Summary

La detección in situ de las células T CD4 Autoreactive en Cerebro y Corazón Uso Mayor de Histocompatibilidad clase II Dextramers

Published: August 01, 2014
doi:

Summary

El protocolo para detectar células autorreactivas T CD4 en el cerebro y el corazón mediante tinción directa con complejo mayor de histocompatibilidad de clase II dextramers se ha descrito en el presente informe. Para el análisis integral, un método fiable para enumerar las frecuencias de células T CD4 + específicas de antígeno in situ también se ideó.

Abstract

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.

Introduction

El uso de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II tetrámeros para la detección de las células CD4 T específicas de antígeno ha sido un reto 1-7. Para aumentar la sensibilidad de detección de MHC de clase II tetrámeros, el equipo de investigación ha creado tetrámeros de próxima generación, denominados "dextramers" 8. Dextramers contienen cadenas principales de dextrano en el que se conjugan múltiples restos de estreptavidina-fluoróforo, de manera que varios monómeros, MHC-péptido biotinilados atado se pueden unir a una molécula de dextrano 9. Por lo tanto, grandes agregados de dextramers MHC que contienen varios complejos de MHC-péptido pueden interactuar con múltiples receptores de células T (TCR).

Este grupo recientemente generada dextramers para diversos antígenos propios y demostró que la sensibilidad de detección de dextramers fue aproximadamente cinco veces más que los tetrámeros 8. Los sistemas experimentales incluyen encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inducida con proteína proteolípido (PLP) 139-151 en ratones SJL; EAE inducida con glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG) 35-55 en ratones C57BL / 6; y miocarditis autoinmune experimental (EAM) inducida con miosina cardíaca cadena pesada-α (MyHC) 334-352 en ratones A / J. Este estudio demuestra el uso de PLP139b151 – y MyHC 334-352 dextramers para detectar células T CD4 específicas de antígeno in situ con especificidad por el desarrollo de un protocolo de tinción directa, eliminando así la necesidad de amplificar las señales del uso de anticuerpos de fluoróforo, una enfoque empleado comúnmente con el uso de tetrámeros. Además, un método integral de evaluación de los tejidos también se ha ideado para enumerar de forma fiable las frecuencias de células T CD4 específicas de antígeno in situ 10. La detección de células T específicas de antígeno in situ permite la delineación de eventos causados ​​por estímulos antigénicos específicos de las causadas por la activación espectador. Del mismo modo, la técnica de in situ en también providES oportunidades para realizar un seguimiento de la cinética de infiltraciones de células T específicas de antígeno en los órganos diana.

Protocol

Declaración de Ética: Todos los procedimientos con animales se realizaron de conformidad con las directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobados por la Universidad de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE. 1. Inducción de la EAE Para inducir la EAE, preparar la emulsión péptido / adyuvante completo de Freund (CFA) como se describe en 11 con las siguientes modificaciones: Paso 1.1:. Preparar PLP139b151 a una conce…

Representative Results

En este informe, la detección in situ de antígeno-específica, autoreactive células T CD4 por tinción directa con MHC de clase II dextramers se describe. Secciones cerebrales Corte recientemente se obtuvieron a partir de ratones con EAE y se tiñeron con cócteles que contienen PLP139b151 (control) dextramers y anti-CD4 (específica) o TMEV 70-86. Los paneles superiores de la Figura 1 muestra el análisis de secciones cerebrales LSCM costained con PLP 139-151 dextramers (rojo) y de…

Discussion

A diferencia de tetrámeros de MHC de clase I, el uso de MHC de clase II tetrámeros para aplicaciones de rutina sigue siendo un reto, especialmente para enumerar las frecuencias precursoras de baja afinidad autorreactivos células T CD4, debido en parte a su dependencia de activación 6,15-17. Recientemente, este problema se evitó mediante la creación de la próxima generación de tetrámeros, llamado "dextramers," que nos permite detectar células T CD4 específicas de antígeno para un número …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Miocardiopatía la Fundación del Niño (SDG2462390204001) American Heart Association y, y los Institutos Nacionales de Salud (HL114669). CM es un beneficiario de una beca de investigación postdoctoral concedida por la Fundación La miocarditis, NJ.

Materials

CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4οC
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4οC
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4οC
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4οC
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 οC
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4οC
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4οC
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4οC
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4οC
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4οC
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4οC
Dextran conjugated SA-APC  Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4οC
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

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Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

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