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Immunology and Infection

A detecção in situ de células T CD4 autoreactive em Cérebro e Coração Usando principal de histocompatibilidade Dextramers classe II

doi: 10.3791/51679 Published: August 1, 2014

Summary

O protocolo para detectar células auto-reactivas T CD4 no cérebro e no coração por coloração direta com complexo de histocompatibilidade principal dextramers classe II foi descrito neste relatório. Para análise detalhada, um método confiável para enumerar as freqüências de células T CD4 + antígeno-específicas in situ também é concebido.

Introduction

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O uso do complexo principal de histocompatibilidade tetrâmeros (MHC) de classe II, para a detecção de células específicas para o antigénio T CD4 tem sido um desafio 1-7. Para aumentar a sensibilidade de detecção de tetrâmeros de MHC de classe II, a equipe de pesquisa criou tetrâmeros de próxima geração, designadas "dextramers" 8. Dextramers conter esqueletos de dextrano na qual várias unidades químicas da estreptavidina-fluoróforo são conjugados, de tal modo que vários monómeros, de péptidos biotinilados de MHC-tethered pode ser ligado a uma molécula de dextrano 9. Assim, grandes agregados de dextramers MHC que contêm vários complexos MHC-péptido podem interagir com múltiplos receptores de células T (TCRs).

Este grupo recentemente gerado dextramers para vários auto-antigénios e demonstrado que a sensibilidade de detecção de dextramers foi aproximadamente cinco vezes mais do que 8 tetrâmeros. Os sistemas experimentais incluem encefalomielite auto-imune experimental (EAE) induzida com proteína proteolipidica (PLP) em murganhos SJL 139-151; EAE induzida com glicoproteína de mielina oligodendrócitos (MOG) 35-55 em camundongos C57BL / 6; e miocardite auto-imune experimental (EAM) induzida com miosina cardíaca pesada cadeia-α (MyHC) 334-352 em camundongos A / J. Este estudo demonstra a utilização de PLP 139-151 - e MyHC 334-352 dextramers para detectar células específicas para o antigénio T CD4 in situ com especificidade pelo desenvolvimento de um protocolo de coloração directa, eliminando assim a necessidade de amplificar os sinais de utilizar anticorpos fluoróforo, uma aproximar comumente empregado com o uso de tetrâmeros. Além disso, um método global de avaliar tecidos também foi concebida de forma fiável para enumerar as frequências de células T CD4 + específicas para o antigénio in situ 10. Detecção de células T específicas para o antigénio in situ permite a delineação dos eventos causados ​​por estímulos antigénicos específicos de as causadas pela activação do espectador. De igual modo, a técnica em si tu também provides oportunidades de acompanhar a cinética de infiltração de células T específicas de antigénios nos órgãos-alvo.

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Protocol

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Declaração de Ética:

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovado pela Universidade de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.

1. Indução de EAE

  1. Para induzir a EAE, preparar a emulsão de péptido / adjuvante completo de Freund (CFA), como descrito em 11, com as seguintes modificações: Passo 1.1:. Preparar PLP 139-151 a uma concentração de 1 mg / ml em tampão fosfato salino 1x (PBS) Passo 1.4:. utilizar 200 ul de CFA emulsão contendo 100 ug de PLP 139-151 por animal Passo 1.4.1: imunizar dez animais, preparar 2 ml de emulsão por mistura de 1 ml de PLP 139-151 (1 mg / ml em 1x . PBS) e um volume igual de CFA Passo 1.5: injectar 200 ul de emulsão em doses divididas por via subcutânea, nas duas regiões inguinais (~ 75 ul de cada um) e a região do esterno (~ 50 ul) de cinco a seis semanas de idade femacamundongos le SJL / J. Passos 1.7 e 1.8 não são aplicáveis ​​para a indução de EAE.

2. Scoring Clínica de Ratos do EAE e colheita de Cerebrums

  1. Monitorar os animais para aparecimento de sinais clínicos, e marcar a doença gravidade diariamente a partir do dia 9 após a imunização da seguinte forma: 0 - saudável; 1 - mole cauda ou posterior membro fraqueza, mas não ambos; 2 - mole cauda e posterior membro fraqueza; 3 - paralisia parcial dos membros posteriores; 4 - paralisia completa dos membros posteriores; 5 - moribundo ou morto 12.
  2. Eutanásia dos ratinhos quando atingem uma pontuação neurológica de 3 ou 4 com CO 2. Para eutanásia os ratos, pré-preencher a câmara de eutanásia primeiro com CO 2, rodando o regulador do CO 2 tanque não superior a 6 psi e permitir que os animais para ficar dentro da câmara por cerca de 5 min para conseguir asfixia completa. Mergulhe os animais sacrificados em 70% de álcool. Imediatamente, colocar os animais sobre uma almofada absorvente e utilizando um par de estéril paraceps e tesouras expor os corações, cortando através da cavidade torácica. Perfurar o aurículas direita e perfuse injetando 10 ml de frio 1x PBS nos ventrículos esquerdos dos corações.
  3. Escavar o crânio cortando o crânio em uma forma circular usando um par de tesouras curvas, e com cuidado, virar os ossos do crânio com uma pinça. Colha o cérebro por embotar dissecção e com um bisturi limpo, cérebro separado do cerebelo. Coloque o cérebro num tubo contendo frio 1x PBS e deixar o tubo em gelo até ao processamento.

3. In Situ A coloração das secções cerebrais com MHC Classe II (IA s) / PLP 139-151 Dextramers

  1. Prepare-se 4% de agarose tamponado com PBS de ponto de fusão baixo, derreter-se aquecimento a 50 ° C e deixá-lo em um banho de água a 40 ° C até à sua utilização.
  2. Coloque o cérebro em um cassete histologia molde base profunda descartável mantido sobre o gelo, e despeje fundido (40 ° C) de agarose. Imediatamente, pressione suavemente o cérebrocom uma pinça para submergir o tecido. Deixar a cassete em gelo durante 15-20 minutos até a solidificação é completa.
  3. Encha a banheira com vibratome refrigerados 1x PBS. Encher o espaço em torno de vibratome banho com cubos de gelo para manter a temperatura de PBS entre 0 e 2 ° C. Corrigir uma lâmina de barbear limpa no vibratome e definir o ângulo da lâmina de 15 °.
  4. Colocação de tecido em vibratome. Aparar o excesso de agarose a partir de todos os lados do tecido embebido e ligeiramente expor a superfície ventral do cérebro.
    1. Smear vibratome bloco de tecido com super cola e transferir o tecido incorporado-agarose sobre a superfície colada, colocando a superfície ventral do cérebro exposto sobre a cola para seccionamento transversal. Não mova o tecido, uma vez que o tecido é definido sobre o bloco.
    2. Colocar o bloco vibratome contendo o tecido embebido-agarose em gelo, e permitir que a cola seque durante 15 minutos.
  5. Enquanto isso, coloque o tecido chamBers por um poço de uma placa de 24 poços. Encha as cavidades que contêm as câmaras de tecidos com 1 ml de PBS 1x frio, e deixar a placa em gelo.
    1. Prepare as câmaras do tecido, anexando uma fina malha de nylon para o corte final de uma pipeta de 25 ml de polipropileno com super-cola; após a remoção do excesso de malha em volta da pipeta, a pipeta para cortar um comprimento de 1 cm da malha.
  6. Diminuir a lâmina vibratome ao nível da superfície superior do tecido; definir a velocidade vibratome a 0,22 mm / seg e iniciar o corte com um movimento para frente para fazer 200 mm de espessura. Transferir uma parte cerebral por poço usando uma escova macia da aguarela nas câmaras de tecido colocados dentro dos poços de uma placa de 24 poços. Manter a placa em gelo até o corte está completa para evitar a degradação do tecido. Nota: Siga estes passos para obter no total, três seções pares de três regiões diferentes do cérebro dorsal à superfície ventral (Figura 2). Uma seção decada par (um total de três secções) colocados em três câmaras de tecido individuais são designadas por coloração com dextramers específicos (IA s / PLP 139-151) e anti-CD4. Da mesma forma, um outro conjunto de três seções que são colocados em três câmaras do tecido são atribuídas a cada coloração com dextramers controle (IA s / TMEV 70-86) e anti-CD4.
  7. Transferir as três câmaras de tecido contendo as secções designadas por coloração com dextramers específicos em três poços de uma placa de 24 poços com uma câmara por poço no qual, a 300 uL de um cocktail contendo aloficocianina (APC)-conjugados PLP 139-151 dextramers (2,5 ug / ml) e anti-CD4-ficoeritrina (PE, 5 ug / ml) em solução (PBS 1x bloqueio com 2% de soro normal de cabra) foi previamente adicionado. Cobrir os poços com tampa.
  8. Da mesma forma, transferir as três câmaras de tecido contendo as secções designadas por coloração com dextramers controlo em três poços de uma placa de 24 poços com uma câmara por nósll, em que, a 300 uL de um cocktail contendo TMEV APC-conjugado 70-86 dextramers (2,5 ug / ml) e anti-CD4-PE (5 ug / ml) em solução de bloqueio foi previamente adicionado. Cobrir os poços com tampa. Nota: Consulte o Massilamany et al, 8 para a preparação de dextramers, e as moléculas de dextrano para preparar dextramers foram gentilmente cedidas pelo Immudex, Copenhaga, Dinamarca..
  9. Rotular os poços, e enrole a placa com papel alumínio e coloque a placa em uma plataforma de balanço definido para rotações suaves durante 1,5 horas no escuro à temperatura ambiente.
  10. Após o período de incubação, lavam secções de tecido na plataforma oscilante, através da transferência das câmaras de tecido para um novo poço contendo 1 ml de PBS 1x frio, e evitar que pinga do conteúdo de um poço para o outro. Repita três vezes de lavagem, permitindo que pelo menos 10 min por lavagem. Certifique-se que as secções de tecido não ficar seco como eles podem ficar com os lados da câmara.
  11. Corrigir as seções transferindo o cham tecidobros num fresco bem na placa de 24 poços contendo 1 ml de filtrado de PBS paraformaldeído a 4% tamponado (pH 7,4) sobre uma plataforma oscilante durante 2 horas com rotação suave.
  12. Repetir a lavagem três vezes tal como descrito no passo 3.10.
  13. Coloque os cortes corados e fixas em uma lâmina de microscópio limpa com uma escova macia aquarela. Limpe o excesso de água, sem tocar na seção, e montar a seção usando meio de montagem. Cobrir com uma lamela microscópica e permitir que os slides para secar à temperatura ambiente O / N no quarto escuro.
  14. Armazenar os slides em uma caixa de armazenamento de slides à prova de luz, a 4 ° C.

4. Indução de EAM e cobrança de corações

  1. Induzir EAM, como descrito na referência 11.
  2. Eutanásia os ratos no dia 21 após a imunização usando câmara limpa equipados com CO 2 cilindro de gás, e mergulhar os animais em álcool 70%. Imediatamente, colocar os animais numa almofada absorvente, e usando um par de fórceps e tesouras expor o coraçãos, cortando através da cavidade torácica. Perfurar o aurículas direita e perfuse injetando 10 ml de frio 1x PBS nos ventrículos esquerdos dos corações. Colete os corações e coloque em tubos contendo frio 1x PBS.

5. In Situ Coloração de Seções do coração com MHC Classe II (IA k) / MyHC 334-352 Dextramers

  1. Prepare 4% PBS-tampão baixo ponto de fusão agarose, derreter por aquecimento a 50 ° C e deixá-lo em um 40   ° C banho de água até o uso.
  2. Colocar o coração numa cassete descartável profunda histologia do molde da base mantidos em gelo, e derramar fundido a 40 ° C até que os tecidos de agarose são completamente submersa tal como descrito na etapa 3.2.
  3. Siga o passo 3.3.
  4. Aparar o excesso de agarose a partir de todos os lados do tecido embebido e ligeiramente expor a base do coração. Esfregaço vibratome bloco de tecido com super-cola e transferir o tecido embebidas em agarose sobre a superfície colada, colocando a superfície exposta dacoração sobre a cola. Não mova o tecido, uma vez que o tecido é definido sobre o bloco.
    1. Colocar o bloco vibratome contendo o tecido embebido-agarose em gelo, e permitir que a cola seque durante 15 minutos.
  5. Siga os passos 3.5 e 3.6.
  6. Transferir as secções de coração utilizando uma escova macia aguarela nas câmaras de tecido colocadas no interior das cavidades de uma placa de 24 poços. Manter a placa em gelo até o corte está completa para evitar a degradação do tecido. Nota: Siga estas etapas para obter no total, oito seções pares do ápice para a base do coração (Figura 2). Coloque todas as seções em câmaras do tecido, destinando até 3 seções por câmara. Uma secção de cada par (um total de oito pontos) é designado por coloração com dextramers específicos (IA k / myhc 334-352) e anti-CD4. Da mesma forma, um outro conjunto de oito seções é designado para coloração com dextramers controle (IA k / RNase 43-56) e anti-CD4.
  7. Transferir otrês câmaras de tecido contendo as secções designadas por coloração com dextramers específicos em três poços de uma placa de 24 poços com uma câmara por poço, em que, a 300 uL de um cocktail contendo APC-conjugados myhc 334-352 dextramers (2,5 ug / ml) e anti-CD4-PE (5 ug / ml) em solução de bloqueio foi previamente adicionado. Cobrir os poços com tampa.
    1. Da mesma forma, transferir as três câmaras de tecido contendo as secções designadas por coloração com dextramers controlo em três poços de uma placa de 24 poços com uma câmara por poço, em que, a 300 uL de um cocktail contendo RNase APC-conjugado 43-56 dextramers (2,5 ug / ml) e anti-CD4-PE (5 ug / ml) em solução de bloqueio foi previamente adicionado. Cobrir os poços com tampa.
  8. Rotular os poços, e enrole a placa com papel alumínio e coloque a placa em uma plataforma de balanço definido para rotações suaves durante 1,5 horas no escuro à temperatura ambiente.
  9. Siga os passos, 3,10-3,11
  10. Repita thr lavagemgelo tal como descrito na etapa 3.10.
  11. Coloque os cortes corados e fixos (até três seções / slide) em uma lâmina de microscópio limpa com uma escova macia aquarela. Limpe o excesso de água, sem tocar as seções, e montar as seções usando meio de montagem. Cobrir com uma lamela microscópica e permitir que os slides para secar à temperatura ambiente O / N no quarto escuro.
  12. Armazenar os slides em uma caixa de armazenamento de slides à prova de luz a 4 ° C.

6. Análise de Dextramer + Cells (DEXT +) T CD4 + por Laser Scanning Confocal Microscope (LSCM) (comum a ambos cérebro eo coração Seções)

  1. Use Nikon A1-Eclipse sistema de microscópio confocal 90i para a digitalização de rotina e aquisição de imagens. Para iniciar clique em Abrir o software NIS Elements AR (versão 4.13).
    1. Escolha "TRITC" e "Cy5" canais do painel. Os comprimentos de onda, respectivamente excitação / emissão para canais TRITC e Cy5, 561,5 nm / 553-618 nm e 640,7 nm / 663-738 nm aparecem por padrão.
    2. Atribuir o pseudocolors "verde" e "vermelho" para o TRITC (CD4-PE) e Cy5 canais (dextramer-APC), respectivamente.
    3. Coloque o slide a ser examinado no palco microscópico e focar manualmente com aumento de 100X. Defina o "HV" para 110 e compensar a "0". Clique em "Focus" e ajuste a "tensão" para otimizar os lasers.
    4. Clique em "Focus"; digitalizar a seção de cima para baixo, e definir o nível de 'Z' para a aquisição da imagem. Clique em "séries CH" e adquirir a seqüência de imagens. Identificar DEXT + células T CD4 + células aparecendo puntiformes como amarelas com base na co-localização dos sinais gerados a partir de ambos os canais vermelho (dextramers) e verde (CD4).
  2. Use Olympus FV500-BX60 microscópio confocal para enumeração quantitativa fácil de células T CD4 + + DEXT. Para começarclique aberto, o software FluoView (versão 4.3).
    1. Selecione o corantes "Cy3" e "Cy5" a partir do menu drop-down, e clique em "aplicar" para carregar os respectivos lasers. Nota: os comprimentos de onda de excitação / emissão para Cy3 (543 nm / pseudocolored "verde"; CD4-PE); canais e Cy5 (dextramer-APC 633 nm / pseudocolored "vermelho").
    2. Coloque o slide a ser examinado na lâmina de microscópio, e concentrá-la manualmente em pequeno aumento (4X ou 10X). Clique em "Focus", enquanto o laser Cy3 está ligado, e se concentrar o foco inflamatório.
    3. Altere o objetivo de aumento de 100X. Defina o tamanho do arquivo para "512/512" a partir do menu drop-down. Clique em "Focus" e ajuste os valores para "PMT", "Gain" e "Offset" parâmetros para otimizar os lasers separadamente para Cy3 e Cy5.
    4. Clique em "fase Z" e clique em "Focus", enquanto ambos os lasers estão. Conjuntoa espessura da "fase Z" clicando no botão "up" e "down" setas. Defina o intervalo de "Z" para 2 m.
    5. Clique em "Stop", e escolha "Seq123". Em seguida, clique em "XYZ" e começar a aquisição de imagens da série "Z" para a área selecionada dentro do foco inflamatório. Salve as "imagens de série Z", como arquivos AVI. Para salvar os arquivos de imagem, selecione a imagem da "imagem de série Z", e, em seguida, salvar como formato "tiff".
  3. Examine três seções pares do cérebro, onde um conjunto de três seções foi corado com IA s / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 eo outro conjunto de três seções com IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 para executar análise quantitativa.
    1. Da mesma forma, analisar oito seções emparelhados para o coração, no qual, um conjunto de oito seções estava manchada de IA k / MyHC 334-352 dextramers/anti-CD4 e outro set de oito seções com RNase 43-56 dextramers/anti-CD4.
  4. Examine de 10 a 15 focos inflamatórios por seção no cérebro, e em cada foco, adquirir um conjunto de 15 a 25 imagens de série sequencial.
    1. Examine um total de 20 focos inflamatórios de todas as oito seções do coração e de cada foco adquirir de 10 a 15 imagens de série sequencial. Pegue as imagens de série 'Z', digitalizando os slides em um "up-horizontal-vertical no horizontal-vertical" movimento de modo que a repetição da série 'Z' dentro do mesmo foco é evitado.
    2. Uma vez que as imagens de série "Z" são capturados, nomear os arquivos, identificando os números de slides, nome das seções, eo número das imagens em série 'Z' tomadas.
      1. Use o software "ImageJ" para contagem de células CD4 + T + DEXT em relação ao número total de células T CD4 +. Selecione o "tipo de balcão 'em' ImageJ, verifique e# 8216; mostrar todos "e começará a contar clicando no centro de cada célula e continuar contando em diferentes '' Z imagens de série usando as setas laterais. Após a contagem de todas as células T CD4, escolha outro tipo de balcão e contagem de CD4 + DEXT + células T. Clique na guia resultados para obter o número total de células contadas com os dois contadores diferentes.
      2. Para se obter o número total, adicionar o número de células em todas as imagens seriais 'Z' representando todas as três secções cerebrais ou todas as secções de coração oito.

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Representative Results

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Neste relatório, a detecção in situ de antígeno-específicas, autoreactive células T CD4 por coloração direta com dextramers MHC classe II é descrito. Seções cerebrais Corte recentemente foram derivadas de camundongos EAE e corados com cocktails contendo PLP 139-151 (específico) ou TMEV 70-86 (controle) dextramers e anti-CD4. Os painéis de topo da Figura 1 mostra a análise de secções cerebrais LSCM costained com PLP 139-151 dextramers (vermelho) e anticorpo CD4 (verde), onde as células duplamente positivas surgiram amarelo. Tal característica estava ausente em cortes corados com TMEV 70-86 (controle) dextramers (painéis inferiores). As células costained (DEXT + CD4 +) mostrou puntiformes pontos em torno da periferia. A análise quantitativa de células T específicas de PLP em secções cerebrais envolvidos os seguintes passos (Figura 2): 1) Os pontos de três pares foram feitas, e uma secção de cada par foi manchado individualmente com anti-CD4 e PLP 139-151 dextramers. Da mesma forma, um outro conjunto de três secções foram coradas com dextramers anti-CD4 e controle (TMEV 70-86). 2) A partir de um determinado ponto, focos inflamatórios (10 a 15) foram identificados com base na coloração de anti-CD4. 3) Um conjunto de imagens em série "Z" (15 a 25) foram retiradas de cada foco sequencialmente de cima para baixo com um intervalo de 2 m entre cada um. Em essência, de 10 a 15 conjuntos semelhantes de imagens em série 'Z' representando igual número de focos inflamatórios foram analisados ​​em cada seção. 4) Em imagens individuais, as células CD4 + (verde), as células positivas para ambos os dextramers (vermelho) e CD4 (verde) que apareceu células puntiformes como amarelas foram enumerados por marcá-los individualmente usando o software de fonte aberta, ImageJ e, finalmente, um total foi obtido para cada secção, adicionando o número de células contadas em todas as imagens seriais 'Z'. Porque que as células foram marcadas, a possibilidade de contar as células em várias imagens que sãosobreposição foi eliminado. Assim, a enumeração de células fiável DEXT + em relação ao número total de células que expressam CD4 pode ser alcançado.

Este estudo foi ainda alargada para demonstrar o uso de reagentes para a detecção de células dextramer sensibilizados com antigénio T in situ em EAM induzida com myhc 334-352 em ratinhos A / J, que é também uma doença mediada por células T 13,14. Oito secções de coração emparelhados foram obtidos, cada um de 200 mm de espessura, a partir de ratinhos de EAM (Figura 2). De cada par, uma seção (com um total de 8 seções) foi corado com MyHC 334-352 dextramers e anti-CD4, enquanto que um outro conjunto de seções (8 no total) foi corado com RNase 43-56 dextramers (controle) e anti -CD4. Vinte conjuntos de imagens seriais 'Z' correspondem a que muitos focos inflamatórios representa oito secções foram adquiridos sequencialmente como acima (Figura 2). Essencialmente, um determinado conjunto de im série 'Z'idades consistiu de 10 a 15 individuais representados um único foco inflamatório. A análise destas imagens por LSCM mostrou a presença de células positivas para MyHC 334-352 dextramers (vermelho), e CD4 (verde) e expectavelmente, as células ligadas a ambas as dextramers e CD4 apareceram células puntiformes como amarelo (Figura 3, painéis superiores) . A coloração de fundo de dextramers controlo era negligenciável (Figura 3, painéis inferiores). Os números totais de células T CD4 + + DEXT e o número total de células T CD4 + foram determinados para cada secção e as contagens de todas as secções foram somados para se obter o número total de cada um dos subconjuntos (as células T CD4 + + DEXT; CD4 + células T).

Figura 1
Figura 1. Detecção de células T CD4 + específicas para PLP por in situ coloração com PLP 139-151 dextramers. EAE foi induzida em ratinhos SJL por imunização dos animais com PLP 139-151 em CFA. Na terminação, cerebrums recolhidos a partir de ratinhos com EAE foram embebidos em 4% de agarose, e os cortes foram feitos usando vibratome. Após coloração com cocktails contendo ou PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 ou TMEV 70-86 dextramers (controle) / anti-CD4 e fixação com paraformaldeído 4% PBS-tampão, os cortes foram lavados e montados para exame por LSCM. Principais painéis: duas seções separadas corados com PLP 139-151 dextramers/anti-CD4. Painéis de fundo: duas seções separadas corados com TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4. Painel esquerdo: CD4, verde; Painel médio: dextramers, vermelho; Painel direito: fundiu (células flechas, DEXT + T CD4 +). Ampliação Original 1000 X (aprovadas:.. Massilamany et al, 2014 Coloração direta com o Major de Histocompatibilidade Classe II Complexo Dextramers permite a detecção de antígeno-específica, autoreactive CD4 T celulars In Situ PLoS One 9 (1):.. e87519) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Seções Figura 2. Uma abordagem para quantificar células DEXT + em cérebros e corações. Emparelhados são feitas a partir de cérebro ou do coração extirpado-aurícula como mostrado (Painel 1). Uma secção de cada par correspondente aos órgãos indicados foi designado para coloração com dextramers específicos (cérebro, PLP 139-151 dextramers; coração, myhc dextramers 334-352), e o outro conjunto de secções para as dextramers controlo (cérebro, TMEV 70 - 86; coração, RNase 43-56). Após a fixação e montagem, os cortes foram examinados para localizar focos inflamatórios com base na coloração com CD4 por LSCM (mag originaisnification, 40X) (Painel 2). Cada foco inflamatório, como visualizado em vista tridimensional (3D) (Painel 3) foi submetido a um conjunto de imagens seriais sequencialmente 'Z' (painel 4). Em todas as imagens, as células positivas para ambos específico ou controle dextramers e CD4, ou CD4 só foram contadas utilizando software "ImageJ" (aprovadas:.. Massilamany et al, 2014 Coloração direta com o Major de Histocompatibilidade Classe II Complexo Dextramers permite a detecção de antígeno- Específico, células T CD4 autoreactive In Situ PLoS One 9 (1):.. e87519) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Detecção de células específicas de miosina cardíaca T CD4 por in situ + CD4 + (adotados:.. Massilamany et al, 2014 Coloração direta com o Major de Histocompatibilidade Classe II Complexo Dextramers permite a detecção de antígeno-específicas, as células T CD4 autoreactive In Situ PLoS One 9 (1):. E87519). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Ao contrário I tetrâmeros de MHC de classe, o uso de tetrâmeros de MHC de classe II para aplicações de rotina continua a ser um desafio, especialmente para enumerar as freqüências precursoras de células CD4 T auto-reativas de baixa afinidade, em parte devido à sua dependência de ativação 6,15-17. Recentemente, este problema foi contornado pela criação da nova geração de tetrâmeros, chamado "dextramers", permitindo-nos para as células específicas para o antigénio T CD4 para um conjunto de auto-antigénios, tais como PLP 139-151, MOG 35-55 e MyHC 334 - 352 8. Neste relatório, pela primeira vez, a utilidade da dextramers MHC classe II para detectar e quantificar as células auto-reactivas T CD4 in situ tem sido demonstrada usando seções do cérebro de ratos EAE e seções coração de camundongos EAM. Em uma base de reacção, dextramers oferecem a vantagem de exigir uma pequena quantidade de complexos de MHC / péptido. Neste protocolo, cada reação requer apenas 0,75 mg de monômeros MHC / peptídeo. Além disso, staIning com dextramers é uma reacção de um passo, uma vez que são dextramers coincubated com anti-CD4, e todo o processo, a partir de tecido de corte para a coloração, pode ser concluída em menos de um dia. Em contraste, os protocolos publicados para a coloração em situ com tetrâmeros convencionais geralmente envolvem procedimentos de amplificação, em que os sinais fluorescentes são amplificados utilizando anticorpos secundários para fluoróforos. Como um resultado, procedimentos de coloração pode levar até três dias para completar 18-20.

Além disso, o uso de dextramers nas secções cerebrais permite a detecção de células T específicas de antigénio profundas nas secções de tecidos, até um máximo de 50 um. Notou-se que PLP 139-151 células DEXT + CD4 + foram encontradas para ser localizado tanto perivascularmente e também dentro do parênquima. Além disso, a intensidade dos sinais gerados a partir de MyHC 334-352 dextramers foi baixa em secções cardíacas, quando comparado com o PLP 139-151 dextramers em sec cérebroções (Figura 1), e tal variação pode refletir as características exclusivas de cada órgão. Uma dessas variáveis ​​é o teor de lípido, que está presente em elevadas quantidades no tecido cerebral, em oposição ao tecido cardíaco que contém fibras musculares principalmente estriados que podem potencialmente restringir fácil difusão de dextramers para o foco inflamatório. Em apoio a essa noção, MyHC 334-352 células DEXT + foram detectados apenas a uma profundidade de até 20 mM de maioria de seções cardíacos. Além disso, as células MyHC 334-352 DEXT + estavam presentes espalhadas por todo o miocárdio, sugerindo a natureza difusa do infiltrado inflamatório nas lesões myocarditic.

Geralmente, dois factores importantes podem influenciar negativamente a detecção de células T específicas de antigénio in situ por LSCM. Em primeiro lugar, os sinais emitidos por insuficientes fluoróforos pode levar à necessidade de amplificar os sinais utilizando anticorpos fluoróforo. Em segundo lugar, uma mancha como indiretaing pode minar a especificidade, como a coloração de fundo para reagentes de controlo também pode aumentar proporcionalmente 18,19. Estas limitações foram contornadas por coloração direta com os dextramers. Embora, a detecção de células T CD4 + foi demonstrado com sucesso com secções frescas, o uso de reagentes dextramer em tecidos congelados requer estudos adicionais, que podem ser um desafio que a retenção do tecido da integridade pode ser difícil devido à tendência para tecidos para obter desintegrou-se durante vários passos coloração 18,19.

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Disclosures

Não há conflitos de interesses foram declaradas.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela American Heart Association e Fundação Cardiomiopatia das Crianças (SDG2462390204001) e os Institutos Nacionais de Saúde (HL114669). CM é um receptor de um pós-doutorado concessão bolsa de pesquisa concedido pela Fundação Miocardite, NJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4 °C
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4 °C
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4 °C
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4 °C
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 °C
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4 °C
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4 °C
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
Dextran conjugated SA-APC Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4 °C
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

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References

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<em>A</em> detecção <em>in situ</em> de células T CD4 autoreactive em Cérebro e Coração Usando principal de histocompatibilidade Dextramers classe II
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Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).More

Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

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