (F) был ручной трассировки масштабные линейки.:A1-A5 = 100 нм, B1-B5 = 100 нм, С1-С5 = 50 нм, D1-D5 = 500 нм, E1-E5 = 200 нм, F1-F5, бары = 500 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное рисунке.

Рисунок 4 Объективные характеристики изображения и субъективные личные цели для сортировке наборов данных. Использование примеры данных установить характеристики, критерии предлагается сообщить решение о том, какие сегментация подход использовать. Что касается объективных характеристик, данные могут по своей сути есть контраст, что является низким, средним или высоким (A1-A3), быть нечеткой или хрустящий (B1-B2), растянуты или переполнено (C1-C2), и есть комплекс или просто организованные особенности (D1-D2). Субъективные личные цели включают нужную O ЕЛЬ ориентации упрощенную модель или извлечения точные плотности (E1-E2), выявления замысловатую лист, запутанные объем, или линейный морфологию как функции интереса (F1-F3), выбирая высокую или низкую плотность населения в особенности интерес (G1-G2), и принятии решения о компромиссе между высокой верности и высокого ресурса, выделяемого для сокращающегося дохода на инвестиции, такие как время (H1-H2) масштабные линейки:. A1 = 50 нм, A2 = 1500 нм , А3 = 100 нм, В1 = 1500 нм, В2 = 200 нм, С1 = 100 нм, С2 = 200 нм, D1 = 10 мм, D2 = 200 нм, E1 = 100 нм, Е2 = 50 нм, F1-F2 = 500 нм, F3 = 50 нм, G1 = 100 нм, G2 = 1 мм, H1-H2 = 100 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

PX "/>
Рисунок 5 Сравнительная таблица характеристик данных и субъективным стремится подходит для различных подходов сегментации. Эта таблица суммирует сильные и слабые стороны каждого сегментации подхода. Критерии от рисунке 4 может помочь определить, какие наборы данных пригодны для какой метод сегментации. Эти объективные характеристики изображения и субъективные личные цели были выбраны для оптимального использования каждого подхода, но различные комбинации могут помешать или помочь эффективности сегментации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6 Решение блок-схему для эффективного тriage сегментации подходит для наборов данных с разными характеристиками. Исходя характеристики показано на Рисунке 4, эта диаграмма показывает, какие четыре критерия наибольший вклад в окончательном решении по лучшей сегментации подхода для каждого набора из рисунка 3 данных. Каждый набор данных цветом, чтобы быстро следовать смелые линии, представляющие процесс первичного принятия решений, а также пунктирные линии, которые отражают альтернативный путь, что может или не может привести к таким же подходом. Киноцилия, бактерии и наборы данных клеточной стенки растений лучше всего сегментирован с двух автоматизированных подходов. В отличие от этого, клеточных мембран и митохондрии пути всегда приводят к ручной трассировки в связи с их сложных характеристик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Эффективные стратегии для извлечения соответствующих функций от объемов 3D EM срочно необходимы для того, чтобы идти в ногу с цунами данных, который недавно попал биологической визуализации. В то время как данные могут быть получены в часах или днях, это занимает много месяцев, чтобы проанализировать объемы 3D в глубину. Таким образом, очевидно, что для анализа изображений стало препятствием для научных открытий; без адекватных решений для этих проблем, ученые изображений становятся жертвами собственного успеха. Это отчасти связано с высокой сложностью данных, а также макромолекулярный скученности обычно встречаются в биологических клетках, где белки и белковые комплексы границы друг с другом и по существу появляются в виде непрерывного градиента в оттенках серого плотностей. Проблема осложняется пробоподготовки и визуализации дефектов, а в некоторых случаях артефактов реконструкции изображений, что приводит к менее совершенным объемных данных, которые могут создавать проблемы для полностью автоматизированного подходаэс. Наиболее значимыми, однако, является тот факт, что эксперты в пробоподготовки, визуализации и биологической интерпретации редко хорошо разбираются в вычислительной науки, и, следовательно, требуют указания о том, как эффективно подойти извлечения и анализа функций. Поэтому, за счет использования различных примеров, протокол объясняет, как подготовить данные для сегментации, а также шаги, необходимые для ручной абстрактной поколения модели, автоматизированного плотности на основе сегментации, ручной отслеживания особенностей интерес, и индивидуальный автоматизированной сегментации. Ручные и автоматические подходы, изложенные в процедуре можно найти в большом разнообразии сегментации программного обеспечения, некоторые из которых упомянуты здесь, но другие выполняют сходные функции и одинаково хорошо подходит.

Полученные результаты показывают, что эффективность каждого из подходов 3D сегментации варьируется для каждого типа наборов данных. Несмотря на то, что различные подходы производства качественно сimilar 3D визуализации в качестве конечного продукта, количество времени и усилий, потраченных на каждом ходе процесса сегментации значительно варьировала. Рекомендации для соответствующих характеристик изображения и личных целей в сегментации подхода показаны на рисунке 5, который также пояснил, в следующих четырех подразделов. Эти критерии были применены к шести наборов данных, как показано на решение блок-схеме на рисунке 6. Несмотря на рисунках 5 и 6 являются лишь призвана обеспечить обоснование каждого набора входных данных и, как каждому из критериев были взвешены в процессе принятия решений, они не обеспечивают защиту от неправильной ориентации, а скорее как отправную точку. Есть просто слишком много критериев, которые влияют на процесс принятия решений: некоторые объективные критерии, такие как набор данных характеристик, в то время как другие являются более субъективные критерии, такие как желаемой цели. Можно с уверенностью сказать, что наборы данных, которые отображают высокий левэль контраста с острыми четкими границами, имеют особенности, которые хорошо разделены и относительно однородным (не слишком разнообразны), и обрабатываются с целью отображения модели плотности для большого числа объектов, автоматизированные подходы будут лучше, если бы не тот факт, что руководство подходы бы просто ресурс (время) -prohibitive. С другой стороны, если контрастность изображения низкая, данные размыто и, таким образом, требуется профессиональные знания, объекты переполнены, и особенности показывают большое разнообразие и, таким образом, неоднородны, не может иметь никакого другого выбора, чем ручной выделения признаков / сегментация.

Руководство Абстрагированная Модель Поколение

Руководство отведенной модель трассировки является особенно эффективным в сегментации линейные элементы, обеспечивая семена точек (шаров), которые могут быть автоматически подключенные (палочки). Такие шарики и палочки-модели может быть очень мощным, чтобы измерить длину ай ориентация такой модели и обеспечивают должным образом абстрагируется модель как для качественного осмотра и количественного анализа. Руководство отведенной поколение модели обычно используется при минимизации ресурсов, расходуемых на анализе важнее абсолютной верности формах исходных данных. Это самые успешные с линейными и однородными особенностями интерес (например, нити, трубки). Контрастность данных, четкость, и теснота не играют главную роль в определении успеха этого метода, до тех пор, как человеческий глаз может распознать объект интереса. Иногда такие модели также могут быть использованы в качестве скелета в сегменте Map 3D в зоне вокруг каркаса. Хотя модель является абстрактным, а не отражением точных плотностей, она представляет собой скелетонизированный версию плотности 3D и, таким образом, позволяет без беспорядков визуализации и качественного анализа. Количественные измерения, такие как длина может быть определена из приближенной модели. Дляпример программного обеспечения с ручной абстрактной модели поколения, пожалуйста, посетите подробную инструкцию химеры на сайте http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html .

Руководство Отслеживание Особенности интересов

Руководство трассировка кисть хорошо работает практически со всеми характеристиками данных, но это также самый трудоемкий метод. Порой, это единственный метод для извлечения интересующий объект из сложного набора изображений, содержащего большое разнообразие функций, таких как тонкого и замысловатого клеточной мембраны. Один полезный инструмент предоставляется в отдельных программ позволяет интерполяции между перерывами сегментированных ломтиками, когда особенность интерес изменяется плавно. Ручной трассировки могут быть применены наиболее эффективно, если данные свежий и имеет от средней до высокой контрастности, но он также может быть использовандля более сложных наборов данных, при условии, что пользователь знаком с объектом интереса. Сложность данных может варьироваться от дискретных объектов до сложных и многолюдных наборов данных, где объекты тесно упакованных. В последнем случае, руководство сегментация может быть единственным выбором, так как автоматические подходы часто борьба за сегмент нужную громкость и извлечь слишком много или слишком мало. Сложные особенность морфологии, такие как запутанные листов или объемов, также могут быть получены этим методом. Тем не менее, пользователь должен иметь в виду, что набор данных с нескольких сложных характеристик можно разделить только если плотность населения из особенностей интерес низкий, как сегментация высокой плотностью населения из особенностей интерес становится времени непомерно. В качестве примера программного обеспечения с ручной трассировки, пожалуйста, посетите подробную инструкцию Amira в Интернете по адресу http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.

Автоматизированная Плотность основе сегментации

В отличие от ручных методов, автоматизированных подходов, как правило, меньше времени, что является важным фактором при сегментации большой стек изображений. Однако простое определение порога не могут быть менее точными, и гораздо больше времени может быть потрачено на изысканности и курирование в автоматически Географическая объема. Автоматизированная сегментация плотность основе лучше всего работает на наборах данных, которые отображают большое количество сходных черт интересов, которые все требуют сегментацию. Если данные сложнее, эти автоматизированные методы могут до сих пор служат в качестве первого шага, но, скорее всего, потребует некоторого ручного вмешательства по линии для того, чтобы указать подтом содержащий функцию интереса. Эта стратегия, как правило, хорошо работает на линейных морфологии или извитых объемов, но это редко бывает успешным с тонких извитых листов, таких какклеточных мембран. Минимальное вмешательство пользователя с автоматизированными подходов позволяет сегментацию через больших или малых объемов, в то время как расходовать ограниченные ресурсы пользователя, такие как время в обмен на высокой точностью. В качестве примера программного обеспечения с автоматизированной сегментации плотности на основе, пожалуйста, посетите подробную инструкцию Amira в Интернете по адресу http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf .

Индивидуальный Автоматизированная Сегментация

Индивидуальный автоматизированный сегментация позволяет сетевой настройки алгоритмов для конкретного набора данных, но это часто специфичны для набора данных или типа данных, подходящих для ограниченного числа художественных характеристик, и не может быть легко обобщается. Процедура представлены здесь отличается от общих автоматизированных подходов сегментации, таких как водосборов погружения и другого уровня набор методов, которые полагаются на запрограммированной определения критических точек семян, а затем быстро маршируют расширения куба из этих семян пунктов. Вариация на эту тему граница сегментация, где градиент вектор информация сообщает границ объектов. В отличие от этого, настроить сценарий, который используется здесь, опирается на этапе подготовки, где пользователь вручную отслеживает несколько примеров. Через машинного обучения, конкретные алгоритмы обнаружения, а затем научиться самостоятельно распознавать свойства и характеристики данных последовательно найденные в следах. Опытные пользователи могут переквалифицироваться алгоритмы и повысить точность сегментации в том числе больше пример прослеживает, чтобы обеспечить больший набор критериев удобства. В целом, порогов и связанных с ними подходов, или даже Заказные подходы могут быть не столь полезно извлечь один признак интереса из образа со сложным разнообразием органелл или формы, как курирование может быть столь же трудоемким, как ручной трассировки.

Стратегии Установление очередности данных и Выбор Сегментация подход

Учитывая субъективные и объективные критерии, представленные на рисунке 4 и резюме подходящих наборов данных на рисунке 5, принятия решений схема изображена на рисунке 6 может помочь эффективной оценки стратегий извлечения признаков для большого разнообразия наборов данных. Наборы данных отбирали раненых в четырех последовательных решений, каждое из которых может включать любой один из четырех соответствующих целей, а также четырех субъективных критериев, введенных на рисунке 4. В качестве примера, на фиг.6 рационально сортировке каждого из данных шести наборы показано на рисунке 3. Несомненно, для каждого набора входных данных там нет ни одного единственный путь, а разные пути через эту матрицу следующие различных критериев для принятия решений, которые могут привести то том же или другом рекомендации для сегментации данных. В то время как каждый набор данных будет иметь свой собственный набор свойств, которые не могут быть ожидаемых, шесть примеры приведены, каждый в паре с объяснением причин для проведения предпочтительной особенностью добыча / сегментации подхода. Большинство также включать предложение для альтернативного решения маршруту которое влечет использования же или другом сегментации подхода (рисунок 6).

Киноцилия является хрустящие, установленные с четко определенными границами, что делает автоматизированные подходы больше шансов на успех данных. Все особенности интерес хорошо разделены, снова отдавая автоматизированный подход. Кроме того, особенности интерес представляют похожи друг на друга, что делает его относительно однородным набор данных идеально подходит для индпошив сегментации. Наконец, целью было извлечь весь функцию, в пользу полуавтоматического подхода. Как следствие, был сделан вывод о том, что автоматизированное определение порога (сплошная зеленая линия), а также специально разработанный (например, формировать под наблюдением сегментации) подход (пунктирная зеленая линия) оба скорее всего, чтобы преуспеть на этом наборе данных.

Аналогичные критерии, хотя размещены в другом порядке в сети принятия решений, обратиться в случае бактерий. Индивидуальный подход рекомендуется отчасти потому, что этот набор данных был очень большим; следовательно, ограниченные ресурсы запретить трудоемкую ручную вмешательство / сегментации подход. В то время как определение порога бы дали приемлемые результаты, специально разработанный подход смог выполнить основной цели в исследовании, чтобы отделить округлые бактериальные формы из внеклеточной металлических отложений, расположенных либо в промежутках между бактериями или в непосредственной близости от бактерий, и, следовательно, предпочтение было отдано индивидуальный подход.

Для наборов данных стереоцилий, первое рассмотрение было желаемая цель: цель может быть либо показать всю плотностьили создавать геометрические модели. Объем интерес был людном месте, и целью было сегменте большое количество объектов, как, разделенных объектов в тем, чтобы впоследствии выполнить количественную объемный анализ, в том числе длины, цифр расстояния, ориентации и т.д. Это было полезно, что объекты Интерес в основном линейный, и это сделало геометрическую модель трассировки метод выбора. Однако, если вместо цель в том, чтобы показать всю плотность, то линейная морфологию функции, а также относительно высокий контраст с резко обозначенными границами сделает автоматизированный протокол порога возможно.

Клеточные мембраны и случаи данных митохондрии являются сложными для автоматизированных подходов в связи с их категориями художественного морфологии: запутанная листы и объемы, соответственно. Цель состоит в том, чтобы проследить клеток или митохондрий очертания точно, но есть только ограниченные ресурсы, чтобы сделать это. Кроме того, особенности ИнтерПредполагаемое сложны и не могут быть легко определяется автоматически или форму в кодировке, хотя для данных митохондрии устанавливает индивидуальные сценариев подход, для бактерий, возможно, будет применяться с дальнейшей настройки. К счастью, мембрана и митохондрии сами представляют собой лишь малую долю от всего объема и, следовательно, руководство трассировка является прямым хотя трудоемкий подход. Руководство трассировка также методом выбора для таких наборов данных, когда контраст является довольно низким, а границы достаточно размыты. В результате, даже если они составляют значительную часть наборов данных, такие запутанные листы должны быть вручную проследить, просто за счет отсутствия лучшей альтернативы.

Набор данных завода поставлена свои собственные проблемы, потому что целью было сегмент все объекты, которые плотно расположены и составляют переполненный пейзажем. Показано плотность как есть позволит измерения о форме и организации объектов, но боскольку вручную сегментации каждый нитевидные объект слишком дорого, автоматический порога работал вместо.

Различные этапы и соответствующие результаты в создании 3D-модели были показаны здесь, но что более важно, характеристики данных и личные критерии нашел, чтобы быть решающим в определении лучший путь сегментации были также выяснены. Важными характеристиками данных изображения самого включают то, что описано здесь, как отличие, тесноту, резкости, и количество различных форм или функций (например, органелл, волокна, мембраны). Субъективные критерии, которые следует рассмотреть желаемой цели сегментации (измерения / подсчета, скелетонизирован представление данных / отображения томов 3D визуализации), морфологические характеристики функции интереса (линейный, удлиненные, сетевой, комплекс, запутанная), плотность особенности интерес в отношении всего объема (доля объектов, которыеважно и нужно быть извлечены), и балансировки компромиссы расходуя ресурсы к сегментации в верности исходных данных и убывающую отдачу от инвестиций в результате постепенных улучшений для существенно более высокой распределения ресурсов.

Поле сегментации изображений значительно повзрослел за последние годы, еще нет серебряной пули, ни алгоритм или программа, которая может сделать все это. Набор данных размеры выросли из сотен мегабайт в плановом порядке десятки гигабайт, и они в настоящее время начинают превышать терабайт, что делает ручной сегментации практически невозможно. Таким образом, больше ресурсов необходимо инвестировать в умных и временных эффективных подходов извлечения признаков, которые имитируют процесс принятия решений человека. Такие усилия должны быть объединены с (1) географические информационные системы (ГИС) основе семантических иерархические базы данных (по аналогии с Google Earth), (2) методы извлечения данных (т.е., переходот вокселе к геометрического представления / объемного), совместимого с компьютерной помощь проектирования (САПР) программного обеспечения для того, чтобы значительно сократить объем данных, и, таким образом, позволяя отображать больших объемах ^35, (3) методы моделирования, так как они часто используются в инженерных дисциплин, а также (4) Продвинутая анимация и кино решений возможности, в том числе анимации пролета (по аналогии с тем, что разработана для игровой индустрии).

Очевидно, эффективность выделения признаков и сегментация лежит в основе этого грядущей революции в визуализации клетки с высокой разрешающей способностью, и в то время лучше всего подходит всегда будет необходимо, принципы, представленные здесь, а также примеры того, что подход был принят для различных типов данных , обеспечит некоторую ценную информацию для принятия решения о какой подход следует принять.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amira	FEI Visualization Sciences Group		http://www.vsg3d.com/amira/overview
Chimera	UCSF		http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Fiji/ImageJ	National Institute of Health		http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/
IMOD	Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells		http://bio3d.colorado.edu/imod/
Photoshop	Adobe		http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html
MATLAB	MathWorks		http://www.mathworks.com/
VLFeat	VLFeat		http://www.vlfeat.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Auer, M. Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine. J Mol Med (Berl). 78 (4), 191-202 (2000).
Johnson, M. C., Rudolph, F., Dreaden, T. M., Zhao, G., Barry, B. A., Schmidt-Krey, I. Assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography. Journal of visualized experiments JoVE. (44), e1846 (2010).
Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. Journal of visualized experiments JoVE. (76), e50386 (2013).
Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. Structure of HIV-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction. Journal of visualized experiments JoVE. (54), e3041 (2011).
Chen, S., McDowall, A., et al. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. Journal of visualized experiments JoVE. (39), e1943 (2010).
Meyerson, J. R., White, T. A., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments JoVE. (58), e2770 (2011).
Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
Bajaj, C., Yu, Z., Auer, M. Volumetric feature extraction and visualization of tomographic molecular imaging. J Struct Biol. 144 (1-2), 132-143 (2003).
Lin, G., Adiga, U., Olson, K., Guzowski, J. F., Barnes, C. A., Roysam, B. A hybrid 3D watershed algorithm incorporating gradient cues and object models for automatic segmentation of nuclei in confocal image stacks. Cytometry A. 56 (1), 23-36 (2003).
Volkmann, N. A novel three-dimensional variant of the watershed transform for segmentation of electron density maps. Journal of Structural Biology. 138 (1), 123-129 (2002).
Rigort, A., Günther, D., et al. Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks. Journal of structural biology. 177 (1), 135-144 (2012).
Cremers, D., Rousson, M., Deriche, R. A Review of Statistical Approaches to Level Set Segmentation. Integrating Color, Texture, Motion and Shape. International Journal of Computer Vision. 72 (2), 195-215 (2007).
Lin, Z., Davis, L. S. Shape-based human detection and segmentation via hierarchical part-template matching. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 32 (4), 604-618 (2010).
Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
Zhang, Q., Bettadapura, R., Bajaj, C. Macromolecular structure modeling from 3D EM using VolRover 2.0. Biopolymers. 97 (9), 709-731 (2012).
Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
Heymann, J. A. W., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of structural biology. 155 (1), 63-73 (2006).
Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2588 (2011).
Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chemical Geology. 261 (3-4), 217-229 (2009).
Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
Frangakis, A. S., Hegerl, R. Noise reduction in electron tomographic reconstructions using nonlinear anisotropic diffusion. Journal of structural biology. 135 (3), 239-250 (2001).
Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. Journal of Structural Biology. 144 (1), 114-122 (2003).
Van der Heide, P., Xu, X. P., Marsh, B. J., Hanein, D., Volkmann, N. Efficient automatic noise reduction of electron tomographic reconstructions based on iterative median filtering. Journal of structural biology. 158 (2), 196-204 (2007).
Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
MathWorks. MATLAB. , (2012).
Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. Systems, Man and Cybernetics, IEEE Transactions on. 9, 62-66 (1979).
Vedaldi, A., Fulkerson, B. VLFeat: An Open and Portable Library of Computer Vision Algorithms. , (2008).
Zhu, S. C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. What are Textons? International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).
Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).
Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).
Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
Shin, J. B., Krey, J. F., et al. Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle. Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).
Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta. Journal of Information & Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).

Bioengineering

От вокселей к знаниям: Практическое руководство по сегментации комплекс электронной микроскопии 3D-данных

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.