Summary
기본 기술과 투과 전자 현미경에 의한 검사에 대한 생물 표본 및 나노 물질의 동결 골절 처리의 개선이 설명되어 있습니다. 이 기술은 미세 기능과 생체막의 전문을 공개 및 재료 과학 및 나노 기술 제품에 미세 수준의 차원과 공간 데이터를 얻기위한 바람직한 방법이다.
Abstract
자연 표본, 일반적으로 생물 또는 나노 재료, 골절, 냉동 및 탄소 / 백금 "캐스팅"투과 전자 현미경에 의한 검사 대상을 생성하기 위해 복제된다 동결 골절 / 동결 에칭 프로세스에 대해 설명합니다. 시료는 액체 질소가 고 진공 하에서 냉각 온도에서 시편의 후속 파쇄와 종종 얼음 결정의 형성을 제한하는 cryoprotective 에이전트의 존재 ultrarapid 동결 속도로 실시된다. 결과 절단면 복제 및 캐스트에 표면을 세 차원 세부 사항을 부여 각도에서 탄소와 백금의 증발에 의해 안정화된다. 이 기술은 세포막과 전문 분야의 조사를 위해 특히 계몽 입증했다 및 관련 세포의 기능을 세포 형태의 이해에 크게 기여하고있다. 이 보고서에서 우리는 수행하기위한 장비 요구 사항 및 기술적 프로토콜을 조사동결 골절, 관련 용어 및 파괴 평면의 특성, 동결 골절 이미지의 해석에 대한 기존의 절차에 대한 변화 및 기준. 이 기술은 널리 세포 생물학의 많은 지역에서 미세 구조 조사에 사용되는 분자, 나노 기술에 대한 새로운 이미징 기술 등의 약속을 보유하고, 재료 과학 연구되고있다.
Introduction
개념 및 생물학적 시료의 동결 골절 처리의 실용적인 응용 프로그램은 한 세기 전 반 이상 스티어 (1)에 의해 소개되었다. 초기 장치는 작업 자체에 포함 된 유닛 하나에 서로 다른 구성 요소를 충당. 원래 장치는 개질 및 원격 조작, 고진공의 유지를위한 중요한 요구를 수용하기 위해 상업적으로 이용 가능한 기기로 정제하고, 탄소 및 금속의 증발은 투과형 전자 현미경 (도 1 및도 검진 적합한 복제본을 생성시켰다 2).
전형적인 장비는 시료 테이블과 마이크로톰 팔 regulable 액체 질소 처리량을 갖는 (그림 1)과 높은 진공 챔버로 구성되어 있습니다. 챔버는 또한 시료 스테이지 90 ° 각도 plati위한 다른 위치에서 탄소 증발을 안정화 개의 전자총 번을 수납45 ° (그림 2) - 각도 조절, 일반적으로 15 °에 그림자 NUM / 탄소. 장치의 전원이 진공 펌프를 작동하기 위해 적용되며, 전자는 패널 온도 조정 및 전자총 제어를 조절한다.
원래 시험 및 세포막의 분석 및 그들의 전문이, 3 기술로서 더욱 인기를 얻고 골절 동결 바이러스의 개선 된 이미징을 달성하기위한 수단으로 생각. 사실,이 절차는 세포와 조직과 이러한 연구의 대부분은 세포 및 분자 생물학 4-9 고전적인 기여로 서의 구조 / 기능의 관계를 해명에 통합되었습니다. 동결 골절 기술의 개발을위한 주요 목표와 이론적 근거는 종래 생물학적 전자 현미경에 사용되는 화학 물질과 정착 처리에서 도출 전자 현미경 관찰 아티팩트 해상도를 제한하는 것이었다. 여기서의 목표는 화학을 제한하는 것정착 충분한 속도로 자주 얼음 결정 생성 등의 동결 아티팩트를 제한하기 위해서 동결 방지제의 존재 하에서 시험편을 동결하고. 최근,이 기술은 나노 입자와 나노 물질의 검사를위한 분자 생물학 및 재료 과학 연구자들의 관심의 부활을 발견했다.
골절을 동결하고 동결 에칭 이미지 입체 문자를 나타내고 때로 주사 전자 현미경으로 오인한다. 그러나, 동결 골절 제제는 투과 전자 현미경에 의해 검사하는 것으로 고해상도 형태 학적 연구에 큰 기여들은 세포막의 구조 / 기능 요소의 독특한 표현이다. 냉동 처리는 골절 및 / 또는 글리세롤과 같은 동결 방지제 처리제를 이용하여 얼음 결정을 제한하기에 충분한 속도로 세포와 조직을 동결에 의해 개시된다. 표본은 다음 진공 및 담당자 파단 아르리카는 골절 표면에 탄소와 백금의 증발에 의해 생성된다. 원래 시편은 표준 EM 표본 그리드에 검색되는 복제본에서 소화된다. 동결 골절 화상의 또 다른 일반적인 오해들은 세포 표면을 묘사한다는 것이다. 동결 골절의 기본 전제는 생체막가 파괴 과정 (그림 3)에 의해 지질 이중층을 통해 분할된다는 것입니다 그러나. 생체막에이 과정이 골절면, 세포에 인접한 막의 이분자 전단지의 절반을 계시 세포질, PF-면에 인접 멤브레인의 절반의 구성을 보여준다 하나, 하나를 얻을 적 환경, EF-얼굴입니다. 트루 세포 표면 동결 골절 이미지로 표현했지만 파괴 절차에 따라 동결 에칭 이후 추가 단계가 사용되는 경우에만 표시되지 않는다. 효과적으로 표면 detai을 공개하는 이전 파단 시험편을 에칭하기 위해서는리터는 표본은 빠른 속도와 unetchablecryoprotectant없이 고정해야합니다. 기본 기능을 드러내는 골절 시험편의 표면으로부터 물의 에칭 시험편 채 상기 스테이지 사이의 온도 차이를 생성 시험편 스테이지 위에 냉각 마이크로톰 아암과 표면으로부터 승화 물을 일으키는 냉각 마이크로톰 아암을 위치시킴으로써 달성된다. 물이 동결 에칭 기동 중에 골절 시험편의 표면으로부터 승화 될 경우, 실제의 세포 표면, 세포 외 기질, 세포 골격 구조, 분자 어셈블리의 양태는 높은 해상도로 밝혀 질 수있다. 따라서 동결 골절 및 에칭을 정지하면 교체 규정하지 않지만 오히려 후자는 어느 특정 연구의 요구에 따라 필요하거나 바람직하지 않을 단계별 과정을 반영한다.
골절 다음 동결 / 동결 에칭 절차, 파 단면이 지시 evapora을 실시복제에 대한 지원과 영상 대조를 제공하기 위해 탄소와 백금의 코트를 포지티브,. 백금 / 탄소 촬상 증발 단방향 또는 회전 될 수 있고, 저항 또는 전자총 중 하나에 의해 달성된다. 알려진 각도, 일반적으로 30 °에서 단방향 그림자 - 45 °는 특정 형태 계측 학적 계산을 수행하기에 유용하다. 깊은 에칭 대상이 된 표본은 일반적으로 그림자가 회전하고이 표본의 결과 이미지는 사진으로 평가를 위해 반전된다.
과거뿐만 아니라 동결 골절 / 동결 에칭 기술의 본 목적은 종래보다 투과 전자 현미경 절차와 관련된 아티팩트 시험편 화학 고정 및 처리를 제한 할 수있다. 그러나,이 기술 및 N, 입체 내용을 부여함으로써 생물학적 물질 과학에서 형태 계측 데이터의 수집을 용이하게하는 기능에 실질적인 이점을 제공한다anotechnology 표본. 골절 동결 및 동결 에칭 절차는 복잡하고 다면적이며, 그 응용 프로그램의 일부 측면은 사용자 정의됩니다. 이 프레젠테이션 방법의 주요 특징의 조사 뷰를 제공하며, 리더가 특정 요구에 대한 연구 과정을 상세 해결하고 정의하기 위해 광범위한 프로토콜 번역 10, 11로 지칭된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
동결 골절 / 냉동 에칭을위한 생물 표본의 1 준비
- 1 시간 동안 0.1 M 인산 버퍼에 기존의 EM 고정 제 제제와 같은 2 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde) + 2 % 파라 포름 알데히드를 사용합니다. 생체 조직의 기본 고정을 수행 할 수 있습니다. 참고 : 전에 고정하지 않고 표본의 몇 가지 유형을 동결하는 것이 바람직 할 수 있지만, 보편적 인 혈액 매개 병원균주의 시편은 인간의 조직으로 구성되어 적절한 고정을 의무화.
- 기본 고정에 따라, 더 이상 하나 이상의 시간 동안 0.2 M 자당으로 보충 같은 버퍼에 시편을 씻어.
- 1 시간보다 더 0.1 M 인산염 완충액에서 25 % 글리세롤로 이루어진 동결 방지제 용액에 시편을 전송.
동결 골절에 앞서 2 냉동 및 검체의 보관
- 적절한 크기와 시편 형상의 선택 금 또는 구리 시편 스텁이 처리되고 (그림 4
- 미세 등급 겸자 및 / 또는 금속 시편 스텁 위에 시험편의 작은 게이지 주사기 바늘 위치 작은 조각을 사용.
- , 스티커로 시험편의 액체 함량을 감소 약간 여과지와 스터브의 가장자리에서 액체를 그려서 일관성 같은 접착제.
- 단일 복제본 스텁에 조직의 마운드를 만드는 작은 게이지 주사기 바늘을 사용합니다. 이중 복제본 들어, 정확하게 스텁 위에 다른 스터브와 위치를 반전하고 샌드위치 (도 5a)을 생성 시험편 표면에 가볍게 놓는다. 이 스텁 사이에서 밖으로 표본을 누르지 마십시오.
- 액체 질소와이 절연 듀어 혈관을 입력합니다. 주 : 제 용기는 시판 실린더 (도 5b)에서 프로판 가스의 작은 부피를 액화하는 데 사용되는 작은 잘 함유 금속 포스트를 수용한다. 두 번째 선박에 대한 간단한 선박을 들고 / 파티션 스토리지입니다만민은 액체 질소에서 냉동 표본을 유지.
- 프로판 웰에 위치하는 실린더 노즐을 사용하여, 실린더 밸브를 열고 가스가 액화되는 제 용기에 잘 흐르게. 참고 :주의! 프로판은 접촉시 부상을 동결 초래할 수 있습니다, 폭발하고, 질식입니다. 그러한 사용은 낮은 온도에 대한 보호 의복을 사용하여, 또한 외부 점화원을 피하기 위해주의하면서 적절한 환기를 유지하기위한 인증 화학 후드에서 프로판을 사용합니다.
- 가능한 한 빨리, 시편은 미세 학년 집게 마운트하고 신속하게 액체 질소의 제 2 유지 용기 (그림 5B)로 전송 몇 초 동안 첫 번째 용기에 액화 가스로 뛰어 픽업.
- 표본이 고정되면, 준비가 될 때까지 액체 질소에서 저장소는 동결 골절 공장으로 전송합니다. 확장을 위해 큰 저장 액체 질소 듀어 병 컨테이너 스텁을 전송원하는 경우,하지만 상관 저장 스텁 해동 허용하지 않도록주의해야한다.
동결 골절의 3 조작 기기 및 시료 처리
- 황동 홀더와 챔버로 표본을로드
- 책자 형 더블 복제 시편 홀더에 금 표본 스텁을로드 또는 액체 질소 하에서 장치를 고정하고 시료 챔버 (그림 6)에 배치 할 준비가있을 때까지 유지한다.
- 챔버는 높은 진공 (약 2 × 10-6 밀리바)를 달성하고 스테이지 액체 질소 온도까지 냉각되면, 펌프를 끄지 챔버를 배기하고, 가능한 한 신속하게 시료 테이블 상에 탑재 된 시료 스텁 위치 .
- 펌프를 켜고 고진공을 다시하고 마이크로톰 팔과 BRI에 표본 테이블 -100 ° C로 온도와 직접 액체 질소를 조정하는 전자 무대와 팔 온도 컨트롤을 사용하여액체 질소 온도로 겨.
- 파괴 과정
- 액체 질소 온도에서 고진공, -100 ºC의 스테이지 온도 마이크로톰 아암을 달성하면, 원격으로하여 시편 마운트에 시험편을 파쇄 이중 복제본 시편 홀더를 열고 (동결을 fracture_movie1.mov).
- 에칭 다음 골절위한 시편의 경우, 면도 마이크로톰 아암에 클램프 유지 면도날을 사용하여 (즉, 파단) 단계 3.2.1 대신 시험편의 표면 (동결을 etch_movie2.mov).
- 추가 동결 에칭 공정이 수행 될 경우, 몇 분에 하나 파 단면 위에 냉각 마이크로톰 아암 위치. 참고 : 절단면의이 작전은 승화 (즉, 에칭) 물입니다. 이 기동의 효과는 FRA에 더하여, 물의 승화 진정한 세포 표면, 세포 외 기질, 및 / 또는 분자 어셈블리를 공개하는 것이다가능한 화상은 세포막의 지질 이중층을 통과 직면 해있다.
- 금속 음영 및 복제 지원 증발 전자총을 사용
- 백금 / 탄소 전자 또는 저항 총을 활성화하고 30 °의 각도에서 골절 표면에 백금 / 탄소의 얇은 층 (약 2 nm의) 증발 할 수 있도록 - 45 °. 20 초 -이 문제는 보통 약 15이 필요합니다.
- 단계 3.3.1에서와 같이 탄소 또는 전자 총 저항을 활성화하고 복제본에 지원을 제공하기 위해 직접적으로 부하 (90도)에서 프랙 시험편 표면에 탄소 박막을 증발. 20 초 -이 문제는 보통 약 15이 필요합니다.
- 복제본의 검색
- 복제 음영 탄소 안정화 완료되면, 진공 펌프를 해제 벤트 챔버와 시료가 탑재 기기로부터 제거한다.
- 미세 등급 포셉 쌍을 사용하여 이중에서 각 금 시험편 스텁을 제거복제 책자 / 클램프 조심스럽게 자리 플레이트 (그림 7)에 물 표면에 스텁을 낮추는 전에 몇 초 동안 해동 할 수 있습니다. NOTE : 물 표면에 뜬다 접착 시험편 재료를 함유 탄소 / 백금 복제본.
- 미세 와이어 루프 또는 미세 등급 집게 몇 시간에 한 50 % 황산에서 5 % 중크롬산 나트륨을 함유하는 다른 스폿 판에 전사에 의해 유지 종래의 구리 전자 현미경 그리드를 사용 복제본 책략. 참고 :이 화장실은 복제본에서 실제 생물 표본 자료를 소화. 전체 강도 가정용 표백제는 중크롬산 염 / 황산 용액 대신 할 수있다.
- 소화가 완료되면, 깨끗한 물 표면으로 다시 복제본을 전송 및 표준 구리 전자 현미경 격자 상으로 검색한다. (참고 : 복제본 소화하는 동안 작은 조각으로 조각 낼 수 있지만, 심지어 아주 작은 복제본 상당한 정보를 포함 할 수 있으며, RETR해야ieved 및 검사.)가 부드러운 핸들링 년 동안 안정적으로 유지 될 것입니다 시중에서 판매하는 그리드 상자에 그리드를 지원하는 저장 복제.
동결 골절 / 에칭 복제본의 4 현미경 적 검사
- 80 kV의 - 일반적으로 50 내지 가속 전압에서의 투과형 전자 현미경의 레플리카보기.
- 표준 TEM 필름 또는 고해상도 디지털 카메라와 함께 관련 이미지를 기록한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
동결 골절 화상 해석의 핵심 전제는 골절면이 규칙 PF - 얼굴 (플라즈마 골절면)와 EF-얼굴 (세포 외 골절면) (그림에 의해 호출이 골절의 얼굴을 부여하는 세포막의 지질 이중층을 통과한다는 것입니다 3). PF-얼굴 셀 EF-얼굴의 세포질에 인접 멤브레인 지질 이중층의 절반 엑스트라 셀룰러 인접 세포막 지질 이중층의 절반이다. 동결 골절 기술은 막 구조물의 조사에 특히 유용하고 두면은 일반적 PF-면을 적게 포함 EF-얼굴 달리 많은 멤브레인 연결된 입자로 채워지으로 명쾌 다르다. 동결 골절 세포의 세포질 내용은 외관에서 일반적으로 거친 아르와 같은 핵 및 골지체로 막 결합 소기관이 쉽게 식별 할 수 있지만, 특히 공개되지 않습니다. 특히 관심을 INVE합니다이 기술을 사용 stigators 그들의 기능에 대해 해석 될 수있는 막 구조의 특수화이다. 이러한 멤브레인 관련 입자의 특정 분포, 섬모 막 전문화 및 세포 간 접합을 포함한다.
속눈썹 관련 구조
각 진핵 섬모 및 편모의 기지의 세포막에 존재하여 (도 8) 12-16 막 연관된 입자의 배열이 섬모의 축을 둘러싸 가닥으로 구성 및 모양체 목걸이로 알려져있다. 이 구조는 여러 종의 형태 학적 어느 정도의 이질성을 나타낸다 그것은 그것이 ciliogenesis 동안 모양체 샤프트의 출현 이전에 나타나고 성숙한 섬모에 제자리에 남아있는 다기능 inasmuch 것으로 추측되었다. 초기 모양체 목걸이 전자의 시간 전에 막 입자 어레이의 응집 및 조직에서 유래개발 axoneme (14)의 초기 조직의 수의 참여를 제안 ciliogenesis 동안 섬모 샤프트의 mergence.
꽉 접합 상피 Permeabi의 품 질
다양한 상피 세포에서 동결 골절 연구는 기저 국경의 혀끝의 측면을 둘러싸는 가닥과 그루브 구조를 anastomosing의 정교한 조직을 알 수있다. 이 벨트 형 구조는 단단한 접합부 또는 zonulaoccludens (도 9)로서 알려져 있고 세포층 플럭스 3, 17-20 행 상피 투과성의 조절 역할을하는 것으로 여겨진다. 더 복잡한 조직과 사람들이 "꽉"로 설명하는 동안 몇 가닥과 긴밀하게 접합은 "새는"로 설명되었다. 이 조직은 연관된에 상피의 기능을 맞추기 위해 나타난다. 꽉 접합의 PF-얼굴은 EF-얼굴 전시 compleme 동안 가닥으로 표시ntary 홈.
갭 접합과 세포 간 통신
갭 접합 (그림 10)는 다양한 조직의 동결 골절 준비에 표시 및 EF-얼굴에 PF-얼굴과 보완 구덩이에 입자의 조밀 한 배열로 표시됩니다. 이러한 구조는 세포 간 통신을 용이하게 막 사이트를 나타낼 것으로 생각된다. 그들이 존재하는 조직에있어서, 저 분자량 형광 염료 및 칼슘 플럭스의 통로의 논증들은 시그널링 분자의 통과를 위해 물리적 경로를 나타낸다고 시사 21-24 입증되었다.
상업 동결 골절 / 에칭 식물의 그림 1 레이아웃. 에서까지 가압 듀어 f를 왼쪽시료 스테이지에 액체 질소를 냉각 및 제어 된 조건 하에서 마이크로톰 아암 냉각 eeding. 중앙에서 우측으로 시료 챔버와 전자 제어 패널 부이다. 오른쪽 배기 가스가 대기로 시료 챔버를 가지고 사용되는 추가적인 액체 질소 탱크이다.
문 그림 2 동결 골절 / 에칭 식물 표본 챔버는 방향성을 목표로 전자총의 위치, 냉각 덮개를 공개 열 및 표본 황동 홀더에 시료가 위치하는 곳에 게시 할 수 있습니다. 표본의 왼쪽에있는 포트를 통해 챔버에 도입 실.
ig6highres.jpg "폭 ="500 "/> 4 / 51694fig11highres.jpg "너비 ="500 "/> 
그림 4 동결 골절 / 에칭 과정에 대한 표본 마운트의 두 가지 유형. (왼쪽) 더블 복제 시편 홀더 책자는 에칭없이 수행 기존의 동결 골절 절차에 사용됩니다. 시편은 두 개의 금 표본 스텁 사이에 샌드위치와 황동 책자에 위치한다. 시편 (동결 fract 참조 시료 챔버에서 진공하에 책자를 열어 골절된다 ure_movie1.mov). (오른쪽)은 동결 에칭에 주로 사용 마운트. 시편은 금 스텁에 위치와 황동 홀더에 잠겨 있습니다. 시편 마이크로톰 팔에 고정 된 면도날로 부드러운 면도에 의해 분열된다. 이 구성은 (동결 etch_movie2.mov보기) 에칭 과정을 위해 바람직하다. 
동결 골절 시편의 그림 5 준비 마운트합니다. 표본이 금 마운트 (A) 사이에 샌드위치와 잘 포함하는 액체 질소에 냉동 듀어는 액체 질소를 함유 유지 (배경)에 대한 후속 전송과 프로판 (전경)을 냉각 ( B).
도 동결 골절 / 에칭 식물의 시료 챔버로 도입을위한 준비에 두 번 복제 시험편 홀더 책자로 냉동 동결 파단 시험편의 위치 항 데모. 
골절을 다음과 동결 골절 / 에칭 공장에서 그림자 복제본의 그림 7 검색은. "A"는 자리 접시에 깨끗한 물 표면이다. 시편 스텁에서 떠내려 복제본이 "B"잘 복제본 조직의 소화 중크롬산 나트륨 또는 전체 강도 가정용 표백제의 산성화 솔루션을 포함로 전송됩니다. "C"는 청소 복제가 b에 이전에 전송되는 이후의 깨끗한 물 표면을 나타냅니다구리 전자 현미경 그리드 상에 검색된 eing입니다. 
그림 8 섬모 동결 골절에 의해 밝혀 관련 구조. 흰색 화살표는 ciliogenesis을받은 상피 세포의 내강 국경에 특수 멤브레인 입자 배열을 가리 킵니다. 이 입자 배열이 응급 성숙한 섬모 (검은 색 화살표)의 기지에있는 초기 섬모 목걸이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 9 골절 상피 세포막 공개를 통해 PF-와 EF-골절면의 예를 보내고. 꽉 접합부 단지의 가닥과 그루브 조직이 분명하다 및 세포 간 공간이 화살표로 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 10 쥐의 간에서 간극 결합의 동결 골절 이미지. 입자가 PF-얼굴에 분명하고 보완 피트 EF-얼굴에 분명하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
콜로이드 골드를 사용하여 넥신의 그림 (11) 면역 현지화는 간극 결합의 특정 지역화를 설명하는 동결 골절 준비에 항체를 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 12 깊은 에칭 및 회전 그림자와 빠른 동결의 예. 상피 세포는 세포질을 통해 골절되었으며 PF 얼굴은 분명 (화살촉)입니다. 화살촉 뒤에 후속 에칭에 의해 밝혀 진정한 세포 표면을 볼 수 있습니다. 하십시오 CLI이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 CK. 
그림 13 소 기관 ciliaryaxoneme를 포함하는 분자 복합체를 공개하는 깊은 에칭 및 회전 그림자와 빠른 동결의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
도입 및 상용화 다음 몇 년 동안, 동결 골절 / 에칭 과정은 널리 생물학적 막 구조의 연구에 활용 하였다. 실제로, 막 구조 전문의 일부 가장 관점 동결 골절 / 에칭 제제로 얻어졌다. 이러한 연구뿐만 아니라 세포막의 구조적 조직의 이해에 기여뿐만 아니라 구조와 기능이 관련되는 방법에 대한 통찰력을 제공했다.
루틴 생물학적 전자 현미경의 출현은 생물학적 시료에 차등 전자 밀도를 부여하기 위해 요구되는 알데히드 고정 제, 반응성 화학 물질, 중금속과 화학적 처리 자체가 아티펙트의 생성에 기여한다는 인식을 초래. 동결 골절 기술의 개발은 처리 아티팩트를 감소하기위한 노력에 부분적으로 기초 하였다. 그럼에도 불구하고, 그 동결 골절을 인정 받고/ 에칭 얼음 결정 손상하는 중요한 하나의 유물 자신의 세트를 소개합니다. 티슈 인해 미세 내용을 말살 얼음 결정의 형성을 초래 시험편을 둘러싼 질소 가스의 절연 층의 형성에 액체 질소 환경에 직접 환원 냉각 속도 급감. 이 문제는 글리세롤 등 cryoprotectants를 이용하여 액체 질소 냉각 프로판 먼저 조직을 동결함으로써 극복된다. 역사적으로, 플 런지 동결 클로로 플루오로 카본은 액체 질소에 냉각 하였다 그러나이 물질로 인해 환경에 미치는 악영향에 사용 단계적으로되고있다. 심지어 가장 cryoprotective 조건에서, 공정의 특성은 불가피하게 세포질 골절 표면처럼 거친 자갈 결과; 그러나, 막 구조를 통해 골절 세포막에서의 방향에 대하여 특정 평면 조직을 갖는 잘 조직 특징을 보여준다. 이러한 이미지는가능한 일부 경우에 얼음 결정의 피해를 최소화 글리세롤로 동결 방지제 제의 사용, 글리세롤 자체도 막 관련된 입자의 인공적인 재분배를 소개 할 수 있습니다. 또한, 글리세롤, 따라서 성공적인 에칭 기회를 제한 절단면에서 승화 될 수 없다. 후속 에칭 절차가 바람직한 경우, 시료는 하나 빠르게 액체 헬륨 또는 질소 슬러시를 사용하여 얼음 결정의 손상을 제한하는 방식으로 고정되어야하며 / 또는 쉽게 골절에서 승화 아세톤 동결 방지제 등의 사용에 의해 접근 면.
스티어의 초기 보고서는 바이러스 촬상에 집중되었지만 동결 골절 / 에칭이 더 광범위한 애플리케이션을 발견 막 구조물이다. 실제로, 같은 꽉 갭 접합 및 섬모 막 전문으로 구조는 우아 동결 골절 준비에 계시되었다. 동결 골절, 주조가개발 15, 17,24 및 멤브레인 중에 병리 25-30에서 막 분화의 이해를 달성 D 상당한 유틸리티. 본 연구실에서 이전 보고서는,기도 개발하는 동안 단단한 접합부 착체의 분화 패턴을 보여 주었다, 모양체 막 실험 감염원에 노출과 관련된 구조 및 대기 오염 물질과 담배 연기 노출과 연관된기도 상피 세포에서 단단한 접합부 착체의 열화 중단 실험 동물과 사람을 대상으로한다.
의 기술 확장 동결 골절 / 냉동 에칭 절차
여기에 설명 된 표본을 동결 액화 프로판을 사용한 급냉 법 아마도 종래의 동결 골절 생물학적 표본을 동결하는 가장 일반적인 방법이다. 그러나, 다른 방법으로 냉동 동결 에칭이 수행 될 위치를 배정해야에디션. 글리세롤이 아닌 etchablecryoprotectant 때문에 얼음 결정 형성을 제한하는 방식으로 고정되어야 동결 에칭 표본. 이는 아세톤 및 / 또는 표본 금속 표면에 대해, 액체 헬륨 또는 액체 질소로 냉각 슬러시 마운트 동결 etchablecryoprotectant을 사용함으로써 달성 될 수있다. cryoprotectants없이 급속 동결는 액화 프로판 동결 스프레이 동결 또는 높은 압력을 이용하여 이루어질 수있다.
추가 구조와 기능을 사용하여 동결 골절 기술을 관련하는 최근의 노력은 면역 조직 화학 라벨 31, 32과 콘서트에서이 기술을 충당했다. 여기에 특정 항원에 대한 항체는 효과적이고 정확하게 막 사이트 (그림 11)로 지역화 할 수 있습니다.
단방향 섀도우 동결 골절까지 가장 널리 사용되는 프로토콜이지만, 일부 실험적인 설계와 가짜 진주 목걸 급속 동결을 요구한다e 또는 제한 cryoprotection, 명암 16 (그림 12과 그림 13)을 부여하기 참 세포 표면, 세포 외 기질 및 / 또는 고분자 복합체, 및 회전 음영을 나타 내기 위해 골절 표면의 에칭과 함께.
및 분자 생물학 이미징 도구로이 기술을 사용하여 나노 기술의 동결 골절, 재료 과학의 응용에 관심이 증가하고있다. 사실, 여러 가지 방법으로 나노 물질은 동결 골절 원래 이미징을위한 수단으로 구상 된 바이러스에 대한 구조와 조직에서 일관성이있다. 또한, 제조 된 리포좀은 생체막 비슷한 형태 구조는 널리 약제의 표적 전달 지시 유전자 치료를 위해 연구되고있다. 조직은 본질적으로이기 때문에 같은 동결 골절 처리 개발까지의 구성 요소로 드러내는 이미지를 생산 상당한 유틸리티를 가질 수있다 멤브레인이러한 치료 (33) 핑 (ping).
요약하면, 동결 골절 기술은 세포막의 구성 및 기능을 특성화 역사적인 중요성왔다. 그러나, 동결 골절이 빠르게 신흥 분야에서의 발전에 기여할 거의 확실 분자 생물학 및 나노 기술과의 조정에 유틸리티의 새로운 영역을 찾는 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| Standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| Sodium dichromate | various suppliers | ||
| Sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Propane | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
References
- Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
- Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
- Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
- Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
- Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E.
- Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
- Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
- Chandler, D. E., Sharp, W. P. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kuo, J. ohn 1117, 95-132 (2014).
- Severs, N. J.
- Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
- Rohatgi, R., Snell, W. J.
- Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
- Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
- Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
- Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
- Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
- Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
- Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
- Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
- Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
- Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
- Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).
