प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल वर्ग द्वितीय dextramers के साथ सीधे धुंधला द्वारा मस्तिष्क और हृदय में आत्म – प्रतिक्रियाशील CD4 टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल इस रिपोर्ट में वर्णित किया गया है. व्यापक विश्लेषण के लिए, बगल में प्रतिजन विशेष सीडी 4 + टी कोशिकाओं की आवृत्तियों गणना करने के लिए एक विश्वसनीय विधि भी तैयार कर लिया है.
This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.
प्रमुख उतक अनुरूपता परिसर का उपयोग प्रतिजन विशेष सीडी 4 टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए (MHC) वर्ग द्वितीय tetramers एक चुनौती 1-7 कर दिया गया है. MHC वर्ग द्वितीय tetramers का पता लगाने संवेदनशीलता को बढ़ाने, अनुसंधान दल नामित अगली पीढ़ी tetramers, "dextramers" 8 पैदा कर दी है. Dextramers ऐसे कई पेप्टाइड सीमित, biotinylated MHC monomers एक dextran अणु 9 से जुड़ा हो सकता है कि कई streptavidin-फ्लोरोफोरे moieties संयुग्मित जिसमें dextran अनिवार्य जरूरतों, होते हैं. इस प्रकार, कई MHC-पेप्टाइड परिसरों होते हैं कि MHC dextramers के बड़े समुच्चय कई टी सेल रिसेप्टर्स (TCRs) के साथ बातचीत कर सकते हैं.
इस समूह ने हाल ही में विभिन्न स्वयं एंटीजन के लिए dextramers उत्पन्न और dextramers का पता लगाने संवेदनशीलता लगभग tetramers 8 से अधिक पांच गुना था कि प्रदर्शन किया. प्रायोगिक प्रणाली प्रयोगात्मक autoimmune इंसेफैलोमाईलिटिस शामिल (ईएई) proteolipid प्रोटीन (पीएलपी) SJL चूहों में 139-151 से प्रेरित; EAE माइलिन oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (MOG) C57BL 6 / चूहों में 35-55 से प्रेरित; और प्रयोगात्मक autoimmune मायोकार्डिटिस (विदेश मंत्री) हृदय मायोसिन भारी श्रृंखला-α (Myhc) ए / जम्मू चूहों में 334-352 के साथ प्रेरित किया. इस अध्ययन पीएलपी 139-151 के उपयोग को दर्शाता है -, और Myhc 334-352 जिससे fluorophore एंटीबॉडी का उपयोग करने से संकेत बढ़ाना नष्ट करने की जरूरत है, एक प्रत्यक्ष धुंधला प्रोटोकॉल विकसित करके विशिष्टता के साथ बगल में प्रतिजन विशेष सीडी 4 टी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए dextramers एक दृष्टिकोण आमतौर tetramers के उपयोग के साथ कार्यरत हैं. इसके अलावा, ऊतकों के मूल्यांकन के लिए एक व्यापक विधि भी मज़बूती से सीटू 10 में प्रतिजन विशेष सीडी 4 टी कोशिकाओं की आवृत्तियों गणना करने के लिए तैयार किया गया है. बगल में प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं का पता लगाने दर्शक सक्रियण की वजह से उन से विशिष्ट प्रतिजनी उत्तेजनाओं की वजह से घटनाओं का चित्रण परमिट. इसी तरह, में सीटू तकनीक भी प्रदान करतालक्ष्य अंगों में प्रतिजन विशेष टी सेल घुसपैठ की कैनेटीक्स ट्रैक करने के लिए तों अवसरों.
MHC वर्ग मैं tetramers के विपरीत, दिनचर्या अनुप्रयोगों के लिए MHC वर्ग द्वितीय tetramers का उपयोग विशेष रूप से उनके सक्रियण निर्भरता 6,15-17 के कारण भाग में कम समानता autoreactive सीडी 4 टी कोशिकाओं के अग्रदूत आवृत्तियों गणना ?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन और बच्चों के कार्डियोमायोपैथी फाउंडेशन (SDG2462390204001), और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (HL114669) द्वारा समर्थित किया गया. मुख्यमंत्री मायोकार्डिटिस फाउंडेशन, एनजे द्वारा सम्मानित किया गया एक postdoctoral शोध फैलोशिप अनुदान के एक प्राप्तकर्ता है.
CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4οC |
MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4οC |
PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4οC |
1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4οC |
Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 οC |
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4οC |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4οC |
Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
Conical tube (15ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4οC | |
Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |