Summary

In Situ Upptäckt av autoreaktiva CD4 T-celler i hjärna och hjärta Använda MHC klass II Dextramers

Published: August 01, 2014
doi:

Summary

Protokollet för att upptäcka självreaktiva CD4 T-celler i hjärna och hjärta genom direkt färgning med MHC klass II dextramers har beskrivits i denna rapport. För omfattande analys, är en tillförlitlig metod för att räkna upp de frekvenser av antigen-specifika CD4 + T-celler på plats också fram.

Abstract

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.

Introduction

Användningen av större histokompatibilitetskomplex (MHC) klass Il-tetramerer för detektion av antigen-specifika CD4 T-celler som har varit en utmaning 1-7. För att öka känsligheten för MHC klass II tetramers upptäckt, har forskargruppen skapat nästa generations tetramers, betecknade "dextramers" 8. Dextramers innehålla dextran huvudkedjor i vilka multipla streptavidin-fluorofor-grupper är konjugerade, exempelvis att flera peptid tjudrad, biotinylerade MHC-monomerer kan bindas till en dextranmolekyl 9. Sålunda kan stora aggregat av MHC dextramers som innehåller flera MHC-peptidkomplex interagera med flera T-cellreceptorer (TCR).

Denna grupp nyligen genererade dextramers för olika självantigener och visat att känsligheten hos dextramers detektion var ca fem gånger mer än tetramerer 8. De experimentella system innefattar experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) inducerades med proteolipidprotein (PLP) 139-151 i SJL-möss; EAE inducerad med myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG) 35-55 i C57BL / 6 möss; och experimentell autoimmun myokardit (EAM) framkallad med hjärt myosin tung kedja-α (Myhc) 334-352 i A / J-möss. Denna studie demonstrerar användningen av PLP 139-151 – och Myhc 334-352 dextramers att detektera antigen-specifika CD4 T-celler in situ med specificitet genom att utveckla en direktfärgningsprotokollet, varigenom man eliminerar behovet av att förstärka signalerna från användning av fluorofor-antikroppar, en närma vanligtvis används med användning av tetramerer. Dessutom har en omfattande metod för att utvärdera vävnader också tagits fram för att på ett tillförlitligt sätt räkna upp de frekvenser av antigen-specifika CD4 T-celler på plats 10. Detektion av antigen-specifika T-celler in situ medger avgränsning av händelser som orsakas av specifika antigena stimuli från de som orsakas av bystander-aktivering. Likaså in situ teknik också provides möjligheter att spåra kinetiken av antigen-specifika T-cell infiltration i målorganen.

Protocol

Etik uttalande: Alla djurförsök har utförts i enlighet med de riktlinjer för skötsel och användning av försöksdjur och godkänts av University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE. 1. Induktion av EAE För att inducera EAE, framställa peptid / komplett Freunds adjuvans (CFA)-emulsion, såsom beskrivs i 11 med följande modifikationer: Steg 1.1:. Förbereda PLP 139-151 vid en koncentration av 1 mg / ml i 1 x fosfatbuffrad saltlös…

Representative Results

I denna rapport, in situ bestämning av antigenspecifika, autoreaktiva CD4 T-celler genom direkt färgning med MHC klass II dextramers beskrivs. Nyklippt cerebrala avsnitt härrör från EAE-möss och färgas med cocktails som innehåller PLP 139-151 (specifik) eller TMEV 70-86 (kontroll) dextramers och anti-CD4. Den översta panelerna i Figur 1 visar LSCM analys av cerebrala sektioner costained med PLP 139-151 dextramers (röd) och CD4-antikropp (grön), där de dubbel positiva celler verkade …

Discussion

Till skillnad från MHC klass I tetramers, fortsätter användningen av MHC klass II tetramers för rutinmässiga tillämpningar att vara en utmaning, särskilt för att räkna upp utgångsfrekvenserna för låg affinitet autoreaktiva CD4 T-celler, delvis på grund av deras aktivering beroende 6,15-17. Nyligen har detta problem kringgås genom att skapa nästa generationen av tetramerer, kallade "dextramers", tillåter oss att detektera antigen-specifika CD4 T-celler för ett antal autoantigener, t….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av American Heart Association och Barnens Kardiomyopati Foundation (SDG2462390204001) och National Institutes of Health (HL114669). CM är en mottagare av en postdoktoral forskning stipendium bidrag som beviljas av Myokardit Foundation, NJ.

Materials

CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4οC
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4οC
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4οC
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4οC
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 οC
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4οC
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4οC
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4οC
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4οC
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4οC
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4οC
Dextran conjugated SA-APC  Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4οC
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

References

  1. Cecconi, V., Moro, M., Del Mare, ., Dellabona, S., P, G., Casorati, Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
  2. Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
  3. Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
  4. Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
  5. Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
  6. Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
  7. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  8. Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
  9. Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
  10. Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
  11. Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654 (2014).
  12. Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
  13. Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
  14. Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
  15. Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
  16. Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
  17. Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
  18. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
  19. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
  20. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).

Play Video

Cite This Article
Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

View Video