Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מvoxels לידע: מדריך מעשי לפילוח אלקטרונים מורכבים מיקרוסקופית 3D-Data

Published: August 13, 2014 doi: 10.3791/51673
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3, 1, 1, 1,2
1Life Sciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, 2Joint Bioenergy Institute, Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, 3National Energy Research Scientific Computing Center, Lawrence Berkeley National Laboratory

Summary

צוואר הבקבוק במיקרוסקופ האלקטרונים 3D סלולארי הוא הבלטת תכונות (פילוח) במפות צפיפות 3D המורכבות ביותר. פיתחנו סדרה של קריטריונים, אשר מספקת הנחיות באשר אשר גישת פילוח (ידנית, חצי אוטומטי, או אוטומטי) היא מתאים ביותר עבור סוגי נתונים שונים, ובכך לספק נקודה מוצא לפילוח יעיל.

Abstract

גישות במיקרוסקופ אלקטרונים 3D מודרניות לאחרונה אפשרו תובנה חסרת תקדים לתוך ארגון ultrastructural 3D של תאים ורקמות, המאפשרות ההדמיה של מכונות macromolecular גדולות, כגון מתחמי הידבקות, כמו גם מבנים מסדר גבוה, כגון שלד התא ואברונים תאיים בהם תא המתאים והקשר רקמה. לאור המורכבות האינהרנטית של כרכים סלולריים, זה חיוני כדי לחלץ תחילה את התכונות של עניין, על מנת לאפשר להדמיה, כימות, ולכן הבנה של הארגון שלהם 3D. כל קבוצת נתונים מוגדרת על ידי מאפיינים ברורים, לדוגמא, יחס, אות לרעש פריכות (חדות) של נתונים, ההטרוגניות של התכונות שלו, צפיפות של תכונות, נוכחות או עדר של צורות אופייניות המאפשרות זיהוי קל, ואחוז של כל הנפח שאזור ספציפי של עניין תופס. כל המאפיינים האלה צריכים להילקח בחשבוןכאשר מחליט על שמתקרב לקחת לפילוח.

שש ערכות נתונים ultrastructural השונות 3D שהוצגו התקבלו על ידי שלוש הדמיה שונה גישות: טומוגרפיה של אלקטרון צבעוני משובצת שרף, התמקדה יון beam- ומיקרוסקופיה בלוק סדרתי סריקת פרצוף אלקטרון (FIB-SEM, SBF-SEM) של דגימות המעטה מוכתמות ומוכתמות בכבדות , בהתאמה. עבור ערכות נתונים אלה, ארבע גישות פילוח שונות יושמו: (1) בניית מודל מלא הוראות ואחרי אך ורק על ידי הדמיה של המודל, (2) פילוח מעקב הידני של נתונים ואחריו משטח טיוח, (3) גישות אוטומטיות למחצה ואחרי על ידי עיבוד פני השטח, או אלגוריתמי פילוח (4) אוטומטיים אישית מעוצבת ואחרי עיבוד פני השטח וניתוח כמותי. בהתאם לשילוב של מאפייני ערכת הנתונים, נמצא כי בדרך כלל אחד מארבע גישות קטגורי אלה בביצועיו לאחרים, אבל תלוי ברצף של קריטריונים המדויקים, מוגישה מחדש מאשר אחד עשויה להיות מוצלחת. על סמך נתונים אלה, אנו מציעים תכנית קביעת סדרי עדיפויות שמסווגת את שני מאפייני מערך נתונים אובייקטיביים וקריטריונים אישיים הסובייקטיבית לניתוח ערכות נתונים השונים.

Introduction

באופן מסורתי, במיקרוסקופ האלקטרונים שדה (EM) היה מחולק ל1) סניף הביולוגיה המבני באמצעות TEM ברזולוציה גבוה וסופר גבוה, בשילוב בדרך כלל עם מידע סמוי או מפורש בממוצע כדי לחקור את המבנה תלת ממדים (3D) של קומפלקסי macromolecular עם הרכב מוגדר ובדרך כלל גודל קטן יחסית 1-4, ו2) סניף ההדמיה הסלולרי שבנופים סלולריים כולו הם דמיינו 1,5,6. בעוד ענף הביולוגיה המבני עבר פיתוח מרהיב בארבעת העשורים האחרונים, ענף הביולוגיה של התא היה בעיקר מוגבל לשני ממדים, לעתים קרובות על דגימות פחות מ-אופטימלי נשמרו. רק עם כניסתו של טומוגרפיה של האלקטרון בעשור האחרון יש הדמיה ultrastructural תא ביולוגית הורחבה לתוך הממד השלישי 5,7, שבו בדרך כלל בממוצע לא יכול להתבצע כנופים סלולריים, ובכך התכונות של עניין, הם בדרך כלל ייחודיים.

למרות סצנות סלולריות דמיינו לעתים קרובות מדהימות לעין, מיצוי יעיל של התכונות של עניין וניתוח כמותי שלאחר מכן כרכים סלולריים המורכבים ביותר כגון לפגר, בין שאר משום שהרכב החלבון המדויק הוא בדרך כלל לא ידוע, ולכן עושה את זה מאתגר לפרש סלולארי אלה כרכי 3D. למועד זה, מומחיות ביולוגית נרחבת יש צורך לעתים קרובות כדי לפרש tomograms המורכב, או אפילו לזהות את האזורים החשובים ומרכיבים חיוניים בנפח 3D. כסיבוך נוסף, ויזואליזציה של כרכי 3D להפליא לא טריוויאלית. ניתן לחשוב כרכי 3D של וכך דמיינו כערימות של תמונות 2D. בדיקת Slice-by-פרוסת תמונות 2D רציפות מפחיתה את המורכבות, אך הוא גם גבולות כוללים חילוץ וניתוח ובכך כמותי לשני ממדים. עם זאת, עבור רוב אובייקטי 3D, התיאור של כרכי 3D רק כערימה של מטוסים ברציפות מובילה לשלמהפרספקטיבה מעוותת ד אל טבע 3D של מערכת מסוימת. צורות אלטרנטיביות לבדיקה ויזואלית דורשות גם טיוח נפח או משטח טיוח, ש- בהתחשב באופי לעתים קרובות הצפוף של סלולארי נפח-יכול בקלות להוביל להשקפה חסומה של אובייקטים מקוננים או להציף משתמש לחלוטין, ובכך פילוח ידני אינטראקטיבי קשה.

כדי לתקן את החסמים אלה, מגוון גדול של חילוץ תכונה אוטומטי גישות (פילוח) פותחו שהן בדרך כלל גם density- או 8-10 מבוסס שיפוע. עם זאת, שיטות אלה נוטים למגזר כולו הנפח ללא קשר לאילו תחומים או תכונות הן עניין למומחה, אם כי חלק מהשיטות האחרונות יכולות למקד תכונה ספציפית של עניין, כגון סיביים אקטין 11. בנוסף, תוכניות ביצוע פילוח אוטומטי יכולות לפעמים לגרום לייצור של מספר רב של כרכי משנה (לדוגמא, בעת החלת immersio קו פרשת מיםn פילוח) שלעתים קרובות צריך להיות ממוזגים ידני בחזרה הלמרכיב את כל התכונה של עניין או להיות חשוף לפילוח נוסף. זה נכון בעיקר עבור ערכות נתונים מורכבות וצפופות, וכך האלגוריתמים ביותר טיוח אינם מסוגלים לחלץ רק את התכונות של עניין בנאמנות, ומאמצי אוצרות משמעותיים על ידי מומחה לעתים קרובות יש צורך לייצר רצוי נפח מפולח.

יתר על כן, פתרונות מותאמים אישית לבעיה מאוד ספציפית, לעתים קרובות שפורסמו כנייר מפגש מדעי, עם לא מעט דגש על הפיכתם רחבה וכלים מקיפים נגישים לחוקרים שאין להם ידע אינטימי של תחומי מתמטיקה, מדעי מחשב ו / או גרפיקה ממוחשבת. סביבת תוכנת תכנות להתאמה אישית, המכילה מגוון רחב של ספריות ניתוח תמונה, יכולה להיות קבוצת כלי רבת ​​עוצמה המאפשרת למשתמשים לכתוב מודולים שלהם בצורה יעילה לפילוח מדויק. עם זאת, גישה זו דורשת שלוחההכשרת ensive ורקע במדעי מחשב כדי לנצל את התכונות או היכולות לניתוח תמונה רבות שלה. אחד יכול לעבוד בתוך כגון סביבת תוכנה תכליתית עבור קבוצות מסוימות הנתונים שבו התכונות דלילות יותר, למשל, על ידי שימוש בגישות המבוססת על צורה רבות עוצמה הנשענות על הגיאומטריה הייחודית של "תבניות" כדי להפריד בין אובייקטים של עניין מסביבתם 12,13 .

מגוון הוגן של הדמיה חבילות גרפיקה ממוחשבת קיימים לפילוח ידני אינטראקטיבי ובניית מודל. חלק מהחבילות זמינות מסחרי, ואילו אחרים הם ממוצא האקדמי ומופצים ללא תשלום, כגון: אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו 14 כימרה, אוניברסיטת קולורדו 15 IMOD, ואוניברסיטת טקסס אוסטין VolumeRover 16. עם זאת, מגוון ומורכבות הרחב של תכונות ויכולות תוכניות אלה יש steepens העקומה למידה עבור each. תוכניות הדמיה מסוימות לספק מודלים גיאומטריים פשוטים, כגון כדורים ומקלות בגדלים שונים, אשר יכול להיות ממוקם בתוך מפות צפיפות על מנת ליצור מודל מופשט של המורכב 3D הנפח. מודלים אלה לאחר מכן לאפשר מדידות גיאומטריות ונפח פשוטים ולכן מעבר לרק "תמונה היפה". מעקב ידני כזה של אובייקטים עובד היטב עבור כרכים שבו רק מספר קטן של אובייקטים צריך להיות נעוצה וחילוץ. עם זאת, הפיתוח האחרון של ההדמיה ultrastructural 3D נפח הגדול תוך שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק אלומת יונים ממוקד (FIB-SEM) 17-20 או במיקרוסקופ אלקטרונים פנים סריקת בלוק סדרתי (SBF-SEM) 21 מציג את הסיבוך נוסף שהגודל של נתוני 3D סטים יכולים לנוע בין ג'יגה לעשרות ומאות ג'יגה, ואפילו טרה. לכן, כרכי 3D גדולים כזה הם כמעט בלתי נגישים להבלטת תכונות ידניות, והישג אוטומטי למחצה מודרך משתמש יעיל ומכאןחילוץ יור יהיה אחד מצווארי הבקבוק לניתוח יעיל של כרכי 3D בעתיד הנראה לעין.

מוצג כאן ארבע גישות פילוח שונות המשמשות באופן שיגרתי במגוון רחב של סוגים ביולוגיים תמונה. אז שיטות אלה בהשוואה ליעילותם לסוגים שונים של ערכות נתונים, המאפשרות הידור למדריך כדי לעזור לביולוגים להחליט מה עשוי להיות גישת הפילוח הטובה ביותר להפקת תכונה יעילה של הנתונים שלהם. כמדריכים למשתמש מפורטים זמינים עבור רוב התוכניות המתוארות, המטרה היא לא להפוך את המשתמשים פוטנציאליים מכירים כל אחד מהחבילות אלה בפרט. במקום זאת, המטרה היא להפגין את העוצמות ומגבלות בהתאמה של אסטרטגיות פילוח השונות אלה על ידי יישום אותם לערכות נתונים שש דוגמא עם מאפיינים שונים. באמצעות השוואה זו, סדרה של קריטריונים פותחו המבוססות גם על מאפייני תמונה האובייקטיביים שלערכות נתונים 3D, כגון ניגוד נתונים, פריכות, צפיפות, ומורכבות, או נובעים משיקולים סובייקטיביים, כגון מטרה הרצויה עבור פילוח, מורפולוגיות של התכונות כדי להיות מקוטעות, צפיפות אוכלוסייה של התכונות של עניין, כלומר את החלק היחסי של הנפח תפוס על ידי התכונה של עניין, ואיך הוא יתקדם בצורה אופטימלית עם משאבים מוגבלים, כגון זמן וזמינות של צוות. ערכות נתונים אלה שונים דוגמא ממחישות כיצד ניתן ליישם קריטריונים אובייקטיביים וסובייקטיביים אלה ברצף במגוון רחב של שילובים כדי להניב זיווג של גישות חילוץ תכונה מסוימות עם סוגים מסוימים של ערכות נתונים. ההמלצות ניתנו יהיה בתקווה לעזור טירונים מתמודדות עם מגוון גדול של אפשרויות פילוח לבחור את גישת הפילוח היעילה ביותר עבורו 3D הנפח שלהם.

למרות ההתמקדות של מאמר זה הוא הבלטת תכונות, תשומת לב לאיסוף נתונים ועיבוד נתונים מראש הוא קריטי לים יעילegmentation. לעתים קרובות הכתמה של דגימות יכולה להיות לא אחידה, ולכן, יש לשקול חפצים מכתים פוטנציאליים בהליך הפילוח. עם זאת, כתם בדרך כלל נותן אות לרעש גבוהה יותר, ולכן דורש פחות סינון וטיפול מתמטי אחר של כרכים סלולריים, אשר עלול גם לגרום לחפצים. ערכות נתונים תמונת הגלם המתאימות צריכה להיות שנרכשו בהגדרות קונטרסט ופיקסל מצלמה הנכונות, מיושר, ושחזרו ל3D נפח. לtomograms, תמונות מיושרות משוחזרות בדרך כלל באמצעות משוקללת בחזרה הקרנה, ולאחר מכן ערכת הנתונים היא בדרך כלל נתון לאלגוריתמי denoising כגון דיפוזיה אינה ליניארי איזוטרופי 22, סינון דו צדדי 23, או חציון רקורסיבית סינון 24. נתוני הדמיה FIB-SEM וSBF-SEM מיושרים ידי פרוסות ברציפות מקשר צולבות בXY תוכניות ניצול כגון ImageJ 25. שיפור לעומת וסינון ניתן ליישם כדי לשפר את התכונות שלריבית ובכך לבטל את רעש ערימת התמונה. סינון יכול להתבצע גם על כל הנפח לפני subvolume בחירה או על subvolumes נבחר, כגישות סינון יכולות להיות המחשוב יקרה. Down-הדגימה של נתונים (binning), אשר לעתים משמש להפחתת רעש ו / או צמצום גודל קובץ, מומלץ רק אם הנתונים כבר oversampled באופן משמעותי בהשוואה להחלטה הצפויה.

לאחר הפחתת רעשים, אז יכולות להיות מפולחות התמונות מעובדות על ידי שיטות שונות, ולהתמקד במחקר זה הוא על ארבעה אלה: (1) דור מופשט מדריך למודל באמצעות יצירת מודל כדור מקל ו, (2) מעקב ידני של תכונות של עניין, (3) צפיפות מבוססת סף אוטומטי, ו (4) פילוח אוטומטי בהתאמה אישית באמצעות תסריט לפילוח ספציפי פרויקט. פילוח גבול 8 ופילוח פרשת המים immersive 10 חלופות טובות יותר לקביעת ערכי סף פשוט, אבל לאהיי שייך לאותה קטגוריה, ולא נכלל באופן מפורש בדיון הזה.

מעקב ידני של צפיפויות דורש מתאר את התכונות של עניין, לחתוך-by-פרוס, המאפשר השמירה של הצפיפות המקורית של אזורי משנה הסלולר בהתאמה. גישה זו מאפשרת שליטה מקסימלי בתהליך הפילוח, אבל היא תהליך מייגע ועתירת עבודה.

אוטומטי גישות פילוח צפיפות (וקשור) המבוסס על סף הן חצי אוטומטיות, שבו אלגוריתם בוחר פיקסלים המבוססים על סט של פרמטרים המוגדר על ידי משתמש. כמה חבילות אקדמיות (חינם) להדמיה, כגון קליפורניה בסן פרנסיסקו כימרה, IMOD, פיג'י 26, וVolumeRover זמינות, כמו גם מסחריות (הדורשות רישיונות בתשלום) חבילות, ושני הסוגים בדרך כלל כוללים אחד או יותר מהגישות פילוח אלה. חבילות התוכנה המשמשות בעבודה זו כדי להמחיש שיטות שונות אלה כוללות שני תוכניות מסחריות וים פתוח אקדמיתוכניות ource לידניות יצירת מודל מופשט, כמו גם פילוח צפיפות ידני ואוטומטי. עם זאת, תוכנת קוד פתוחה יכולה לפעמים להציע אפשרויות מתקדמות יותר באמצעות האפשרות של התאמה אישית.

השוואה של טכניקות אלה באמצעות סוגים שונים של ערכות נתונים הובילה למצגת הבאה של כללים וההנחיות כיצד לפנות לפילוח של כרכי 3D נתונים ביולוגיים מגוונים, אשר למיטב ידיעתנו טרם פורסמו. לפיכך, זה הוא ההשוואה השיטתית הראשונה של הגישות השונות והתועלת שלהם על ערכות נתונים עם משתנה מאפיינים עבור משתמשים עם מטרות שונות.

Protocol

.1 מופשט ידני דגם דור

הערה: הפרטים של המתודולוגיה שתוארו להלן הם ספציפיים לכימרה, אבל חבילות תוכנה אחרות, ניתן להשתמש במקום. השתמש בגישה זו כאשר המטרה היחידה היא ליצור מודל גיאומטרי (לדוגמא, מודל כדור ומקל) על מנת לבצע מדידות גיאומטריות, ולא בו מוצגות צורת הנפח של האובייקטים.

  1. לייבא נתונים הנפח לתכנית מתאימה לדור מודל מופשט במדריך.
    1. בחר קובץ> מפה להרחיב למשוך את הדו שיח פתיחת קובץ. נווט אל מיקום הקובץ של המפה הרצויה.
    2. משוך את Viewer הנפח (כלים> נתונים נפח> Viewer נפח) ותכונות נבחרות> תצורת תצוגה כדי להציג נתונים עם סגנונות טיוח שונים.
    3. התאם את הסף לתצוגה על ידי גרירת הקו אנכי על ההיסטוגרמה בViewer הנפחחלון.
  2. לנווט 3D הנפח (למשל, פרוסה אחרת פרוסה) כדי לבחור את תחומי עניין של פילוח ולחתוך החוצה בנפח קטן יותר ממידת צורך.
    1. בשיח Viewer נפח, לחץ על ציר, ולאחר מכן בחר X, Y, או Z.
    2. בשיח Viewer נפח, לבחור תכונות> מטוסים. בלחיצה אחת כדי להגדיר עומק כדי להציג את המטוס המתאים למספר בתיבה משמאל, ולחץ על הכל כדי להציג את כל המטוסים.
    3. בשיח Viewer נפח, תכונות בחרו> בחירת אזור משנה.
      1. לחץ וגרור כדי ליצור תיבה מלבנית סביב האזור של עניין.
  3. הנח סמנים לאורך התכונה של עניין ולחבר אותם עם linkers המקום שמתאים (לעתים קרובות נעשה באופן אוטומטי על ידי התכנית) עד המודל הוא מלא.
    1. משורת תפריטי Viewer נפח, בחרו באפשרות כלים>הדו שיח Tracer נפח כדי לפתוח את הדו שיח Tracer הנפח. בשיח Tracer נפח, בחר File> New מרקר סט.
    2. בשיח Tracer נפח, לבדוק עכבר> סמני מקום באיכות גבוהה, סמני מקום על מטוסי נתונים, העברה ושינוי גודל סמנים, סמן חדש קישור לסמן נבחר, וקישור שנבחר ברצף סמנים.
    3. לחץ על דוגמת צבע הסימון, ובחר צבע. חזור על שלב זה לצבע קישור.
    4. הזן רדיוסים לאלמנטי בניית מודל הסמן וקישור.
    5. בחלון Tracer נפח, בחר סמני מקום באמצעות [נכון] לחצן עכבר, ולהכניס את רדיוס לסמנים וקישורים.
    6. לחץ לחיצה ימנית על נפח הנתונים כדי להתחיל בהנחת סמנים. סמנים יהיו מחוברים באופן אוטומטי.
    7. בשיח Tracer נפח, בחר File> Save סט סמן נוכחי, ולאחר מכן קובץ> סט סמן לסגור.
    פתח סט סמן חדש (שלב 1.3.1) כדי להתחיל בבניית מודל לתכונה רצויה שנייה של עניין. לנצל צבעים מנוגדים בין סטי סמן כדי להדגיש את ההבדלים בתכונות.

2 איתור ידני של תכונות של ריבית

הערה: הפרטים של המתודולוגיה שתוארו להלן הם ספציפיים לאמירה, אבל חבילות תוכנה אחרות, ניתן להשתמש במקום. השתמש בגישה זו כאשר צפיפות האוכלוסייה היא קטנה יחסית, וכאשר הדיוק של הבלטת תכונות הוא בעל חשיבות עליונה, כמעקב ידני היא גישה גוזל זמן.

  1. נתוני יבוא נפח לתכנית עם אפשרויות מעקב ידניות. תוכנה עם יכולת זו, בדרך כלל, מציעה לפחות כלי מכחול בסיסי.
    1. עבור אמצעי אחסון או tomograms גדולים (למשל, 16 סיביות 2,048 x 2,048 או יותר .rec או .mrc tomograms שנוצר בIMOD): בחר באפשרות פתח נתונים> לחץ לחיצה ימנית על filename.rec> פורמט ...> בחרו גלם כLargeDiskData אוקי> Load. בחר גלם מתאים נתונים פרמטרים מפרטי כותרת> אוקי. לעבור ושמירה בשם חדש filename.am קובץ לשימוש בשלבים הבאים.
    2. לקבצים קטנים יותר תמונת 3D מחסנית (למשל, .tif 3D או .mrc או .rec): Open Data> filename.tif או filename.mrc בחר. Toggle ועכבר לחץ> שמירה בfilename.am. אם שגיאה מופקת או התכנית אינה מגיבה, הקובץ עשוי להיות גדול מדי וניתן לפתוח על ידי ביצוע הצעד 2.1.1.
  2. לנווט את הפרוסות כדי לבחור תת נפח 3D לפילוח, ולאחר מכן לחתוך לאזור זה של עניין.
    1. בחלון 3D Viewer, בחר Orthoslice כדי לפתוח קובץ תמונה. השתמש במחוון בתחתית כדי לנווט פרוסות.
    2. לחיתוך נתונים גדולים יותר נפתחו כLargeDiskData, לעבור שם קובץ בחלון בריכה> לחץ לחיצה ימנית> LatticeAccess. Enter גודל תיבה רצוי> החל. שמור את הקובץ חדש.
  3. צור קובץ פילוח.
    1. לעבור את הקובץ בחלון הבריכה> לחיצה ימנית בעכבר> סימון> LabelField. קובץ חדש ייווצר ונטען באופן אוטומטי בכרטיסיית פילוח העורך.
  4. עקוב אחר הגבול של התכונה הראשונה של עניין, ולאחר מכן למלא את העקבות על ידי יד או על ידי שימוש בפקודה ספציפית לתוכנה המשמשת. בצע את התכונה של עניין בכל הפרוסות וחזור על פילוח המעקב הידני. השתמש בפקודות הבאות בעת השימוש באמירה:
    1. כדי להשתמש בכלי מברשת הצבע, לשנות את גודל מברשת כרצוי, ולאחר מכן להשתמש במצביע העכבר כדי לאתר את הגבול של התכונה של עניין.
    2. מלא את האזור איתר עם "F" קיצור. מוסיף את הבחירה על ידי לחיצה על הכפתור עם סימן חיבור, או "" קיצור הדרך. במידת צורך, לחץ על "U" כדי לבטל, ו" s "כדי להפחית או למחוק.
    3. צור עיבוד פני השטח להדמיה ואיכותי בסיסיים או ניתוח כמותי להדרכת מדריך למשתמש תוכנה.
      1. בכרטיסיית בריכת האובייקט, לעבור את שם הקובץ-labels.am בחלון הבריכה> לחץ לחיצה ימנית> SurfaceGen.
      2. בחר מאפייני פני שטח רצויים> החל. Filename.surf קובץ חדש ייווצר בברכה.
      3. כדי להמחיש את עוצמת הקול המפולח, לעבור filename.surf בחלון בריכה> לחץ לחיצה ימנית> SurfaceView.
      4. השתמש בכלים בחלון 3DViewer לנוע, לסובב, ולהתמקד בנפח 3D.
    4. חלץ את הצפיפות המדויקת ולקבוע מדידות כגון אזור נפח או משטח. יצוא לתוכניות אחרות עבור תצוגה מתקדמת יותר, ניתוח וסימולציה.
      1. על חלון 3DViewer, לחץ כלי מדידה> בחר באפשרות מתאימה (אורך 2D וזווית 2D למדידות במישור 2D בודד, אורך 3D 3D וזוויתלמדידות בנפח 3D).
      2. לחץ על משטח רשת כדי למדוד אורך הרצוי, מרחק, וזוויות. הערכים יופיעו בחלון מאפיינים.

    .3 פילוח מבוסס צפיפות אוטומטית

    הערה: הפרטים של המתודולוגיה שתוארו להלן הם ספציפיים לאמירה, אבל חבילות תוכנה אחרות, ניתן להשתמש במקום.

    1. להשתמש בגישה זו על ערכות נתונים עם כל מגוון של ניגוד, פריכות, או צפיפות לסגת הצפיפויות של עניין.
    2. נתוני יבוא נפח לתכנית מצוידת בקביעה ערכי סף, שרביט קסמים, או כלים מבוססי צפיפות אחרים לפילוח אוטומטי. בצע את הפעולות מפורטות ב2.1-2.1.2 בכיוונים למעקב ידני.
    3. לנווט פרוסות ובחרו אזור לפילוח. במידת צורך, לחתוך את משנה נפח 3D קטן יותר לפילוח. בצע את הפעולות מפורטות ב2.2-2.2.2 בכיוונים למעקב ידני.
    4. בחר את הצפיפות שלתכונה של עניין, בדרך כלל על ידי לחיצה או הצבת נקודת סימן או עוגן בתכונה. אם אפשר בתוכנה, להיכנס לטווח מספרים המקיף את עוצמת פיקסל של התכונה ולהתאים סובלנות זה כרצונכם. צפיפויות השייכים לתכונה תהיה נטלו בהתאם לעוצמת ערך פיקסל או סובלנות של העוגן. השתמש בפקודות הבאות בעת השימוש בעמירה.
      1. השתמש בשרביט קסמי הכלי לתכונות עם שוליים להבחין.
        1. לחץ על השטח של עניין, ולאחר מכן להתאים את המחוונים בתצוגה ומיסוך כדי ללכוד מגוון נכון של ערכים, כך שהתכונה מודגשת באופן מלא. הוסף בחירה עם "" קיצור הדרך.
      2. השתמש בכלי הסף לתכונות ללא שוליים ברורים להבחנה.
      3. בחר את סמל הסף. התאם מחוון כדי להתאים צפיפות בטווח רצוי, כך שרק התכונות של עניין הם רעולי פנים. לחץ על לחצן בחר, ולאחר מכן להוסיף את הבחירה עם קיצור דרך220; ".
      4. לכל נפח מקטע, בחר באפשרות כל הפרוסות לפני הוספת בחירה.
      5. כדי להסיר רעש, פילוח בחר> הסר האיים ו / או פילוח> תוויות חלקות.
    5. צור משטח להדמיה וניתוח איכותי כפי שתואר בסעיף המעקב הידני 2.6-2.6.2. אם תרצה בכך, יצוא לתוכניות אחרות לתצוגה נאותה 3D, ניתוח כמותי וסימולציות.

    .4 בהתאמה אישית אוטומטי פילוח

    הערה: השתמש בגישה זו כדי ליצור תסריטים מותאמים אישית עבור פילוח אוטומטי, שדורש ניסיון רקע במדעי מחשב, אבל מאפשר את היכולת ליצור מודל מדויק צפיפות מהיקף גבוה.

    1. כלי עבודה (דוגמא ספציפית של פילוח בפיקוח צורה ב27 MATLAB)
      1. עיבוד מראש תמונה: שיפור תמונה לבצע דה noising, הסרת ורקעעל ידי שימוש בצינור הבא:
        1. טען את התמונה באמצעות פקודת imread.
          1. בשורת הפקודה, הזן: >> im = imread (image_path $), שבו image_path $ הוא המיקום של התמונה להיות מנותחת.
        2. מארגז הכלים לעיבוד התמונה, קורא סינון וינר באמצעות יחס משוער או ידוע רעש כוח לאות (NSR).
        3. בתמונה המעובדת בעבר, לקרוא לפונקצית פתיחת תמונת imopen להעריך את שכבת הרקע, ולאחר מכן להקצות את התוצאה כמסיכה שונה.
          1. בשורת הפקודה, הזן:. >> רקע = imopen (im, strel (shape_string $, גודל $)), בשיטה זו, shape_string $ שווה ל'דיסק '$ משתנים גודל ניתן על ידי המנתח כלומר >> רקע = imopen (im, strel ('דיסק', 15)).
        4. הפחת את התמונה מסוננת עם הרקע.
          1. בשורת הפקודה, הזן: >> im2 = im -רקע
        5. תלוי באיכות של התוצאות, לבצע נורמליזציה תמונה עם או בלי השיטה של Otsu אדפטיבית 28, אשר יכול להיקרא באמצעות imadjust הפונקציה מעיבוד תמונת ארגז כלים.
          1. בשורת הפקודה, הזן: >> im3 = imadjust (im2)
        6. הכן את התכונות של עניין לפילוח, המגביל את האזורים של עניין על ידי חיתוך התמונה המנורמלת.
          1. באמצעות פקודת imtool, לחקור את האזור של עניין שהוא לחיתוך ולספק את הקואורדינטות לפקודה: >> im3_crop = imcrop (im3, [y2 x2 y1 x1]), שבו [y2 x2 x1 y1] הווקטור מתאים ל אזור הכיכר לחיתוך.
      2. לעצב את ההכרה / סיווג צורה מפוקחת: רכבת האלגוריתם על ידי מתן דוגמאות ספציפיות לכל קטגוריה של חפצים שונים (עקבות ליניארי בתמונת 2D על פני התכונות של עניין).
        1. בדוק שVLFEAT 29 API הותקן בהצלחה ולבקר באתר האינטרנט של VLFEAT לתיעוד מעמיק יותר.
        2. בשורת הפקודה, הזן: >> [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, K $, NLEAVES $) כאשר K $ הוא מספר האשכול כדי לשמש או מספר כיתות המשקיף רוצה לארגן את הנתונים ל, וNLEAVES $ הוא המספר הרצוי של אשכולות עלה כלומר >> [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4,100)
        3. השתמש בתכונות מפולחות באופן ידני כקלט לVLFeat.
          הערה: ספרייה מבוססת C קוד פתוח זו תבצע תיקון פיקסל, אשכולות תיקון, ומיצוב מרכז אשכול, תלוי בסוג של שיטה שנבחר לעבודה הטובה ביותר עבור מערכי נתונים. האפשרויות הזמינות נעות בין אשכולות k-ממוצע למבוסס texton גישות 30, והפלט הוא מערך מספרי המתאר את התכונות הרצויות המבוססות על מופת שניתנה.
    2. פילוח: השתמש פו זהlly אוטומטי, אם כי יקר המחשוב, גישה לכיתות קטע מרובות של אובייקטים בו זמנית, שיהיה כתובה כמפות נפרדות להדמיה וניתוח נוספים.
      1. טען את המערך שנוצר בעבר הספרה (מודל).
      2. לקרוא לפונקצית מכונה וקטור תמיכה (SVM) בVLFeat, תוך שימוש במודל ואת התמונה שיש בפילוח כקלט.
        1. בשורת הפקודה, הזן: >> [w, b] = vl_svmtrain (x, y, 0.1), כאשר x הוא המקורי קצוץ im2_crop תמונה וy הוא התמונה האובייקטיבית, את התמונה שכבר מפולח באופן ידני. השתמש >> ISEG = VL_IMSEG (אני, תוויות) לצבוע את התוצאות על פי התוויות שנוצרו על ידי קיבוץ באשכולות.
          הערה: בהתבסס על המאפיינים של המודל, VLFeat יהיה לסווג את התמונה על מספר הכיתות (תכונות של עניין) שהוקצו מההתחלה. בהתאם לכיתה של דיוק הרצוי, ניתן לשלב שיטה זו עם גישות אחרות או clust הערכהפרמטרים אה כגון מרכזי גוף ואשכול. הפלט של אלגוריתם SVM הוא מודל הסתברותי ומסכות בינארי מרובות של המעמדות הרצויות במערכי הנתונים החדשים.
      3. שמירת תוצאות על ידי הזנת הפקודה: >> imwrite (im, פורמט $, $ filename) שבו פורמט $ הוא 'ריב' ושם קובץ $ הוא הנתיב לקובץ הפלט.
      4. להמחשת תמונות, הזן את הפקודה: >> imshow (im).

Representative Results

איור 1 מציג את זרימת עבודה טיפוסית להדמיה סלולרית מיקרוסקופ האלקטרונים 3D, כוללים טומוגרפיה אלקטרון, FIB-SEM, וSBF-SEM. העבודה כוללת איסוף נתונים גולמי, יישור נתונים ושחזור לתוך 3D נפח, הפחתת רעש באמצעות סינון, ובמידת צורך, חיתוך לאזור של עניין על מנת למקסם את האפקטיביות של תוכנת הפילוח נבחרה. נתוני עיבוד ראשוניים כזה הוא אז מוכן להפקת תכונה / פילוח.

איור 2 ממחיש את זרימת העבודה שהותוותה באיור 1 עם ארבע קבוצות שונות נתונים (שיושקו בהמשך), שניים מהם הדגימות משובצות שרף הוקלטו על ידי טומוגרפיה של האלקטרון (2A דמויות, 2B), עם שני האחרים הנובעים מFIB -SEM וSBF-SEM, בהתאמה (2C דמויות, 2D). תמונות באיור 2 עמודה 1 הן הקרנהצפיות (2A1 דמויות, 2B1) ותמונות פני השטח בלוק (דמויות 2C1, 2D1), בהתאמה, אשר על יישור ושיקום נאספו לידי 3D נפח. טור 2 מראה פרוסות באמצעות כרכי 3D כזה, שעל סינון (עמודה 3) מראים ירידה משמעותית ברעש ובכך לעתים קרובות מופיעים פריך יותר. לאחר הבחירה והחיתוך הגדול 3D הנפח לאזור של עניין (טור 4), ניתן להשיג הדמיות 3D של תכונות מפולחות של עניין (עמודה 5) ובדקו נוסף, מקודד לפי צבע וכמותית ניתחו.

בסך הכל שש ערכות נתונים 3D, וכל אחד מן ערימה של תמונות שהושגו באמצעות שתי טומוגרפיה של האלקטרון (3 ערכות נתונים), FIB-SEM (2 ערכות נתונים), או SBF-SEM (סט נתונים 1) משמש כדי להשוות כיצד כל אחד מן ארבע שיטות הפילוח לבצע (איור 3). ערכות נתונים נובעות ממגוון של פרויקטי מחקר שונים במעבדה ובכך לספק arסט easonably מגוון של ערכות נתונים ניסיוניות אופייניות. כל ערכות נתונים נבדקו על ידי ארבעה חוקרים עצמאיים, כל אחד מהם הם מוכרים ביותר עם גישה אחת מסוימת, והם הואשמו במתן התוצאה הטובה ביותר האפשרית עבור כל אחד משש ערכות נתונים.

ערכות נתונים הן מדוגמאות כדלקמן: 3A1-3A5 1 דמויות: לחץ גבוה קפוא,-להחליף להקפיא ומשובץ שרף stereocilia אפרוח שיער באוזן פנימי תא ביום 31 ב, 2 דמויות 3B1-3B5: לחץ גבוה קפוא, מקפיאים הוחלף וקיר תא צמח משובץ שרף (לא פורסם), 3 דמויות 3C1-3C5:, 4 דמויות לחץ קפוא גבוהות וkinocilium תא שיער באוזן הפנימי משובץ שרף (לא פורסם),-להחליף להקפיא 3D1-3D5: גבוה ללחץ קפוא, ולהחליף להקפיא בלוקים משובצי שרף של מיטוכונדריה נמצאת בתאים אנושיים החלב בלוטת האפיתל HMT-3522 S1 acini, אשר היו בתרבית בextracell העשיר lamininמטריצת ular 32,33, 5 דמויות 3E1-3E5: גבול קרום של תאים של HMT שכנים: מעובד המעבדתיים, בלוקים משובצי שרף של biofilms חיידקי מפחית סולפט (כתב יד בהכנה), ו -6 דמויות 3F1-3F5 בלא כתם -3,522 Acini S1.

כפי שניתן לראות מהאיור 3, גישות פילוח שונות יכולות להוביל לתוצאות דומות בעיקר עבור סוגים מסוימים ערכת נתונים, אך תוצאות שונות לחלוטין עבור סוגי נתונים אחרים. לדוגמא, ערכת נתוני stereocilia תא שיער (איור 3 א) מניבה כמויות סבירות פילוח עם כל ארבע גישות, עם המודל המופשט הידני שנוצר על ידי להיות הברור לפרש ומידת משתמש מומחה. במקרה זה, מודל כזה מאפשר למדידות מהירים של מרחקי נימה חוט להט, ספירה של מספר הקישורים שנמצאו בין החוטים המוארכים, כמו גם נחישות של חלקים חסרים של מפת הצפיפות המתאימהבמקומות בהם הדגימה נפגעה במהלך הכנת מדגם 34 ל. מידע כזה הוא הרבה יותר קשה לרכוש באמצעות שלוש פילוח גישות האחרות, אם כי הפילוח האוטומטי בהתאמה אישית מספק תוצאות טובות יותר מאשר thresholding טהור המבוסס על צפיפות.

לדופן תא צמח (איור 3 ב), דור מודל ידני שנראה כיעיל ביותר בהעברת תחושה של סדר בקיר התא, שאף אחד מהגישות האחרות להשיג. עם זאת, המודל המופשט אינו ללכוד את צפיפותם של האובייקטים בערכת הנתונים. באופן ידני נראית התחקות תכונות של עניין לתת תוצאה טובה יותר מאשר הגישות בפיקוח בצורה מבוססת צפיפות או. מצד השני, מעקב ידני הוא מאוד עתיר עבודה וגבולות זיהוי של התכונות הוא סובייקטיבית במידה מסוימת. לכן, גישות אוטומטיות עשויות להיות מועדפות לפילוח כמויות גדולות עם תחלופה פוטנציאלית בין הדיוק ומשאבים שהושקעו בפילוח ידני.

לערכת נתוני kinocilium (איור 3 ג), דור מודל מופשט ידני מניב תוצאה הנקיה וחושף ארכיטקטורה בלתי צפויה של שלושה microtubules במרכז kinocilium, פרט שנראה בקלות בנתונים הקצוץ, אבל הפסיד בכל גישות האחרות , ככל הנראה בשל כתם ההטרוגניות. עם זאת, תכונות שעשויים להיות מכריעות אחרות של מפת הצפיפות הם החמיצו בדור הידני של מודל מופשט. זאת בשל העובדה שהאופי הסובייקטיבי של היווצרות מודל ידנית מוביל לאידיאליזציה והפשטה של ​​הצפיפות בפועל נצפתה, ולכן לפרשנות סובייקטיבית במהלך היווצרות המודל. לפיכך, דוגמא זו יפה מדגימה כיצד מדריך לדור מודל מופשט מאפשר לאדם להתרכז בהיבט ספציפי של 3D הנפח. עם זאת, התפיסה והפישוט סלקטיבית אינם נותנים דין וחשבון מלא של כל שיתוף החלבוןmplexes הנוכחי בערכת הנתונים. לכן, אם המטרה היא להראות את המורכבות של נתונים, ולאחר מכן אחד טוב יותר מוגש עם כל אחת משלוש הגישות האחרות.

במקרה של acini המטריצה ​​תרבותית 3D בלוטת החלב (איור 3D), מיטוכונדריה ניגודיות הגבוהה מפולחות לפי כל ארבעת גישות בקלות, עם המעקב הידני של תכונות לא מניבות יותר מדי מפתיע את התוצאות הטובות ביותר עם ​​הסכום הנמוך ביותר של זיהום ( איור 3D3). עם זאת, מעקב ידני הוא מאוד עתיר עבודה, ולכן שימוש מוגבל לכמויות גדולות. שני מבוסס סף צפיפות ופילוח אוטומטי בפיקוח צורה לחלץ את המיטוכונדריה די טוב, ויביאו לפילוח כמעט מושלם, אם טריקים נוספים לניקוי מועסקים (למשל, ביטול כל האובייקטים מתחת לסף מסוים של צפיפות voxel) כזמין בחבילות שונות. במקרה זה, בניית מודל מופשטת במדריך לא הניבהתוצאות מבטיחות, בין שאר משום שהמיטוכונדריה לא יכולות בקלות להיות מקורבות עם מודלים כדור ומקל.

עם כל כבוד לקהילה / biofilm אדמת החיידקים (איור 3E), שלוש מארבע הגישות להניב תוצאות סבירות, עם דור המודל הידני לא מתפקד היטב בשל האתגר של ייצוג אובייקטים ביולוגיים, כגון חיידקים, על ידי צורות גיאומטריות. נספחים תאיים שמקורם בחיידקים יכולים להיות מזוהים בגישות הפילוח האוטומטיות אבל לא כמו גם באיתור התכונה הידני. פילוח בהתאמה אישית צורה בפיקוח אוטומטי יכול עוד להפריד בין התכונות תאי מהחיידקים למרות הצפיפות הדומה שלהם (מידע לא מוצג), המאפשר כימות קלה אפילו של ערכות נתונים גדולות מאוד. בגלל זה הוא במקור ערכת נתונים גדולה מאוד, הפילוח האוטומטי בהתאמה אישית בצורה ברורה outcompeted כל גישות אחרות, אבל ייתכן שנהנה מהמורכבות הנמוכהוההפצה הדלילה יחסית של האובייקטים של עניין (צפיפות נמוכה).

כאשר בוחן את הממשק שבין שני תאים האיקריוטים בהקשר רקמות כמו (איור 3F), המעקב הידני בלבד של תכונות של עניין הניב תוצאות טובות. אוטומטי גישות פילוח מבוסס צפיפות מצליחות לזהות את גבול הקרום בין תאים סמוכים לגמרי, ואפילו הגישות בהתאמה אישית נכשלה, בין שאר משום שצורתו של תא אינה מקורב או מזוהה עם צורות בקלות, למרות ההצלחה ברורה שלה לחיידקים בbiofilm (איור 3E5).

התצפית מהאיור 3, כי גישות הפילוח לעשות גם על כמה ערכות נתונים, אך לא על אחרים הובילה לשאלה מה מאפיין כל אחד מערכות נתונים אלה, והאם ניתן היה לסווג את סוגי מאפייני נתונים או מטרות אישיות שהופיעו ל להתאים היטב עם respectivגישת דואר. הלימוד שיטתי של נושא זה לא נערך בעבר, ולכן כצעד ראשון הקמת רשימה אמפירית של מאפייני תמונה ומטרות אישיות יכולה להדריך את טירון בניסיון שלהם כדי למצוא את הגישה הטובה ביותר להפקת תכונה של קבוצת הנתונים שלהם בהתאמה.

שמונה קריטריונים זוהו כמשמעותי מוצגים באיור 4, והם יכולים להיות מחולקים לשתי קטגוריות עיקריות: (1) התכונות שאינן גלום בערכת הנתונים, ו( 2) המטרות אישיות של החוקר ושיקולים אחרים שהם קצת יותר סובייקטיבי, אם כי חשוב באותה מידה. דוגמאות שמוצגים נמשכים בעיקר משש ערכות נתונים באיור 3, עם שלוש קבוצות נתונים נוספות שהוצגו: אחד (איור 4A1) היא cryo-tomogram של cryo-קטע קיר תא צמח thaliana ארבידופסיס, (4A2 הדמויות השנייה , 4B1, 4D1 בדמויות 3F1-3F5 אבל הוא אפילו יותר באופן משמעותי מורכב, והשלישי (איורים 4B2 , 4D2) הוא tomogram שרף סעיף של stereocilia תא שיער באוזן הפנימי במבט חתך, בדומה לתוכן המדגם שמוצג בתצוגת אורך בFiguress 2A1-2A5 ו3A1-3A5.

לקטגוריה של קריטריונים האובייקטיביים כמו מאפייני תמונה, ארבע תכונות הגלומות בערכות נתונים מוצעות להיות בעל חשיבות:

  1. לעומת זאת הנתונים יכול להיות (1) נמוך (איור 4A1) כאופייני לtomograms cryo-EM, (2) בינוני (איור 4A2) כגון בנופים סלולריים ללא אברון ברור או עומדים תכונה בולטת אחרים, או (3) גבוה (איור 4A3), כפי שקורה לkinocitomogram liary או stereocilia בחתך, בשל היישור של אלמנטים סיביים יופרדו בצורה ברורה בתוך z-הכיוון.
  2. הנתונים יכולים להיות מטושטש (איור 4B1), ללא גבולות בעליל ברורים בין שני אובייקטים ממוקמים באופן הדוק, כגון תאים ברקמות, או פריך (איור 4B2), עם גבולות ברורים וחדים. זה הוא בחלקו פונקציה של הרזולוציה ערכת נתונים, שמטבעו אינה גבוה יותר בפקטור של כ 2-4 לtomograms אלקטרון לעומת FIB-SEM. באופן טבעי, גבולות חדים יותר רצויים עבור שני במדריך, כמו גם גישות פילוח אוטומטיות, אך חיוניים לגישה השנייה.
  3. מפות הצפיפות יכולות להיות צפוף (איור 4C1) כפי שמשתקף במרכיבי דופן תא צמח במרווחים בחוזקה, או מיושבים בדלילות (איור 4C2), כמו גם את החיידקים במושבה, שמדגימה את ההפרדה שהופך אוטומטי פילוח תמונה באופן משמעותי קל יותר.
  4. מפות צפיפות יכולות להיות מורכבות מאוד עם תכונות שונות בהרבה לעתים קרובות עם צורות חריגות, כגון vascularis stria רקמה סביב כלי דם (איור 4D1) או אובייקטים מוגדרים היטב כמו אברון עם ארגון דומה, כגון stereocilia בחתך ( איור 4D2).

כמו כן שימו לב הסולמות שונים בהרבה בכל דוגמאות השונות, מה שהופך את ההשוואה קצת קשה.

מלבד הקריטריונים אובייקטיביים יותר, כגון מאפייני תמונה, ארבעה קריטריונים מאוד סובייקטיבי שינחו את הבחירה של הנתיב המתאים גם מוצעים:

  1. מטרה רצויה: המטרה יכולה להיות לדמיין stereocilium צרור השיער במורכבות ולקבוע ולבחון את הצורה של האובייקט (איור 4E1), או ליצור מודל כדור ומקל פשוט ומופשט, הבנוי לתוך מפת הצפיפות ו מאפשר מהיר לספורמדידת nd של האובייקטים הגיאומטריים (אורך חוט להט, מרחק ומספר החיבורים) (איור 4E2).
  2. מורפולוגיה התכונה יכולה להיות לא סדירה ומורכב כמו תאים, כגון אזורי אינטראקציה תאי תאים (איור 4F1), במידה מסוימת בצורה דומה עם גרסה כלשהי, כגון מיטוכונדריה (איור 4F2), או בעיקר בצורה זהה, כגון סיבי אקטין וצלב ביותר קישורים בצרור שיער בכיוון אורכי (איור 4F3).
  3. חלקם היחסי של התכונה של עניין (צפיפות אוכלוסייה) הוא חשוב, כאחד אולי כדאי למגזר כל התכונות בערכת נתונים 3D, כמו במקרה של לקירות תא צמח (איור 4G1), או רק חלק זעיר של הנפח הסלולרי כמו במקרה של המיטוכונדריה בסצנה סלולרית הטרוגניות (איור 4G2). בהתאם לגודל של ערכת הנתונים ואת אחוז הנפח שדורש פילוח, זה יכול להיות יעיל ביותר לשימושגישות במדריך. במקרים אחרים, כגון כאשר אחד הוא מתעניין במגוון רחב של תכונות, פשוט אין תחליף לשימוש בגישות פילוח אוטומטי למחצה.
  4. עוד קריטריון סובייקטיבי מפתח הוא כמות משאבים אחד לא מוכן להשקיע בתהליך הפילוח ומה רמת הנאמנות נדרש לענות על שאלה ביולוגית. אפשר רוצה וצריך לכמת פרמטרים הנפח של תכונה (כגון גודל, נפח, שטח פנים, אורך, מרחק מתכונות אחרות, וכו '), ובמקרה כזה ייתכן שיהיה צורך טיפול יותר כדי להשיג מידע כמותי מדויק (איור 4H1), או המטרה יכולה להיות רק לצלם תמונה של צורת 3D שלה (איור 4H2). בעולם אידיאלי שבו משאבים בלתי מוגבלים, אחד באופן ברור שלא הייתי רוצה לעשות שום פשרות אלא לבחור את הנתיב מדויק ביותר להפקת תכונת מדריך לסיוע למשתמש. בעוד זה יכול לעבוד עבור ערכות נתונים רבות, בעתיד הקרוב כרכי 3D wil l להיות בסדר הגודל של 10k על ידי 10k ידי 10k או גבוה יותר, והפילוח ידני כבר לא יהיה מסוגל לשחק תפקיד מרכזי בפילוח מרחב כזה עצום. בהתאם למורכבות של נתונים ומאפייני נתונים אחרים, פילוח אוטומטי למחצה עשוי להיות הכרח.

באיור 5, את נקודות החוזק ואת מגבלותיהם מופיעים בקצרה לארבע גישות הפילוח. המטרות אישיות ומאפייני תמונה שזוהו באיור 4 שיוכלו לשייך כל גישה מתוארות גם כן. באיור 6, המטרות אישיות ומאפייני תמונה של שישה מערכי נתונים מדגימים כיצד למיין נתונים ולהחליט על הגישה הטובה ביותר. שני דמויות 5 ו -6 מורחבים על בדיון.

עומס / 51,673 / 51673fig1highres.jpg "width =" 500px "/>
איור זרימת עבודה .1 לשיקום הדמיה ביולוגי וניתוח. תרשים זה נותן סקירה כללית של הצעדים השונים שננקטו כדי לאסוף ותמונות שנאספו על ידי תהליך טומוגרפיה, התמקד אלומת היונים SEM, ופנים בלוק סדרתי SEM. תוצאות איסוף נתוני גלם סדרת ההטיה 2D או קטעי סדרתי ב. סטי תמונת 2D אלה חייבים להיות מתואמים ושחזרו לתוך 3D, אז מסונן, כדי להפחית את הרעש ולשפר את הניגודיות של תכונות של עניין. לבסוף, יכולים להיות מקוטעים נתונים וניתחו, סופו של דבר וכתוצאה מכך במודל 3D. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2.. דוגמאות של זרימת עבודה עבור סוגי נתונים שונים מטומוגרפיה וFIB-SEM כל צעד של זרימת העבודה לאחר איסוף הנתונים מוצגת באמצעות ארבע ערכות נתונים (AD שורות): שרף מוטבע טומוגרפיה צבעונית של stereocilia מחולק אורכים, שרף מוטבע טומוגרפיה צבעונית של דופן תא הצמח תאית, FIB-SEM של המיטוכונדריה שד תאי אפיתל, וSBF-SEM של א ' חיידקי coli. פרוסת 2D באמצעות הנתונים הגולמיים מוצגת בטור 1, ותמונה מאת הנתונים לאחר יישור ושיקום 3D כוללת עמודה 2 טכניקות הסינון מיושמות בעמודה 3 הם הבאים: מסנן חציון (A3) מסנן דיפוזיה אינו איזוטרופי, (B3), טשטוש Gaussian (C3), והמסנן של MATLAB imadjust (D3). דוגמא לפילוח הטוב ביותר עבור כל הנתונים שנקבעו מאזור החיתוך של עניין (עמודה 4) מוצגת כ3D rendering בטור 5 ברים סולם: A1-A3 = 200 ננומטר, A4 = 150 ננומטר, A5 = 50 ננומטר, B1-B3 = 200 ננומטר, B4-B5 = 100 ננומטר, מ"מ = 1 C1-C3, C4-C5 = 500 ננומטר,D1-D3 = 2 מ"מ, D4-D5 = 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
יישום איור 3 של ארבעה פילוח גישות לערכות נתונים דוגמא ערכות נתונים שש דוגמא חולקו על ידי כל ארבע גישות:. דור ידני מופשט מודל, מעקב ידני, פילוח מבוסס צפיפות אוטומטי, ופילוח אוטומטי בהתאמה אישית. דור מודל מופשט ידני היה יעיל לשרף המוטבע טומוגרפיה צבעונית של stereocilia (), כמטרה הייתה ליצור מודל למטרות כמותי ולא כדי לחלץ צפיפויות. לשרף מוטבע טומוגרפיה צבעונית של דופן תא צמח (B), segmenta מבוסס צפיפות אוטומטיתtion היה השיטה היעילה ביותר כדי לחלץ את התאית במהירות דרך פרוסות רבות, שבו כשיטות ידניות לקחו הרבה יותר מאמץ על רק כמה פרוסות של נתונים. דור מודל מופשט ידני שנוצר השלישייה microtubule בטומוגרפיה המוכתמת של kinocilium (C) ואילו שיטות פילוח אחרות לא עשו, עדיין שתי הגישות אוטומטיות שחולצו הצפיפות במהירות רבה יותר והועדפו לכן. בגלל הצורה של המיטוכונדריה מFIB-SEM של תאי אפיתל שד (ד '), מעקב ידני סיפק את התוצאה הנקיה ביותר, וצפיפות האוכלוסייה הנמוכה בשילוב עם שימוש בשיטות אינטרפולציה אפשרו לפילוח מהיר. בהתחשב בהיקף הגדול שהיה צריך להיות מקוטעים, מותאם-מותאם אישית פילוח אוטומטי הוכיח להיות יעיל ביותר למגזר נתונים SBF-SEM חיידקים (E), אבל שני גישות אוטומטיות היו דומים. למרות זמן רב, השיטה היחידה לחלץ את FIB-SEM של קרום תא אפיתל שד (F) הייתה מעקב ידני ברים סולם.:A1-A5 = 100 ננומטר, B1-B5 = 100 ננומטר, C1-C5 = 50 ננומטר, D1-D5 = 500 ננומטר, E1-E5 = 200 ננומטר, F1-F5, ברים = 500 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
.4 מאפייני דמות מטרת תמונה ומטרות אישיות הסובייקטיבית לtriaging של ערכות נתונים. שימוש דוגמאות של נתונים להגדיר מאפיינים, קריטריונים מוצעים להודיע ​​החלטה על איזה פילוח גישה לשימוש. עם כל כבוד למאפיינים אובייקטיביים, נתונים יכולים מטבעו יש לי ניגוד שהוא נמוך, בינוני, או גבוה (A1-A3), להיות מטושטש או פריך (B1-B2), בפיסוק או צפוף (C1-C2), ויש לי מורכב או פשוט תכונות מאורגנות (D1-D2). מטרות אישיות הסובייקטיבית כוללות o הרצויה bjective מיקוד מודל פשוט או חילוץ הצפיפויות המדויקות (E1-E2), זיהוי גיליון מפותל, נפח מפותל, או מורפולוגיה ליניארית כתכונה של עניין (F1-F3), בחירת צפיפות אוכלוסייה גבוהה או נמוכה של התכונה של עניין (G1-G2), ומחליט על התחלופה בין איכות גבוהה וגבוהה משאבים הקצאה לחזרה פוחתת בהשקעות כגון זמן (H1-H2) ברים סולם:. A1 = 50 ננומטר, A2 = 1,500 ננומטר , A3 = 100 ננומטר, B1 = 1,500 ננומטר, B2 = 200 ננומטר, C1 = 100 ננומטר, C2 = 200 ננומטר, D1 = 10 מ"מ, D2 = 200 ננומטר, E1 = 100 ננומטר, E2 = 50 ננומטר, F1-F2 = 500 ננומטר, F3 = 50 ננומטר, G1 = 100 ננומטר, G2 = 1 מ"מ, H1-H2 = 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

px "/>
איור 5 טבלת השוואה של מאפייני נתונים וסובייקטיבי מטרה מתאים לגישות פילוח שונות. טבלה זו מסכמת את נקודות חוזק ואת המגבלות של כל גישת פילוח. הקריטריונים מהאיור 4 יכולים לעזור לזהות אילו מערכי נתונים מתאימים לשיטת פילוח ש. מאפיינים אלה מטרת תמונה ומטרות אישיות הסובייקטיבית נבחרו לשימוש אופטימלי של כל גישה, אבל שילובים שונים עלולים לעכב או לסייע ליעילות של הפילוח. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור תרשים זרימה .6 החלטה לt יעילriage של פילוח מתקרב לערכות נתונים בעלי מאפיינים שונים. בהתבסס על המאפיינים מודגשים באיור 4, תרשים זה ממחיש שארבעה קריטריונים תרמו ביותר להחלטה הסופית בגישת הפילוח הטובה ביותר עבור כל הנתונים שנקבעו מהאיור 3. כל קבוצת נתונים היא מקודד לפי צבע כדי לעקוב במהירות קווים הנועזים המייצגים את תהליך קבלת החלטות העיקרי, כמו גם את הקווים מקווקווים המשקפים את הנתיב חלופי שעשויים או לא עשוי להוביל לאותה הגישה. Kinocilium, החיידקים, וערכות נתונים דופן תא הצמח היו מפולחים הכי טוב עם שתי גישות אוטומטיות. בניגוד לכך, נתיבי קרום התא ומיטוכונדריה תמיד מובילים למעקב ידני בשל מאפייניהם הקשים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

אסטרטגיות יעילות להפקת תכונות רלוונטיות מכרכי 3D EM נחוצים בדחיפות על מנת לשמור על קשר עם הצונאמי נתונים שלאחרונה פגע הדמיה ביולוגית. בעוד יכולים להיות שנוצרו נתונים בשעות או ימים, זה לוקח חודשים רבים כדי לנתח את כרכי 3D בעומק. לכן, ברור כי ניתוח התמונה הפך את צוואר הבקבוק לתגליות מדעיות; ללא פתרונות הולמים לבעיות אלה, מדעני הדמיה הפכו הקורבנות של ההצלחה שלהם. מדובר בין שאר בשל המורכבות הגבוהה של נתונים וגם ההצטופפות מולקולארית נמצאת בדרך כלל בתאים ביולוגיים, שבו חלבונים וקומפלקסי חלבוני גבול אחד את השני ובעצם להופיע כשיפוע רציף של צפיפות בגווני אפור. הבעיה היא מסובכת בשל פגמי הכנת מדגם והדמיה, ובחלק מחפצי שחזור תמונת מקרים, שמוביל לנתונים נפח פחות ממושלם שיכול להוות אתגר לגישה אוטומטית לחלוטיןes. המשמעותי ביותר, עם זאת, היא העובדה שהמומחים בהכנת מדגם, הדמיה, והפרשנות הביולוגית לעתים רחוקות בקיאים במדע חישובים, ולכן דורשים הדרכה על איך לגשת להבלטת תכונות וניתוח ביעילות. לכן, באמצעות השימוש בדוגמאות שונות, הפרוטוקול מסביר כיצד להכין נתונים לפילוח, כמו גם צעדים לדור במדריך מופשט מודל, פילוח מבוסס צפיפות אוטומטי, מעקב ידני של תכונות של עניין, ופילוח אוטומטי בהתאמה אישית. ניתן למצוא הגישות ידניות ואוטומטיות המפורטים בנוהל במגוון גדול של תוכנות פילוח, שחלקם הוזכרו כאן, אבל אחרים לבצע פעולות דומות והם באותה מידה גם מתאימים.

התוצאות מראות כי אפקטיבי של כל אחת מהגישות פילוח 3D משתנה עבור כל סוג של ערכות נתונים שונים. למרות הגישות השונות המיוצרות באופן איכותי שלהדמיות 3D imilar כמוצר סופי, את כמות הזמן והמאמץ שהושקעו בכל אחת, במהלך תהליך הפילוח מגוון באופן משמעותי. ההמלצות למאפייני תמונה מתאימות ומטרות אישיות לכל גישה לפילוח מסוכמות באיור 5, שמוסבר בהרחבה בארבעת הסעיפים הקטנים הבאים. קריטריונים אלה הוחלו על ששת מערכי נתונים, כפי שמוצגים בתרשים זרימת החלטה של איור 6. למרות איורים 5 ו -6 הם רק נועדו לספק רציונל לכל קבוצת נתונים וכיצד כל אחד מהקריטריונים שוקללו בתהליך קבלת החלטות, הם אינם מספקים הדרכה חסינת תקלות, אלא נקודת התחלה. יש פשוט יותר מדי קריטריונים רבים המשפיעים על תהליך קבלת החלטות: חלקם קריטריונים אובייקטיביים, כגון מאפייני ערכת נתונים, ואילו אחרים הם קריטריונים סובייקטיביים יותר, כגון מטרה הרצויה. זה בטוח לומר כי ערכות נתונים המציגות לב גבוהאל של ניגוד עם גבולות חדים חדים, יש להם תכונות שהם גם נפרדים והומוגנית יחסית (לא יותר מדי מגוונים), ומעובדים במטרה להציג מודל צפיפות עבור מספר גדול של אובייקטים, גישות אוטומטיות תהיה מעולה, אם לא ל העובדה שגישות ידניות פשוט להיות משאב -prohibitive (זמן). מצד השני, אם לעומת זאת היא נמוכה, נתונים מעורפלים ולכן דורשים ידע של מומחה, האובייקטים הם צפופים, והתכונות להראות גיוון גבוה ולכן הם הטרוגנית, ייתכן שאין לי אחד כל ברירה אחרת מאשר הבלטת תכונות ידניות / פילוח.

מדריך להפשטת דגם דור

מעקב מודל מופשט ידני הוא יעיל במיוחד בפילוח אלמנטים ליניארי, מתן נקודות זרעים (כדורים) שניתן לחבר באופן אוטומטי (מקלות). כדורים כאלה ומקלות-דגמים יכולים להיות חזקים מאוד כדי למדוד אורךnd כיוון של מודל כזה ולספק מודל מופשט במידה מספקת עבור שניהם בדיקה איכותית וניתוח כמותי. דור מודל המופשט ידני נפוצה בעת מזעור משאבים שהושקעו בניתוח הוא חשוב יותר מנאמנות מוחלטת לצורות של הנתונים המקוריים. זה הכי מוצלח עם תכונות ליניארי והומוגנית של עניין (למשל, חוטים, צינורות). לעומת זאת הנתונים, פריכות, וצפיפות לא משחקים תפקיד מרכזי בקביעת ההצלחה של שיטה זו, כל עוד העין האנושית יכולה לזהות את האובייקט של עניין. לפעמים גם יכולים להיות מנוצלים דגמים כגון שלד למגזר מפת 3D באזור סביב השלד. למרות שהמודל הוא מופשט ולא השתקפות של צפיפות מדויקת, הוא מייצג גרסת skeletonized של צפיפות 3D ובכך מאפשר להדמיה ללא עומס וניתוח איכותי. ניתן גם נקבעו מדידות כמותיות כגון אורך מהמודל המשוער. עבורדוגמא לתוכנה עם דור מודל מופשט במדריך, אנא בקר במדריך למשתמש מפורט של כימרה באינטרנט בhttp://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html.

איתור ידני של תכונות של ריבית

מעקב מכחול ידני עובד היטב עם כמעט כל מאפייני נתונים, אבל זה גם הזמן רב ביותר בשיטה. בזמנים, זה רק הטכניקה לחילוץ תכונה של עניין מסט תמונה מורכב המכיל מגוון רחב של תכונות, כגון קרום התא הדק ומפותל. כלי שימושי אחת בחלק מהתוכניות מאפשר לאינטרפולציה בין פרוסות מפולחות לסירוגין כאשר התכונה של שינויי ריבית בצורה חלקה. מעקב ידני יכול להיות מיושם באופן יעיל ביותר, אם נתונים הוא פריכים ויש לו בינוני עד גבוה, לעומת זאת, אבל יכול גם להיות מנוצל זהעבור ערכות נתונים מאתגרות יותר, כל עוד שהמשתמש מכיר את מושא העניין. מורכבות הנתונים יכולות לנוע בין אובייקטים דיסקרטיים לערכות נתונים מורכבות וצפופות, שבו חפצים ארוזים באופן הדוק. במקרה האחרון, פילוח ידני עשוי להיות הבחירה היחידה, כגישות אוטומטיות לעתים קרובות מאבק למגזר הנפח הרצוי ולחלץ יותר מדי או מעט מדי. מורפולוגיות תכונה קשות, כגון סדינים או כרכים מפותלים, יכולות גם להיות מופקים בשיטה זו. עם זאת, המשתמש צריך לזכור כי בסיס הנתונים עם מספר מאפיינים קשים יכולים להיות מקוטע רק אם צפיפות האוכלוסייה של התכונות של עניין היא נמוכה, כמו פילוח של צפיפות אוכלוסייה גבוהה של התכונות של עניין הופך להיות בזמן אוסרני. לדוגמא של תוכנה עם מעקב ידני, אנא בקרו במדריך למשתמש מפורט של עמירה המקוונת בhttp://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.

פילוח מבוסס צפיפות אוטומטית

בניגוד לטכניקות ידניות, הגישות האוטומטיות הן בדרך כלל פחות זמן רב, שהוא גורם חשוב לשקול בעת פילוח ערימה גדולה של תמונות. עם זאת, קביעת ערכי סף פשוט לא יכול להיות מדויקת כ, והרבה יותר זמן יכול להיות שהוצאה על עידון ואוצרות של הנפח המפולח באופן אוטומטי. פילוח מבוסס צפיפות אוטומטית עובד הכי טוב על ערכות נתונים המציגות מספר רב של תכונות דומות של עניין שכולם דורשים פילוח. אם הנתונים הוא מורכבים יותר, טכניקות האוטומטיות אלה עדיין יכולות לשמש כצעד ראשוני, אך סביר להניח כי תדרוש קצת התערבות ידנית לאורך הקו כדי לציין subvolume המכיל את התכונה של עניין. אסטרטגיה זו בדרך כלל עובדת היטב על מורפולוגיות ליניארי או כרכים מפותלים, אבל זה מוצלח לעתים רחוקות עם סדינים מפותלים דקים כגוןתא ממברנות. התערבות משתמש מינימאלית עם גישות אוטומטיות מאפשרת פילוח באמצעות כמויות גדולות או קטנות, בזמן שמשקיע משאבי משתמש כמה כגון זמן בתמורה לאיכות גבוהה. לדוגמא של תוכנה עם פילוח מבוסס צפיפות אוטומטית, אנא בקרו במדריך למשתמש מפורט של עמירה המקוונת בhttp://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.

מותאם אישית מותאם אוטומטית פילוח

Custom-מותאם פילוח אוטומטי מאפשר כוח ההתאמה האישית של אלגוריתמים לערכת נתונים ספציפי, אך לעתים קרובות ספציפי לנתונים שנקבעו או סוג נתונים, המתאימים למספר מוגבל של מאפייני תכונה, ולא ניתן להכליל בקלות. ההליך לראווה כאן שונה מגישות הכלליות אוטומטי הפילוח, כגון טבילת קו פרשת מים ורמה אחרת שיטות סט, אשר מסתמכות על קביעה מתוכנתת של נקודות זרע קריטיות, ואחריו התרחבות קובייה צועדת במהירות מנקודות הזרע אלה. וריאציה על נושא זה היא פילוח גבול, שבו מידע וקטור השיפוע מודיע גבולות תכונה. בניגוד לכך, את התסריט המותאם אישית משמש כאן מסתמך על שלב אימונים שבו המשתמש עוקב באופן ידני כמה דוגמאות. באמצעות למידת מכונה, אלגוריתמים ספציפיים יהיו לזהות ולאחר מכן ילמדו לזהות באופן עצמאי תכונות ומאפיינים נמצאו נתונים באופן עקבי בסימנים. משתמש מומחה יכול להכשיר את האלגוריתמים ולשפר את הדיוק של פילוח על פי כולל יותר דוגמא עקבות כדי לספק סדרה גדולה יותר של קריטריוני תכונה. בסך הכל, גישות thresholding וגישות בנושא, או אפילו בהתאמה אישית לא יכולות להיות שימושיות כדי לחלץ תכונה אחת של ריבית מתמונה עם מגוון מורכב של האברונים או צורות, כמו אוצרות עשויות להיות בדיוק כמו עבודה אינטנסיבית כמעקב ידני.

">

אסטרטגיות לTriaging נתונים ובחירת גישת פילוח

בהתחשב בקריטריונים סובייקטיביים ואובייקטיביים מוצגים באיור 4 וסיכום של מערכי נתונים מתאימים באיור 5, את ערכת קבלת ההחלטות המתוארות באיור 6 יכולה לסייע להערכה אפקטיבית של אסטרטגיות הבלטת תכונות למגוון גדול של ערכות נתונים. ערכות הנתונים triaged בארבע החלטות ברציפות, כל אחד מהם עשוי לכלול כל אחד מארבעת היעדים בהתאמה, כמו גם את ארבעת הקריטריונים סובייקטיביים הציגו באיור 4. כדוגמא, איור 6 הוא רציונלים לtriaging כל אחד מהנתונים שש סטים שמוצגים באיור 3. אין ספק, לכל הנתונים שנקבעו שאין דרך ייחודית בודדת, אך נתיבים שונים למדי באמצעות מטריצה ​​זו הבאה קריטריונים שונים לקבלת החלטות שעלולות להוביל to זהה או שונה ההמלצה לפילוח נתונים. בעוד כל קבוצת הנתונים תהיה סט של תכונות, שלא ניתן לצפות משלו, מקבלות שש דוגמאות, כל זיווג עם הסבר של הרציונל העומד מאחורי גישת חילוץ / פילוח התכונה המועדפת. רוב כולל גם הצעה למסלול החלטה חלופית שגם תוצאות בשימוש באותו או גישת פילוח שונה (איור 6).

Kinocilium הוא נתונים פריכים משובצים בגבולות מוגדרים וברורים, מה שהופך את גישות אוטומטיות יותר סיכוי להצליח. כל התכונות של עניין מופרדים היטב, שוב העדפת גישה אוטומטית. בנוסף, התכונות של עניין דומות זה לזה, מה שהופך אותו אידיאלי ערכת נתונים הומוגנית יחסית לפילוח בהתאמה אישית. לבסוף, המטרה הייתה לחלץ את כל התכונה, העדפת גישה חצי אוטומטי. כתוצאה מכך, זה היה להסיק כי thresholding אוטומטי (קו מוצק ירוק), כמו גם (גישה אישית מעוצב למשל, לעצב את הפילוח בפיקוח) (קו ירוק מנוקד) שניהם צפוי לעשות כן במערך נתונים זה.

קריטריונים דומים, אם כי הניחו בסדר שונה ברשת קבלת החלטות, חל על המקרה של חיידקים. גישה בהתאמה אישית מומלצת בין שאר משום שמערך נתונים זה היה גדול מאוד; ומכאן, משאבים מוגבלים לאסור גישת התערבות / פילוח ידנית עתירת עבודה. בעוד thresholding היה הניב תוצאות מתקבלות על הדעת, הגישה אישית מעוצב הייתה מסוגלת לבצע יעד המרכזי של המחקר כדי להפריד את צורות חיידקים עגלגלות מפיקדונות המתכת תאיים, הממוקמים גם בין בחיידקים או בסמוך לחיידקים, ולכן גישה בהתאמה אישית הייתה מעדיפה.

עבור ערכות נתונים stereocilia, השיקול הראשון היה המטרה הרצויה: המטרה יכולה להיות או להראות כל הצפיפותאו ליצור מודלים גיאומטריים. הנפח של העניין היה אזור צפוף, והמטרה הייתה קטע מספר רב של עצמים כאובייקטים מופרדים על מנת לבצע ניתוח נפח הכמותי, כוללים אורכים, מספרים, מרחקים, כיוון, וכו 'זה היה מועיל בהמשך שהאובייקטים של העניין היה בעיקר ליניארי, וזה עשה את מודל גיאומטרי התחקות השיטה של ​​בחירה. עם זאת, אם במקום המטרה הייתה להראות את כל הצפיפות, אז מורפולוגיה התכונה ליניארי, כמו גם גבוה יחסית לעומת גבולות ברורים וחדים תגרום פרוטוקול thresholding אוטומטי אפשרי.

קרום התא ומקרי נתונים מיטוכונדריה מאתגרים לגישות אוטומטיות בשל הקטגוריות של מורפולוגיה תכונה: גיליונות וכרכים מפותלים, בהתאמה. המטרה היא לעקוב אחר קווי המתאר תא או מיטוכונדריה במדויק, אבל יש משאבים רק סופיים לכך. בנוסף, התכונות של היתרההערכה היא מורכבות ולא יכולה להיות בקלות זוהתה באופן אוטומטי או בקידוד לעצב, אם כי לנתונים מיטוכונדריה מגדיר את גישת scripting המותאמת אישית נלקחה לחיידקים עשויים להיות מיושמים עם התאמה אישית נוספת. למרבה המזל, את הקרום ומיטוכונדריה עצמם לייצג רק חלק קטן מכל הנפח ומכאן, מעקב ידני הוא פשוט אם כי גישה גוזל זמן. מעקב ידני הוא גם שיטת בחירה של ערכות נתונים מסוג זה כאשר לעומת זאת היא נמוכה למדי והגבולות הם די מטושטשים. כתוצאה מכך, גם אם הם מהווים חלק משמעותי מערכות נתונים, גיליונות מפותלים כזה חייבים להיות נעוץ באופן ידני, פשוט בגלל חוסר חלופה טובה יותר.

ערכת נתוני מפעל שמציבה אתגרים משלו, כי המטרה הייתה למגזר כל האובייקטים, שהם צפופים במרווחים ומרכיבים את נוף צפוף. מציג את הצפיפות כפי שהוא יאפשר מדידות על הצורה והארגון של האובייקטים, אבל בecause פילוח ידני כל אובייקט סיבי הוא יקר מדי, thresholding האוטומטי הועסק במקום.

הצעדים השונים ותוצאות מקבילה ביצירת מודל 3D הוצגו כאן, אבל יותר חשוב, מאפייני נתונים וקריטריונים אישיים מצאו להיות מכריעים בקביעת הדרך הטובה ביותר של פילוח גם הובהרה. המאפיינים החשובים של נתוני התמונה עצמה כוללים מה שמתואר כאן כניגוד לכך, צפיפות, פריכות, ומספר צורות או תכונות (כגון האברונים, חוטים, ממברנות) שונות. קריטריונים סובייקטיביים לשקול לכלול את המטרה הרצויה של פילוח (מדידה / ספירה, ייצוג skeletonized של נתונים / בו מוצגות כרכים בהדמיות 3D), מאפיינים מורפולוגיים של התכונה של עניין (ליניארי, מוארכת, ברשת, מורכבת, מפותלת), הצפיפות של תכונות של עניין ביחס לכל הנפח (את החלק היחסי של האובייקטים שחשוב וצריכים להוציא), ואיזון הפשרות של משקיע משאבים לנאמנות של הפילוח של הנתונים המקוריים והתמורה פוחתת על ההשקעה וכתוצאה מהשיפורים מצטברים להקצאה באופן משמעותי גבוהה יותר של משאבים.

תחום פילוח תמונה התבגר באופן משמעותי במהלך השנים האחרונות, עדיין אין כדור כסף, אין אלגוריתם או תכנית שיכול לעשות את כל זה. גדלי סט נתונים גדלו ממאה מגה בייט באופן שיגרתי עשרות ג'יגה בייט, והם עכשיו מתחילים יעלו על טרה, מה שהופך את פילוח מדריך לכמעט בלתי אפשרי. לפיכך, יותר משאבים צריכים להיות מושקעים בגישות הבלטת תכונות חכמות וזמן אפקטיבי המחקות את תהליך קבלת החלטות האנושי. מאמצים אלה צריכים להיות בשילוב עם (1) מערכת מידע גיאוגרפי (GIS) מבוססת בסיסי נתונים סמנטיים היררכיים (בדומה לGoogle Earth), (2) טכניקות הפשטת נתונים (כלומר, מעברמvoxel לייצוג / נפח גיאומטרי) תואם עם עיצוב בעזרת מחשב (CAD) תוכנה כדי להפחית באופן משמעותי את כמות הנתונים ובכך מאפשר את התצוגה של נפחים גדולים יותר 35, (3) טכניקות הדמיה, כפי שהם משמשים לעתים קרובות ב תחומי הנדסה, כמו גם יכולות (4) אנימציה מתקדמת וביצירת סרטים, כוללים אנימציות לטוס דרך (בדומה למה שפותח עבור תעשיית המשחקים).

ברור, הבלטת תכונות יעילה ופילוח נמצאים בלב של מהפכה הקרובה בהדמיה ברזולוציה גבוהה סלולרית, ובזמן שתמיד יש צורך בגישות טובות יותר, את העקרונות שהוצגו כאן, כמו גם דוגמאות של מה גישה נלקחו עבור סוגי נתונים שונים , יספק מידע רב ערך לקבלת החלטה על שמתקרבת לקחת.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amira FEI Visualization Sciences Group http://www.vsg3d.com/amira/overview
Chimera UCSF http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Fiji/ImageJ National Institute of Health http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/
IMOD Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells http://bio3d.colorado.edu/imod/
Photoshop Adobe http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html
MATLAB MathWorks http://www.mathworks.com/
VLFeat VLFeat http://www.vlfeat.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auer, M. Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine. J Mol Med (Berl). 78 (4), 191-202 (2000).
  2. Johnson, M. C., Rudolph, F., Dreaden, T. M., Zhao, G., Barry, B. A., Schmidt-Krey, I. Assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography. Journal of visualized experiments JoVE. (44), e1846 (2010).
  3. Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. Journal of visualized experiments JoVE. (76), e50386 (2013).
  4. Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. Structure of HIV-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction. Journal of visualized experiments JoVE. (54), e3041 (2011).
  5. Chen, S., McDowall, A., et al. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. Journal of visualized experiments JoVE. (39), e1943 (2010).
  6. Meyerson, J. R., White, T. A., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments JoVE. (58), e2770 (2011).
  7. Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
  8. Bajaj, C., Yu, Z., Auer, M. Volumetric feature extraction and visualization of tomographic molecular imaging. J Struct Biol. 144 (1-2), 132-143 (2003).
  9. Lin, G., Adiga, U., Olson, K., Guzowski, J. F., Barnes, C. A., Roysam, B. A hybrid 3D watershed algorithm incorporating gradient cues and object models for automatic segmentation of nuclei in confocal image stacks. Cytometry A. 56 (1), 23-36 (2003).
  10. Volkmann, N. A novel three-dimensional variant of the watershed transform for segmentation of electron density maps. Journal of Structural Biology. 138 (1), 123-129 (2002).
  11. Rigort, A., Günther, D., et al. Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks. Journal of structural biology. 177 (1), 135-144 (2012).
  12. Cremers, D., Rousson, M., Deriche, R. A Review of Statistical Approaches to Level Set Segmentation. Integrating Color, Texture, Motion and Shape. International Journal of Computer Vision. 72 (2), 195-215 (2007).
  13. Lin, Z., Davis, L. S. Shape-based human detection and segmentation via hierarchical part-template matching. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 32 (4), 604-618 (2010).
  14. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  15. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  16. Zhang, Q., Bettadapura, R., Bajaj, C. Macromolecular structure modeling from 3D EM using VolRover 2.0. Biopolymers. 97 (9), 709-731 (2012).
  17. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
  18. Heymann, J. A. W., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of structural biology. 155 (1), 63-73 (2006).
  19. Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2588 (2011).
  20. Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chemical Geology. 261 (3-4), 217-229 (2009).
  21. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
  22. Frangakis, A. S., Hegerl, R. Noise reduction in electron tomographic reconstructions using nonlinear anisotropic diffusion. Journal of structural biology. 135 (3), 239-250 (2001).
  23. Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. Journal of Structural Biology. 144 (1), 114-122 (2003).
  24. Van der Heide, P., Xu, X. P., Marsh, B. J., Hanein, D., Volkmann, N. Efficient automatic noise reduction of electron tomographic reconstructions based on iterative median filtering. Journal of structural biology. 158 (2), 196-204 (2007).
  25. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  26. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. MathWorks. MATLAB. , (2012).
  28. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. Systems, Man and Cybernetics, IEEE Transactions on. 9, 62-66 (1979).
  29. Vedaldi, A., Fulkerson, B. VLFeat: An Open and Portable Library of Computer Vision Algorithms. , (2008).
  30. Zhu, S. C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. What are Textons? International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).
  31. Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).
  32. Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).
  33. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  34. Shin, J. B., Krey, J. F., et al. Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle. Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).
  35. Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta. Journal of Information & Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).

Tags

הנדסת ביוטכנולוגיה גיליון 90 מיקרוסקופי אלקטרונים 3D הבלטת תכונות פילוח ניתוח תמונה שחזור מעקב ידני thresholding
מvoxels לידע: מדריך מעשי לפילוח אלקטרונים מורכבים מיקרוסקופית 3D-Data
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tsai, W. T., Hassan, A., Sarkar, P., … More

Tsai, W. T., Hassan, A., Sarkar, P., Correa, J., Metlagel, Z., Jorgens, D. M., Auer, M. From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data. J. Vis. Exp. (90), e51673, doi:10.3791/51673 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter