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Immunology and Infection

In-situ-Nachweis autoreaktiver CD4-T-Zellen in Gehirn und Herz Mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Dextramers

doi: 10.3791/51679 Published: August 1, 2014

Summary

Das Protokoll zur selbst-reaktiven CD4-T-Zellen erkennen in Gehirn und Herz durch direkte Färbung mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II dextramers hat in diesem Bericht beschrieben. Für Analysen, ist eine zuverlässige Methode, um die Frequenzen von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen in situ aufzuzählen auch entwickelt.

Introduction

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Die Verwendung von Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse II Tetramere zum Nachweis von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen war eine Herausforderung 1-7. Um die Nachweisempfindlichkeit von MHC-Klasse II Tetramere zu steigern, hat das Forschungsteam der nächsten Generation Tetramere, bezeichnet "dextramers" 8 erstellt. Dextramers enthalten Dextran-Backbones, in denen mehrere Streptavidin-Fluorophoreinheiten konjugiert sind, so dass mehrere Peptid-gebundenen, biotinylierten MHC-Monomere kann auf eine Dextranmolekül 9 befestigt werden. Somit können große Aggregate von MHC dextramers die mehrere MHC-Peptid-Komplexe enthalten, mit mehreren T-Zell-Rezeptoren (TCRs) interagieren.

Diese Gruppe zuletzt erzeugten dextramers für verschiedene Autoantigene und gezeigt, dass die Erfassungsempfindlichkeit der dextramers war ungefähr fünfmal mehr als 8 Tetramere. Die experimentellen Systemen gehören experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) mit Proteolipid-Protein (PLP) 139-151 in SJL-Mäusen induziert; EAE mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) 35-55 in C57BL / 6 Mäusen; und experimentellen autoimmunen Myokarditis (EAM) mit Herz Myosin-α (Myhc) 334-352 in A / J-Mäusen induziert. Diese Studie demonstriert die Verwendung von PLP 139-151 - 334-352 und Myhc dextramers um Antigen-spezifische CD4 + T-Zellen erkennen, in situ mit Spezifität durch die Entwicklung eines direkten Färbungsprotokoll, wodurch die Notwendigkeit, um die Signale unter Verwendung von Fluorophor-Antikörper verstärken eliminiert, eine Ansatz häufig mit der Verwendung von Tetrameren eingesetzt. Zusätzlich wurde ein umfassendes Verfahren zur Bewertung Gewebe auch entwickelt worden, um zuverlässig Aufzählung der Frequenzen von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen in situ 10. Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zellen in situ ermöglicht Abgrenzung von Ereignissen durch spezifische antigene Stimuli von den durch Bystander-Aktivierung verursacht. Ebenso ist die in situ-Technik auch provides Möglichkeiten, die Kinetik der Antigen-spezifischen T-Zell-Infiltration in den Zielorganen zu verfolgen.

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Protocol

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Ethikerklärung:

Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von der Universität von Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE genehmigt.

1. Induktion von EAE

  1. Um EAE zu induzieren, bereiten das Peptid / komplettem Freund-Adjuvans (CFA) als Emulsion in 11 mit den folgenden Modifikationen: Schritt 1.1:. Vorbereitung PLP 139-151 in einer Konzentration von 1 mg / ml in 1 × phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Schritt 1.4:. verwenden 200 &mgr; l CFA-Emulsion, enthaltend 100 &mgr; g PLP 139-151 pro Tier Schritt 1.4.1: zehn Tiere zu immunisieren, bereiten 2 ml Emulsion durch Mischen von 1 ml PLP 139-151 (1 mg / ml in 1x . PBS) und ein gleiches Volumen von CFA Schritt 1.5: Injektion von 200 &mgr; l Emulsion in geteilten Dosen subkutan in den beiden Leistenbereichen (~ 75 &mgr; l jeweils) und Brustbeinregion (~ 50 &mgr; l) von fünf bis sechs Wochen alten FEMAle SJL / J-Mäusen. Die Schritte 1.7 und 1.8 gelten nicht für die Induktion von EAE.

2. Klinische Bewertung von EAE Mäusen und Ernte von Cerebrums

  1. Überwachen Sie die Tiere für Auftreten von klinischen Zeichen und erzielt das Krankheitsschwere täglich von 9. Tag nach der Immunisierung wie folgt: 0 - gesund; 1 - schlaffer Schwanz oder Hinterbein Schwäche aber nicht beides; 2 - schlaffer Schwanz und Hinterbein Schwäche; 3 - teilweise Lähmung der Hinterbeine; 4 - vollständige Lähmung der Hinterbeine; 5 - moribund oder tot 12.
  2. Euthanize die Mäuse, wenn sie eine neurologische Score von 3 oder 4 mit CO 2 zu erreichen. Um die Mäuse einschläfern, Pre-füllen die Euthanasie Kammer zunächst mit CO 2 durch Drehen der Regler der CO 2-Tank nicht mehr als 6 psi und damit die Tiere in der Kammer für ca. 5 min zu bleiben, um komplette Asphyxie zu erreichen. Weichen Sie die Tiere eingeschläfert in 70% Alkohol. Sofort legen die Tiere auf einem absorbierenden Kissen und mit einem Paar von sterilSteinpilze und Schere entlarven die Herzen durch einen Schnitt durch die Brusthöhle. Stechen Sie die richtigen Ohrmuscheln und Perfusion durch die Injektion von 10 ml kaltem 1x PBS in die linke Herzkammern der Herzen.
  3. Graben Sie den Schädel durch Kappen der Schädel im Kreis mit einem Paar gebogene Schere, und vorsichtig, drehen Sie die Schädelknochen mit einer Pinzette. Ernten Sie das Gehirn stumpf und mit einem sauberen Skalpell, separate Großhirn vom Kleinhirn. Legen Sie das Großhirn in ein Röhrchen mit kaltem 1x PBS und verlassen die Röhrchen auf Eis, bis die Verarbeitung.

3. In-situ-Färbung der Hirnschnitte mit MHC-Klasse-II-(IA n) / PLP 139-151 Dextramers

  1. Bereiten Sie 4% PBS-gepufferte niedrig schmelzenden Agarose, schmilzt durch Erhitzen bei 50 ° C und lassen Sie es in einem 40 ° C Wasserbad bis zur Verwendung.
  2. Legen Sie das Großhirn in einer Wegwerf tiefen Bodenform Histologie Kassette gehalten über Eis und gießen geschmolzene (40 ° C) Agarose. Unmittelbar, drücken Sie die Großhirn sanftmit einer Zange, um das Gewebe einzutauchen. Lassen Sie die Kassette auf Eis für 15-20 Minuten, bis die Erstarrung abgeschlossen ist.
  3. Füllen Sie die Badewanne mit Vibratoms gekühlt 1x PBS. Füllen Sie den Raum um Vibratoms Badewanne mit Eiswürfeln, die Temperatur des PBS zwischen 0 und 2 halten ° C. Fix eine saubere Rasierklinge in die Vibratom und den Blattwinkel bis 15 °.
  4. Platzierung von Gewebe in Vibratom. Schneiden Sie überschüssige Agarose von allen Seiten des eingebetteten Gewebe und die Bauchseite des Großhirns etwas aussetzen.
    1. Schmieren Vibratoms Gewebeblock mit Sekundenkleber und übertragen Sie die Agarose-eingebetteten Gewebe über die Klebefläche freigelegt, indem die Bauchfläche des Großhirns über den Kleber für Schnitte quer. Sie das Gewebe nicht bewegen, wenn das Gewebe über den Block gesetzt.
    2. Legen Sie die Vibratom Block mit der Agarose-eingebetteten Gewebe auf Eis, und damit der Leim für 15 Minuten trocknen.
  5. In der Zwischenzeit legen Sie das Gewebe chamMitglieder einer pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Füllen Sie die Vertiefungen der Gewebekammern mit 1 ml kaltem 1x PBS mit, und lassen Sie die Platte auf Eis.
    1. Die Gewebekammern vorbereiten durch das Anbringen einer dünnen Nylon Netz zum Schnitt-Ende einer 25 ml-Polypropylen-Pipette mit Superkleber; nach dem Abschneiden der überschüssigen, Gitter um die Pipette, schneiden die Pipette bis zu einer Länge von 1 cm aus dem Netz.
  6. Senken Sie die Vibratom Klinge auf das Niveau von der Oberseite des Gewebes; stellen Sie die Geschwindigkeit Vibratoms 0,22 mm / s einsetzen und schneiden mit einer Vorwärtsbewegung bis 200 um dicke Schnitte zu machen. Bringen Sie ein Gehirnschnitt pro auch mit einem weichen Pinsel Aquarell in die Gewebekammern in den Vertiefungen einer 24-Well-Platte gelegt. Halten Sie die Platte auf Eis, bis Schnitte vollständig Gewebeabbau zu verhindern. Hinweis: Befolgen Sie diese Schritte, um in insgesamt drei Abschnitte gepaart aus drei verschiedenen Regionen des Gehirns dorsalen zum ventralen Oberfläche (Abbildung 2) zu erhalten. Ein Abschnitt auswobei jedes Paar (insgesamt drei Abschnitte) in drei einzelnen Gewebekammern angeordnet sind, zum Färben mit spezifischen dextramers bezeichnet (IA e / PLP 139-151) und anti-CD4. Ebenso sind ein weiterer Satz von drei Abschnitten, die in drei einzelnen Gewebekammern angeordnet sind, zum Färben mit Steuer dextramers bezeichnet (IA e / TMEV 70-86) und anti-CD4.
  7. Übertragen Sie die drei Gewebekammern, die die für die Färbung mit spezifischen dextramers in drei Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit einer Kammer pro Vertiefung in bestimmten Abschnitten, die, 300 ul einer Cocktail enthält Allophycocyanin (APC)-konjugierte PLP 139-151 dextramers (2,5 ug / ml) und anti-CD4-Phycoerythrin (PE, 5 ug / ml) in Blockierungslösung (1 × PBS mit 2% normalem Ziegenserum) wurde vorher zugegeben. Die Vertiefungen mit einem Deckel.
  8. Ebenso übertragen die drei Kammern Gewebe, das die für die Färbung mit Steuer dextramers in drei Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit einer Kammer pro wir bezeichneten Abschnittell, in denen 300 &mgr; l eines Cocktails, enthaltend APC-konjugiertem TMEV 70-86 dextramers (2,5 ug / ml) und anti-CD4-PE (5 ug / ml) in Blocking-Lösung wurde vorher zugegeben. Die Vertiefungen mit einem Deckel. Hinweis: Lesen Sie Massilamany et al, 8 für die Zubereitung von dextramers und Dextranmoleküle vorzubereiten dextramers wurden freundlicherweise von Immudex, Kopenhagen, Dänemark, zur Verfügung gestellt..
  9. Beschriften Sie die Brunnen, und wickeln Sie die Platte mit Aluminiumfolie und legen Sie die Platte auf einem Schaukel Plattform, um sanfte Drehungen 1,5 Stunden im Dunkeln bei RT eingestellt.
  10. Nach der Inkubationszeit, waschen Gewebeschnitte auf dem Schaukel Plattform, durch die Gewebekammern Übertragung zu einem frischen und mit 1 ml kaltem 1x PBS, und vermeiden Sie Dribbling den Inhalt eines gut in die andere. Waschen dreimal wiederholt, so dass mindestens 10 min pro Waschgang. Sicherzustellen, dass die Gewebeschnitte nicht getrocknet, wie sie an den Seiten der Kammer Stick.
  11. Befestigen Sie die Teile durch die Übertragung der Gewebe chamMitglieder in eine frische und in 24-Well-Platte mit 1 ml 4% gefiltert PBS-gepufferte Paraformaldehyd (pH 7,4) auf einem Schaukel Plattform für 2 Stunden mit sanften Drehungen.
  12. Waschen dreimal wiederholt, wie in Schritt 3.10.
  13. Legen Sie die markierten und fixierten Abschnitte auf einer sauberen Objektträger mit einem Aquarell weichen Bürste. Wischen Sie überschüssiges Wasser ohne Berührung der Abschnitt, und montieren Sie den Abschnitt mit Montage Medium. Deckel mit einem mikroskopischen Deckglas und lassen Sie die Folien bei RT O / N in den dunklen Raum trocknen.
  14. Bewahren Sie die Folien in einer lichtdichten Folie Aufbewahrungsbox bei 4 ° C

4. Induktion von EAM und Sammlung der Herzen

  1. EAM induzieren, wie in Referenz 11 beschrieben.
  2. Euthanize die Mäuse am Tag 21 nach der Immunisierung mit Reinraum mit CO 2-Gasflasche ausgestattet, und genießen Sie die Tiere in 70% Alkohol. Sofort legen die Tiere auf einer saugfähigen Unterlage und mit Hilfe einer Pinzette und Schere das Herz aussetzens durch einen Schnitt durch die Brusthöhle. Stechen Sie die richtigen Ohrmuscheln und Perfusion durch die Injektion von 10 ml kaltem 1x PBS in die linke Herzkammern der Herzen. Sammeln Sie die Herzen und in Röhrchen mit kaltem 1x PBS.

5. In-situ-Färbung von Herz-Abschnitte mit MHC-Klasse-II-(IA k) / Myhc 334-352 Dextramers

  1. Bereiten Sie 4% PBS-gepufferte niedrig schmelz Agarose, schmilzt durch Erhitzen bei 50 ° C und lassen Sie es in einem 40   ° C Wasserbad bis zur Verwendung.
  2. Legen Sie die Herzen in einer Wegwerf tiefen Bodenform Histologie Kassette auf Eis gehalten, und gießen geschmolzene Agarose bei 40 ° C bis die Gewebe vollständig untergetaucht, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
  3. Folgen Sie Schritt 3.3.
  4. Schneiden Sie überschüssige Agarose von allen Seiten des eingebetteten Gewebe leicht und setzen die Basis des Herzens. Schmieren Vibratoms Gewebeblock mit Sekundenkleber und übertragen Sie die Agarose-eingebetteten Gewebe über die Klebefläche, indem die freigelegte Oberfläche desHerz über den Leim. Sie das Gewebe nicht bewegen, wenn das Gewebe über den Block gesetzt.
    1. Legen Sie die Vibratom Block mit der Agarose-eingebetteten Gewebe auf Eis, und damit der Leim für 15 Minuten trocknen.
  5. Folgen Sie den Schritten 3.5 und 3.6.
  6. Übertragen Sie die Herzen Abschnitte mit einem Aquarell weichen Bürste in die Gewebekammern in den Vertiefungen einer 24-Well-Platte gelegt. Halten Sie die Platte auf Eis, bis Schnitte ist komplett um den Abbau des Gewebes zu verhindern. Hinweis: Befolgen Sie diese Schritte, um insgesamt zu erhalten, gepaart acht Abschnitte von der Spitze zur Basis des Herzens (Abbildung 2). Legen Sie alle Teile in Gewebekammern, die Zuweisung von bis zu 3 Abschnitte pro Kammer. Ein Abschnitt von jedem Paar (insgesamt acht Bereiche) zum Färben mit spezifischen dextramers (IA k / Myhc 334-352) und anti-CD4 bezeichnet. Ebenso wird ein anderer Satz von acht Abschnitten Färbung mit Steuer dextramers (IA k / RNase 43-56) und anti-CD4 bezeichnet.
  7. Übertragen Sie diedrei Gewebekammern mit den zur Färbung mit spezifischen dextramers in drei Vertiefungen in einer Platte mit 24 Vertiefungen mit einer Kammer pro Vertiefung in bestimmten Abschnitten, die 300 &mgr; l eines Cocktails, enthaltend APC-konjugiertem Myhc 334-352 dextramers (2,5 ug / ml) und Anti-CD4-PE (5 ug / ml) in Blocking-Lösung wurde vorher zugegeben. Die Vertiefungen mit einem Deckel.
    1. Ebenso übertragen die drei Kammern Gewebe, das die für die Färbung mit Steuer dextramers in drei Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit einer Kammer je gut bezeichneten Abschnitte, in denen 300 ul einer Cocktail enthält APC-konjugierte RNase 43-56 dextramers (2,5 ug / ml) und anti-CD4-PE (5 ug / ml) in Blocking-Lösung wurde vorher zugegeben. Die Vertiefungen mit einem Deckel.
  8. Beschriften Sie die Brunnen, und wickeln Sie die Platte mit Aluminiumfolie und legen Sie die Platte auf einem Schaukel Plattform, um sanfte Drehungen 1,5 Stunden im Dunkeln bei RT eingestellt.
  9. Folgen Sie den Schritten, 3,10-3,11
  10. Wiederholen Sie den Wasch thrEis, wie in Schritt 3.10.
  11. Legen Sie die markierten und fixierten Abschnitte (bis zu drei Abschnitte / Folie) auf einem sauberen Objektträger mit einem Aquarell weichen Bürste. Wischen Sie überschüssiges Wasser ohne Berührung der Abschnitte, und montieren Sie die Abschnitte mit Montage Medium. Deckel mit einem mikroskopischen Deckglas und lassen Sie die Folien bei RT O / N in den dunklen Raum trocknen.
  12. Bewahren Sie die Folien in einer lichtdichten Folie Aufbewahrungsbox bei 4 ° C.

6. Analyse Dextramer + (dext +) CD4 + T-Zellen durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskop (LSCM) (die für beide Gehirn und Herz Sektionen)

  1. Verwenden Sie Nikon Eclipse-A1-90i konfokalen Mikroskop-System für die routinemäßige Scannen und Erfassen von Bildern. Zum Starten klicken Sie auf Öffnen der NIS-Elements AR-Software (Version 4.13).
    1. Wählen Sie "TRITC" und "Cy5"-Kanäle von der Platte. Die Anregungs-/ Emissionswellenlängen jeweils für TRITC-und Cy5-Kanäle, 561,5 nm / 553-618 nm und 640,7 nm / 663-738 nm standardmäßig angezeigt.
    2. Weisen Sie die Falsch "grün" und "rot" für das TRITC (CD4-PE) und Cy5 (dextramer-APC)-Kanäle auf.
    3. Legen Sie die Folie, um auf dem Mikroskoptisch untersucht werden und sich manuell unter 100-facher Vergrößerung. Stellen Sie die "HV" auf 110 und Offset auf "0". Klicken Sie auf "Focus" und stellen Sie die "Spannung" um die Laser zu optimieren.
    4. Klicken Sie auf "Focus"; Scannen Sie den Abschnitt von oben nach unten, und stellen Sie die "Z"-Ebene für die Bildaufnahme. Klicken Sie auf "CH-Serie" und das Bild nacheinander zu erwerben. Identifizieren dext + CD4 + T-Zellen erscheinen als gelbe punktförmige Zellen auf Co-Lokalisation der Signale sowohl von der rot (dextramers) und Grün (CD4)-Kanäle generiert.
  2. Verwenden Olympus-BX60 FV500 Konfokalmikroskop für die einfache quantitative Aufzählung von dext + CD4 + T-Zellen. Um zu beginnenKlicken offen, der FluoView-Software (Version 4.3).
    1. Wählen Sie die Farbstoffe "Cy3" und "Cy5" aus dem Drop-Down-Menü, und klicken Sie auf "Übernehmen", um die jeweiligen Laser laden. Hinweis: Die Anregung / Emissionswellenlängen für Cy3 (543 nm / pseudocolored "grün"; CD4-PE) und Cy5 (633 nm / pseudocolored "rot", dextramer-APC)-Kanäle.
    2. Legen Sie die Folie, um auf dem Objektträger untersucht werden, und konzentrieren es manuell unter geringer Vergrößerung (4x oder 10x). Klicken Sie auf "Focus", während die Cy3-Laser ist, und konzentrieren den Entzündungsherd.
    3. Ändern Sie das Ziel, 100-facher Vergrößerung. Stellen Sie die Dateigröße auf "512/512" aus dem Dropdown-Menü aus. Klicken Sie auf "Focus" und passen Sie die Werte für "PMT", "Gain" und "Offset"-Parameter, um die Laser für Cy3 und Cy5 separat zu optimieren.
    4. Klicken Sie auf "Z-Stufe", und klicken Sie dann auf "Focus", während sowohl die Laser auf. Setdie Dicke der "Z-Stufe", indem Sie auf die "up" und "down" Pfeile. Stellen Sie die "Z"-Intervall auf 2 um.
    5. Klicken Sie auf "Stop", und wählen Sie "Seq123". Klicken Sie dann auf "XYZ" und starten Sie den Erwerb "Z"-Serie Bilder für den ausgewählten Bereich innerhalb der Entzündungsherd. Speichern Sie die "Z Serienbilder" als AVI-Dateien. Um die Bilddateien zu speichern, wählen Sie das Bild aus der "Z Serienbild", und speichern Sie dann als "tiff"-Format.
  3. Untersuchen drei gekoppelten Abschnitte aus dem Großhirn, wo ein Satz von drei Abschnitten mit IA s / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 und der andere Satz aus drei Abschnitten mit IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 ausführen gefärbten quantitative Analyse.
    1. Auf ähnliche Weise analysieren acht gepaarten Abschnitte für Herz, in dem wurde ein Satz von acht Abschnitten mit IA k / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 und ein anderes an sich gefärbtt aus acht Abschnitten mit RNase 43-56 dextramers/anti-CD4.
  4. Untersuchen Sie 10 bis 15 pro Abschnitt Entzündungsherde in Gehirn-, und in jedem der Schwerpunkte erwerben einen Satz von 15 bis 25 Serienbilder nacheinander.
    1. Untersuchen insgesamt 20 Entzündungsherde aus allen acht Abschnitten des Herzens und von jedem Fokus nacheinander erwerben 10 bis 15 Serienbilder. Nehmen Sie die "Z" Serien Bilder durch Scannen der Dias in einem "Horizontal-Vertikal-up-Horizontal-Vertikal-down"-Bewegung, so dass die Wiederholung der "Z"-Serie in der gleichen Fokus wird vermieden.
    2. Nachdem Serienbilder "Z" werden erfasst, benennen Sie die Dateien durch die Identifizierung der Foliennummern, Namen der Abschnitte, und die Anzahl der "Z" Serienbilder gemacht.
      1. Verwenden Sie "ImageJ"-Software, um dext + CD4 +-T-Zellen zu zählen im Verhältnis zu der Gesamtzahl der CD4 + T-Zellen. Wählen Sie die "Art des Gegen 'in' ImageJ, überprüfen &# 8216, alle zeigen "und anfangen zu zählen, indem Sie auf die Mitte jeder Zelle und zählt weiter in verschiedenen 'Z' serielle Bilder mithilfe Seiten Pfeilen. Nachdem wir all die CD4 T-Zellen zu zählen, wählen Sie eine andere Art von Zähler und zählen die CD4 +-T-Zellen dext. Klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisse, um die Gesamtzahl der Zellen mit den zwei verschiedenen Zählern gezählt zu bekommen.
      2. Um die Gesamtzahl zu erhalten, fügen Sie die Anzahl der Zellen in allen 'Z' seriellen Bilder, die alle drei Gehirnschnitten oder alle acht Abschnitte Herzen.

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Representative Results

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In diesem Bericht, in-situ-Detektion von Antigen-spezifischen, autoreaktive CD4-T-Zellen durch direkte Färbung mit MHC-Klasse-II dextramers beschrieben. Frisch geschnittene Hirnschnitte wurden von EAE-Mäusen gewonnen und mit Cocktails enthalten PLP 139-151 (spezifischen) oder TMEV 70-86 (Kontrolle) dextramers und anti-CD4 gefärbt. Die Top-Platten in Abbildung 1 zeigt LSCM Analyse von Hirnschnitten mit PLP 139-151 dextramers (rot) und CD4-Antikörper (grün), wobei die Doppel-positiven Zellen erschienen gelb costained. Ein solches Merkmal war in den Abschnitten mit TMEV 70-86 (Kontrolle) dextramers (Bodenplatten) gefärbt fehlen. Die costained (dext + CD4 +-Zellen) zeigten punktförmige Punkte auf dem Umfang. Die quantitative Analyse der PLP-spezifische T-Zellen in Hirnschnitten involviert die folgenden Schritte (Fig. 2): 1) Abschnitte von drei Paaren gemacht wurden, und ein Abschnitt von jedem Paar wurde einzeln mit anti-CD4-und PLP 139-15 gefärbten1 dextramers. Ebenso wurden weitere Serie von drei Abschnitte mit anti-CD4-und Steuerung (TMEV 70-86) dextramers gefärbt. 2) von einem gegebenen Abschnitt wurden Entzündungsherde (10 bis 15), bezogen auf anti-CD4-Färbung identifiziert. 3) Eine Reihe von "Z" Serienbilder (15 bis 25) wurden von jedem Schwerpunkt der Reihe nach von oben nach unten mit einem zeitlichen Abstand von jeweils 2 um übernommen. Im Wesentlichen wurden 10 bis 15 ähnliche Sätze von Serienbildern 'Z', die gleiche Anzahl von Entzündungsherde in jedem Abschnitt analysiert. 4) In einzelnen Bildern, CD4 +-Zellen (grün), die Zellen positiv für beide dextramers (rot) und CD4 (grün), die als punktförmige gelbe Zellen wurden durch Markieren einzeln mit dem Open-Source-Software, ImageJ aufgezählt, und schließlich erschien, eine Gesamtsumme wurde für jeden Abschnitt, indem die Anzahl der Zellen in allen 'Z' serielle Bilder gezählt erhalten. Weil die Zellen markiert, die Möglichkeit der erzählt die Zellen in mehrere Bilder, die sindüberlappende wurde eliminiert. Somit kann eine zuverlässige Zählung der dext + Zellen im Vergleich zu der Gesamtzahl von Zellen, die CD4 erreicht werden.

Diese Studie wurde weiter ausgedehnt auf die Verwendung von dextramer Reagenzien zum Nachweis von Antigen-sensibilisierten T-Zellen in situ in EAM mit Myhc 334-352 in A / J-Mäusen, die auch ein T-Zell-vermittelten Erkrankung induziert 13,14 demonstrieren. Acht gekoppelten Herzschnitte wurden erhalten, die jeweils 200 um dick, von EAM-Mäuse (Abbildung 2). Von jedem Paar wurde ein Abschnitt (mit insgesamt 8 Sektionen) mit Myhc 334-352 dextramers und anti-CD4 gefärbt, während eine andere Gruppe von Abschnitten (insgesamt 8) wurde mit RNase 43-56 dextramers (Kontrolle) und anti gebeizt -CD4. Zwanzig Sätze von Serienbildern 'Z' entsprechend dieser vielen Entzündungsherden, die alle acht Abschnitte wurden nacheinander wie oben (Abbildung 2) erworben. Wesentlichen einen gegebenen Satz von seriellen im "Z"Altersgruppen bestanden aus 10 bis 15 Einzel vertreten einen einzigen Entzündungsherd. Die Analyse dieser Bilder durch LSCM zeigte die Anwesenheit von Zellen, die positiv für Myhc 334-352 dextramers (rot) und CD4 (grün) und erwartungsgemäß, die mit beiden dextramers und CD4-Zellen gebunden schien, als punktförmige gelbe Zellen (Abbildung 3, oben Panels) . Die Hintergrundfärbung für Steuer dextramers vernachlässigbar war (Abbildung 3, Bodenplatten). Die Gesamtzahl der dext + CD4 + T-Zellen und die Gesamtzahl der CD4 + T-Zellen wurden für jeden Abschnitt und zählt von allen Abschnitten bestimmt wurden addiert, um die Gesamtzahl für jede Untergruppe (dext + CD4 +-T-Zellen stammen; CD4 + T-Zellen).

Figur 1
1. Nachweis von PLP-spezifische CD4 + T-Zellen durch in-situ Färbung mit PLP 139-151 dextramers. EAE in SJL-Mäusen durch Immunisierung der Tiere mit PLP 139-151 in CFA induziert. Bei Beendigung wurden cerebrums von EAE-Mäusen gesammelt, in 4% Agarose eingebettet, und die Schnitte wurden unter Verwendung Vibratom hergestellt. Nach der Färbung mit Cocktails, die entweder PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 oder TMEV 70-86 dextramers (Kontrolle) / anti-CD4 und Fixierung mit 4% PBS-gepufferte Para wurden die Schnitte gewaschen und zur Prüfung durch LSCM montiert. Top Platten: zwei getrennte Abschnitte mit PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 gefärbt. Bodenplatten: zwei getrennte Abschnitte mit TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 gefärbt. Linke Seite: CD4, grün; Mitteltafel: dextramers, rot; Rechts: zusammengeführt (Pfeile, dext + CD4 + T-Zellen). Original-Vergrößerung 1000 X (angenommen:.. Massilamany et al, 2014 Direkte Färbung mit Major Histocompatibility Complex Klasse II Dextramers erlaubt den Nachweis von Antigen-spezifische, autoreaktiver CD4-T-Zell-s In Situ PLoS ONE 9 (1):.. e87519) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Ein Ansatz zur dext + Zellen im Gehirn und Herzen zu quantifizieren. Gepaart Abschnitte aus Großhirn oder Ohrmuschel-geschnitten Herz gemacht wie dargestellt (Panel 1). Ein Abschnitt von jedem Paar, die den angegebenen Organen wurde für die Färbung mit spezifischen dextramers (Großhirn, PLP 139-151 dextramers, Herz, Myhc dextramers 334-352) bezeichnet, und die andere Gruppe von Sektionen für Steuer dextramers (Großhirn, TMEV 70 - 86; Herz, RNase 43-56). Nach Fixierung und Montage wurden die Schnitte untersucht, um Entzündungsherde basierend auf der Färbung mit CD4 durch LSCM (original mag lokalisierengrößerung, 40X) (Panel 2). Jeder Entzündungsherd wie im dreidimensionalen (3D) Ansicht (Panel 3) visualisiert wurde auf eine Reihe von "Z" Serienbilder nacheinander (Panel 4) unterzogen. In allen Bildern wurden die Zellen positiv für beide spezifische oder Kontroll dextramers und CD4 oder CD4 allein mit 'ImageJ "-Software (angenommen gezählt:.. Massilamany et al, 2014 Direkte Färbung mit Major Histocompatibility Complex Klasse II Dextramers erlaubt den Nachweis von Antigen- Spezifische, autoreaktiver CD4-T-Zellen in situ PLoS ONE 9 (1):.. e87519) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig. 3
3. Nachweis von Herzmyosin-spezifischen CD4-T-Zellen durch in-situ + CD4 + (angenommen:.. Massilamany et al, 2014 Direkte Färbung mit Major Histocompatibility Complex Klasse II Dextramers erlaubt den Nachweis von Antigen-spezifische, autoreaktiver CD4-T-Zellen in situ PLoS ONE 9 (1):. E87519). Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Im Gegensatz zu MHC-Klasse-I-Tetrameren, die Verwendung von MHC-Klasse-II-Tetramere für Routine-Anwendungen weiterhin eine Herausforderung sein, vor allem um die Vorläuferfrequenzen niedriger Affinität autoreaktiven CD4-T-Zellen, was zum Teil auf ihre Aktivierung Abhängigkeit 6,15-17 aufzuzählen. Kürzlich wurde dieses Problem durch die nächste Generation von Tetrameren, genannt umgangen "dextramers" uns erlaubt, Antigen-spezifische CD4 + T-Zellen für eine Vielzahl von Autoantigenen, wie PLP 139-151, MOG 35-55 und Myhc 334 erfassen - 352 8. In diesem Bericht wird zum ersten Mal die Nützlichkeit von MHC-Klasse II dextramers zu detektieren und zu quantifizieren selbstreaktiven CD4-T-Zellen in situ wurde mit Gehirnschnitten von Mäusen EAE und Herzschnitte von EAM Mäusen gezeigt. Auf einer Reaktion Basis bieten dextramers den Vorteil, dass eine kleine Menge des MHC / Peptid-Komplexe. In diesem Protokoll Jede Reaktion erfordert nur 0,75 ug des MHC / Peptid-Monomere. Zusätzlich staining mit dextramers ist ein Ein-Schritt-Reaktion, da dextramers mit anti-CD4-co-inkubiert, und das gesamte Verfahren, vom Gewebeschnittfärbung auf, in weniger als einem Tag beendet. Im Gegensatz dazu sind die veröffentlichten Protokolle zur in situ-Färbung mit üblichen Tetramere betreffen häufig Amplifikationsverfahren, in dem die Fluoreszenzsignale werden mit Sekundärantikörper für Fluorophore verstärkt. Als Ergebnis kann Färbeverfahren bis zu drei Tage dauern 18-20.

Weiterhin ist die Verwendung von dextramers in Hirnschnitten erlaubt den Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zellen tief in den Gewebeschnitten, sogar bis zu 50 um. Es wurde festgestellt, daß PLP 139-151 dext + CD4 +-Zellen wurde gefunden, dass sowohl perivaskulär und auch innerhalb des Parenchyms befinden. Ferner ist die Intensität der Signale von Myhc 334-352 dextramers erzeugt war niedrig, wenn der Herzschnitte mit den PLP 139-151 dextramers im Gehirn sec gegengen (Fig. 1), und eine derartige Variation kann die Eigenschaften einzigartig für jedes Organ zu reflektieren. Eine solche Variable ist der Fettgehalt, der in hohen Mengen im Hirngewebe vorhanden ist, im Gegensatz zu Herzgewebe, die hauptsächlich quergestreiften Muskelfasern, die potentiell beschränken kann leicht Diffusion dextramers in den Entzündungsherd enthält. Zur Unterstützung dieser Idee wurden Myhc 334-352 dext + Zellen, die nur bis zu einer Tiefe von bis zu 20 um in der Mehrzahl der Herz-Abschnitte festgestellt. Zusätzlich wurden Myhc 334-352 dext + Zellen vorhanden alle durch das Myokard was auf die diffuse Art der entzündlichen Infiltraten in myocarditic Läsionen verstreut.

Im Allgemeinen können zwei Hauptfaktoren negativ auf den Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zellen beeinflussen, die in situ durch LSCM. Erstens kann unzureichend Signale von Fluorophoren emittiert wird, um die Notwendigkeit, um die Signale zu verstärken, mit Fluorophor-Antikörpern führen. Zweitens, wie eine indirekte Flecking kann die Spezifität zu untergraben, da die Hintergrundfärbung für Kontrollreagenzien können auch anteilig 18,19 zu erhöhen. Diese Einschränkungen wurden durch direkte Färbung mit den dextramers umgangen. Obwohl der Nachweis von CD4 T-Zellen erfolgreich mit frischen Abschnitten dargestellt, die Verwendung von Reagenzien in dextramer gefrorene Gewebe erfordert weitere Untersuchungen, die eine Herausforderung, da die Beibehaltung der Gewebeintegrität kann schwierig sein wegen der Tendenz für Gewebe zu erhalten während verschiedener Färbung aufgelöst Schritte 18,19.

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Disclosures

Keine Interessenkonflikte erklärt wurden.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der American Heart Association und der Kinder-Kardiomyopathie Foundation (SDG2462390204001) und den National Institutes of Health (HL114669) unterstützt. CM ist ein Empfänger eines Postdoc-Forschungsstipendium Stipendium der Stiftung Myokarditis, NJ ausgezeichnet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4 °C
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4 °C
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4 °C
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4 °C
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 °C
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4 °C
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4 °C
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
Dextran conjugated SA-APC Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4 °C
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

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References

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<em>In-situ-Nachweis</em> autoreaktiver CD4-T-Zellen in Gehirn und Herz Mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Dextramers
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Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).More

Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

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