Summary
Grundlegende Techniken und Ausgestaltungen der Gefrierbruch-Verarbeitung von biologischen Proben und Nanomaterialien für die Prüfung durch Transmissionselektronenmikroskopie beschrieben. Diese Technik ist eine bevorzugte Methode für die Entdeckung ultrastrukturelle Merkmale und Spezialisierungen von biologischen Membranen und für den Erhalt von ultrastruktureller Ebene dimensionale und räumliche Daten in den Materialwissenschaften und der Nanotechnologie-Produkte.
Abstract
Gefrierbruch-/ Gefrier Etch beschreibt einen Prozess, bei dem Proben, in der Regel biologische oder Nanomaterialien in der Natur, werden eingefroren, zerbrochen, und repliziert werden, um ein Kohlenstoff / Platin für die Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie "cast" beabsichtigt. Proben werden ultraschnellen Gefriergeschwindigkeiten unterworfen, oft in Gegenwart von Kryoschutzmitteln Eiskristallbildung zu begrenzen, mit anschließendem Brechen der Probe in flüssigem Stickstoff gekühlten Temperaturen im Hochvakuum. Die resultierenden gebrochenen Oberfläche repliziert und durch Verdampfung von Kohlenstoff und Platin aus einem Winkel, der Oberfläche verleiht dreidimensionalen Detail auf die Guss stabilisiert. Diese Technik hat sich als besonders aufschlussreich für die Untersuchung von Zellmembranen und ihre Spezialisierungen bewährt und hat sich für das Verständnis der Zellform zu verwandten Zellfunktion bei. In diesem Bericht, die Geräteanforderungen und technisches Protokoll für die Durchführung überblicken wirGefrierbruch, der zugehörige Nomenklatur und Eigenschaften der Bruchflächen, Variationen über das herkömmliche Verfahren und Kriterien für die Interpretation der Gefrierbruch-Bilder. Diese Technik wurde häufig für ultrastrukturelle Untersuchung in vielen Bereichen der Zellbiologie und hält Versprechen als eine aufstrebende bildgebendes Verfahren für die molekulare, Nanotechnologie und Materialwissenschaften Studien.
Introduction
Das Konzept und die praktische Anwendung der Gefrierbruch-Verarbeitung von biologischen Proben wurde von Steere 1 mehr als die Hälfte vor einem Jahrhundert eingeführt. Die frühe Gerät angeeignet unterschiedlichen Komponenten in einem Arbeits geschlossene Einheit 1. Die ursprüngliche Vorrichtung wurde modifiziert, und um die kritische Notwendigkeit für die Fernmanipulation, Wartung von Hochvakuum aufzunehmen in handelsübliche Instrumente raffiniert, und die Verdampfung von Kohlenstoff und Metallen, um eine geeignete Prüfungs durch Transmissionselektronenmikroskopie (Abbildung 1 und Abbildung Replik zu erzeugen 2).
Das typische Instrument besteht aus einer Hochvakuumkammer mit Probentisch und Mikrotom Arm mit regelbaren flüssigem Stickstoff Durch (Abbildung 1). Die Kammer beinhaltet auch zwei Elektronenkanonen, einer zum Stabilisieren Kohlenstoffverdampfung bei 90 ° Winkel zu dem Objekttisch und der andere für plati positioniertnum / Kohlenstoff-Shadowing in einem einstellbaren Winkel, in der Regel 15 ° - 45 ° (Abbildung 2). Stromversorgung des Gerätes wird angewendet, um die Vakuumpumpe zu betreiben und elektronische Tafeln regeln Temperatureinstellung und Elektronenkanone Kontrolle.
Ursprünglich als Mittel gedacht, um eine verbesserte Abbildung von Viren zu erreichen, Gefrierbruch als eine Technik für die Untersuchung und Analyse von Zellmembranen und ihre Spezialisierungen 2, 3 gewonnen noch mehr Popularität. In der Tat hat dieses Verfahren schon fester Bestandteil der Aufklärung Struktur / Funktions-Beziehungen in Zellen und Geweben, und viele dieser Studien stehen als klassische Beiträge zur Zell-und Molekularbiologie 4-9. Das Hauptziel und Gründe für die Entwicklung der Gefrierbruchtechnik war Artefakte beobachtbar elektronenmikroskopischen Auflösung, die sich aus chemischen Fixierung und Verarbeitung in herkömmlichen biologischen Elektronenmikroskopie begrenzen. Hier ist das Ziel, chemisch zu begrenzenFixierung und die Probe mit ausreichender Geschwindigkeit und häufig in Gegenwart eines Kälteschutzmittels, um die Bildung von Eiskristallen und andere Einfrieren Artefakte begrenzen einzufrieren. In jüngerer Zeit hat diese Technik ein Wiederaufleben des Interesses von Molekularbiologen und Materialwissenschaften Ermittler zur Untersuchung von Nanopartikeln und Nanomaterialien gefunden.
Gefrierbruch-und gefrier Etch Bilder zeigen einen dreidimensionalen Charakter und manchmal irren für rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen. Jedoch sind Gefrierbruch-Zubereitungen durch Transmissionselektronenmikroskopie untersucht und ihre wichtigen Beitrag zur Hochauflösung morphologische Studien ist ihre eindeutige Darstellung der Struktur / Funktionselemente der Zellmembranen. Gefrierbruch-Verarbeitung wird durch Einfrieren von Zellen und Geweben mit ausreichender Geschwindigkeit, um Eis Kristallisation und / oder mit der Verwendung von Tieftemperaturschutzmittel, wie Glycerin begrenzen eingeleitet. Die Proben werden anschließend unter Vakuum und einem Vertreter gebrochenLICA durch Verdampfung von Kohlenstoff und Platin auf der Bruchfläche erzeugt. Die ursprüngliche Probe wird von der Replik, die auf einem Standard-EM Objektgitter abgerufen wird verdaut. Ein weiterer häufiger Fehlinterpretation der Gefrierbruch-Bilder ist, dass sie den Zelloberflächen darzustellen. Jedoch ist die Grundprämisse der Gefrierbruch ist, dass biologische Membranen durch die Lipiddoppelschicht durch die Bruchverfahren (3) aufgeteilt. Dieser Prozess in biologischen Membranen ergibt zwei Bruchflächen, eine, die die Organisation der Hälfte der Membran benachbart zu dem Zytoplasma, der PF-Fläche zeigt, und eine, die die Hälfte der bimolekularen Membranschicht, die angrenzend an die extrazelluläre ist enthüllt Milieu, das EF-Gesicht. Wahre Zelloberflächen sind nicht Gefrierbruch Bilder dargestellt, sondern nur angezeigt werden, wenn der nachfolgende Schritt hinzugefügt gefrier Radierung nach der Bruchverfahren verwendet wird. Um effektiv zu ätzen zuvor gebrochen Proben Oberfläche detai zeigenl, müssen Proben mit einer schnellen Rate und ohne unetchablecryoprotectant eingefroren werden. Ätzen von Wasser von der Oberfläche der gebrochenen Probe enthüllt zugrunde liegenden Funktionen wird durch Positionieren des Kühl Mikrotom Arm über dem Probentisch Erzeugen einer Temperaturdifferenz zwischen der Phase hält die Probe und die Kühl Mikrotom Arm, der bewirkt, daß Wasser von der Oberfläche sublimieren erreicht. Wird Wasser von der Oberfläche der gebrochenen Probe während des Gefriert Ätzen Manöver sublimiert, kann Aspekte der aktuellen Zelloberflächen, extrazelluläre Matrix, Cytoskelett-Strukturen und Molekularanordnungen mit hoher Auflösung offenbart. So Gefrierbruch und gefrier Etch sind nicht austauschbare Begriffe, sondern spiegeln eine schrittweise Prozess von denen die letztere kann nicht je nach den Bedürfnissen der jeweiligen Studie notwendig oder wünschenswert sein.
Nach dem Gefrierbruch-/ Gefrier Ätzverfahren, die Bruchflächen sind zu richten Verdampzogentive Mäntel aus Kohlenstoff und Platin, um die Unterstützung und Imaging Gegensatz zu der Replik bieten. Das Platin / Kohlenstoff Abbildungsverdampfung kann unidirektional oder Dreh und wird entweder durch Widerstand oder Elektronenkanonen erfolgt. Unidirektionale Abschattung von einem bekannten Winkel, typischerweise 30 ° - 45 °, ist nützlich bei der Durchführung bestimmter morphometrische Berechnungen. Exemplare, die zu tief Ätzen unterzogen worden sind, in der Regel sind Dreh beschattet und die resultierenden Bilder dieser Proben sind fotografisch für die Bewertung umgekehrt.
Die historische sowie ein Ziel der vorliegenden Gefrierbruch-/ Gefrier Ätztechnik ist die chemische Fixierung und Verarbeitung Probe Artefakte, die mit mehr konventionellen Transmissionselektronenmikroskopie Verfahren verbunden sind, begrenzen. Allerdings bietet diese Technik eine wesentliche Vorteil in der Fähigkeit, dreidimensionale Detail verleihen und damit Erwerb von morphometrischen Daten in biologischen, Materialwissenschaften zu erleichtern, und nanotechnology Proben. Gefrierbruch-und gefrier Etch Verfahren sind komplex und vielschichtig und einige Aspekte ihrer Anwendung zugeschnitten sind. Diese Präsentation gibt einen Überblick Ansicht der wichtigsten Funktionen des Prozesses und der Leser wird auf umfassende veröffentlichten Protokollen 10, 11, um die Details anzugehen und gestalten den Prozess für bestimmte Forschungsbedarf bezeichnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Herstellung von biologischen Proben für Gefrierbruch-/ Gefrier Etch
- Verwenden eines herkömmlichen EM Fixiermittelformulierung wie 2% Glutaraldehyd und 2% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer für 1 Stunde. Primär Fixierung von biologischen Geweben durchzuführen. HINWEIS: Während es wünschenswert, einige Arten von Proben ohne vorherige Fixierung einzufrieren, Universal Blut übertragene Krankheitserreger Vorsichtsmaßnahmen Mandat entsprechende Fixierung, wo die Probe aus menschlichem Gewebe.
- Folgenden primären Fixierung, Spülung der Probe in dem gleichen Puffer mit 0,2 M Saccharose nicht mehr als 1 h ergänzt.
- Die Probe wird auf eine Kälteschutzmittellösung, bestehend aus 25% Glycerin in 0,1 M Phosphatpuffer für nicht mehr als 1 Stunde.
2. Einfrieren und Lagerung der Proben im Vorfeld der Gefrierbruch
- Wählen Sie Gold oder Kupfer Probe Stubs von geeigneter Größe und Form für die Probe verarbeitet werden (Abbildung 4
- Mit feinen Pinzette Klasse und / oder kleine Gauge-Spritze Nadeln kleine Fragmente Position der Probe auf der Spitze einer Metallprobe Stummel.
- Reduzieren Sie den Flüssigkeitsgehalt der Probe zu einer klebrigen, Konsistenz leicht kleben durch Abziehen von Flüssigkeit aus dem Rand der Stub mit Filterpapier.
- Für einzelne Repliken, verwenden kleine Gauge-Spritze Nadeln auf einen Hügel von Gewebe auf der Stub erstellen. Für Doppel Repliken, kehren andere Stummel und die Position genau über dem Stub und legen leicht auf die Probenoberfläche zu schaffen ein Sandwich (5A). Die Probe aus zwischen den beiden Stichleitungen Drücken Sie nicht.
- Füllen Sie zwei isolierten Dewargefäßen mit flüssigem Stickstoff. Hinweis: Der erste Behälter nimmt einen Metallpfosten, die einen kleinen Brunnen, der verwendet wird, um ein kleines Volumen von Propangas aus einem handelsüblichen Zylinder (5B) verflüssigt. Der zweite Behälter ist ein partitionierten Speicher / Haltebehälter für kurzely Aufrechterhaltung gefrorenen Proben unter flüssigem Stickstoff.
- Verwendung der Zylinder Düse in der Propan gut positioniert, öffnen Sie das Flaschenventil und damit das Gas in den Brunnen des ersten Schiffes, wo es verflüssigt fließen. HINWEIS: ACHTUNG !! PROPANE ist explosiv, kann eiskalt Verletzung auf KONTAKT, und ist ein erstickend. Verwenden Propan Nur in einem Chemieabzug für einen solchen Einsatz die Betreuung auch für Fremd Zündquellen zu vermeiden, mit Kleidungsstücken Schutz gegen die niedrigen Temperaturen und die Aufrechterhaltung ausreichende Lüftung zertifiziert.
- So schnell wie möglich, nehmen Sie den Probenhalter mit feinen Pinzette Grade und tauchen sie in das verflüssigte Gas in dem ersten Behälter für einige Sekunden dann schnell in den zweiten Aufnahmebehälter mit flüssigem Stickstoff (5B) zu übertragen.
- Sobald die Proben werden eingefroren, speichern unter flüssigem Stickstoff bis bereit, auf die Gefrierbruch-Anlage zu übertragen. Übertragen Sie die Stichleitungen zu einem größeren Speicher flüssigem Stickstoff Dewar Behälter für längereSpeicher wenn gewünscht, jedoch sollte darauf geachtet werden, nicht zuzulassen, die Stubs zu tauen.
3. Betrieb des Gefrierbruch-Gerät und Probenverarbeitung
- Laden Proben auf dem Messinghalter und in die Kammer
- Laden die Goldprobe Stubs in einer Broschüre vom Typ Doppel Replik Probenhalter oder Klemmvorrichtung unter flüssigem Stickstoff und es zu halten, bis Sie sie in der Probenkammer (Abbildung 6) zu positionieren.
- Wenn die Kammer hat Hochvakuum (ca. 2 x 10 -6 mbar) erreicht und die Bühne wurde auf Temperatur von flüssigem Stickstoff gekühlt wurde, schalten Sie die Pumpe zu entlüften die Kammer, und positionieren Sie die Probe montiert Stubs auf dem Probentisch so schnell wie möglich .
- Schalten Sie die Pumpe wieder her, Hochvakuum und elektronische Bühne und Arm der Temperaturregler auf dem Probentisch Temperatur bis -100 ° C und direkte flüssigem Stickstoff auf dem Mikrotom Arm und bri einstellenng es um Temperatur von flüssigem Stickstoff.
- Die Bruchprozess
- Nach Erreichen Hochvakuum, eine Bühne Temperatur von -100 ° C und Mikrotom Arm Temperatur von flüssigem Stickstoff, fern die doppelte Replik Probenhalter dabei zu brechen die Proben auf die Probe Halterungen öffnen (gefrier fracture_movie1.mov).
- Im Fall der Proben für das Ätzen folgende Bruch soll, verwenden Sie eine Rasierklinge in einer Klammer gehalten am Mikrotom Arm zu rasieren (dh Bruch) die Oberfläche der Proben anstelle von Schritt 3.2.1 (gefrier etch_movie2.mov).
- Wenn die zugegefrier Ätzschritt durchgeführt werden soll, positioniert der gekühlten Mikrotoms Arm über die Bruchflächen für eine bis mehrere Minuten. HINWEIS: Dieses Manöver wird sublimiert (dh Etch) Wasser aus der Bruchfläche. Die Wirkung dieser Manöver ist wahr Zelloberflächen, extrazellulären Matrix und / oder molekulare Aggregate durch Sublimation von Wasser zeigen, zusätzlich zu frald Flächen durch die Lipid-Doppelschicht von Membranen vorbei.
- Metall-Shadowing und Replika Unterstützung Verdunstung mit Elektronenkanonen
- Aktivieren Sie die Platin / Kohlenstoff-Elektronenkanone oder Widerstand und lassen Sie ihn eine dünne Schicht (ca. 2 nm) aus Platin / Kohlenstoff über der Bruchfläche von einem Winkel von 30 ° zu verdampfen - 45 °. Dies erfordert in der Regel etwa 15 bis 20 Sekunden.
- Aktivieren Sie die C-Elektronenkanone oder Widerstand, wie in Schritt 3.3.1 und verdampfen eine dünne Schicht von Kohlenstoff zu der gebrochenen Probenoberfläche direkt von oben (90 °), um Unterstützung für die Replik zu geben. Dies erfordert in der Regel etwa 15 bis 20 Sekunden.
- Abruf von Repliken
- Nach Abschluss der Replikation Abschattung und Kohlenstoff-Stabilisierung, schalten Sie die Vakuumpumpe, Entlüftungs die Kammer, und entfernen Sie die Probenhalterung vom Instrument.
- Mit einem Paar feine Note Zange nehmen Sie jede Gold Probe Stummel aus der DoppelReplik Broschüre / Klemme und lassen Sie es einige Sekunden, bevor sanft Senkung der Stummel auf eine Wasseroberfläche an einer Stelle, Platte (Abbildung 7) auftauen. HINWEIS: Der Kohlenstoff / Platin Reproduktion mit anhaftenden Probenmaterial wird auf die Wasseroberfläche schwimmen.
- Manövrieren Sie die Replikate entweder mit einem feinen Drahtschlinge oder eine herkömmliche Kupfer Elektronenmikroskop Gitter durch feine Note Pinzette und Übertragung auf eine andere Stelle Platte mit 5% Natriumdichromatlösung in 50% iger Schwefelsäure für ein bis mehrere Stunden gehalten. HINWEIS: Dieses Bad verdaut die tatsächlichen biologischen Probenmaterial von der Replik. Voller Stärke Haushaltsbleiche kann für die Dichromat / Schwefelsäure-Lösung ersetzt werden.
- Wenn die Verdauung abgeschlossen ist, übertragen Sie die Replik auf eine saubere Wasseroberfläche und auf eine Standard-Kupfer-Elektronenmikroskopie Raster abzurufen. (HINWEIS: Replicas können in kleinere Stücke während der Verdauung zu fragmentieren, aber auch sehr kleine Nachbildungen können wesentliche Informationen enthalten und sollte ret seinieved und untersucht.) Store Replik Unterstützung Netze in handelsüblichen Gitterboxen, wo sie seit Jahren stabil mit leichter Handhabung zu bleiben.
4. Ultrastrukturelle Untersuchung der Gefrierbruch-/ Etch Replicas
- Ansicht Replikate in einem Transmissionselektronenmikroskop mit einer Beschleunigungsspannung typischerweise 50 bis 80 kV.
- Nehmen Sie relevante Bilder auf Standard-TEM-Film oder mit einer hochauflösenden digitalen Kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der Schlüssel Prämisse der Gefrierbruch-Bild Interpretation ist, dass Bruchflächen durch die Lipid-Doppelschicht von Membranen verleihen beiden Bruchflächen, durch das Übereinkommen der PF-Fläche (Plasma-Fraktur-face) und EF-Gesicht (extrazelluläre Fraktur-face) (Abbildung genannt geben 3). Der PF-Fläche die Hälfte der Membranlipiddoppelschicht angrenzend an das Zytoplasma der Zelle und der EF-Fläche die Hälfte der Membranlipiddoppelschicht angrenzend an das extrazelluläre Milieu. Die Gefrierbruch-Technik ist besonders nützlich zur Untersuchung der Membranstruktur und die beiden Flächen sind in der Regel deutlich unterschiedlichen wobei PF-Gesichter mit vielen Membran-assoziierten Partikel im Gegensatz zu den EF-Flächen enthalten, die weniger besiedelt. Die cytoplasmatischen Inhalt gefriergebrochenen Zellen sind typischerweise in Erscheinung grob und nicht besonders aufschluß obwohl membrangebundenen Organellen wie Zellkerne und Golgi leicht identifiziert werden können. Von besonderem Interesse für Investigators Verwendung dieser Technik sind Spezialisierungen der Membranstruktur, die für ihre Funktion interpretiert werden kann. Dazu gehören spezifische Verteilung der Membran-assoziierten Teilchen, Zilienmembran Spezialisierungen und interzellulären Verbindungen.
Zilien-assoziierte Strukturen
, Die in der Zellmembran an der Basis eines jeden eukaryotischen Zilien und Flagellen ist eine Anordnung von Membran-assoziierten Partikel in Stränge umgibt den Schaft der Flimmer organisiert und ciliare Halskette bekannt (Figur 8) 12-16. Diese Struktur zeigt eine gewisse morphologische Heterogenität in verschiedenen Arten und es wurde spekuliert, multifunktionale da sein, wie es vor der Entstehung der ciliary Welle während ciliogenesis erscheint und wird an Ort und Stelle in der reifen Zilien. Die entstehende Ciliar Halskette ergibt sich aus der Aggregation und Organisation der Membran Partikelanordnungen vor dem Zeitpunkt der EVerschmelzung der ciliary Welle während ciliogenesis vermutlich die mögliche Teilnahme an frühen Organisation der Entwicklungs Axonem 14.
Tight Junctions und epithelialen Permeabi lity
In verschiedenen Epithelien, Gefrierbruch Studien zeigen eine ausgeklügelte Organisation der Anastomosieren Strang und umlaufende Rillenstrukturen der apikalen Aspekt der basolateralen Grenzen. Dieser bandartige Struktur als tight junction oder zonulaoccludens (9) bekannt und ist vermutlich als Regulator der epithelialen Permeabilität für den paraFlussMittel 3, 17-20 handeln. Tight Junctions mit wenigen Stränge wurden als "undicht", während diejenigen mit mehr komplexe Organisation werden als "dicht" beschrieben beschrieben worden. Diese Organisation wird, um die Funktion der Epithelien, denen sie zugeordnet sind, passen. Die PF-Gesichter der tight junctions als Stränge, während der EF-Gesichter zeigen compleme erscheinenntary Rillen.
Gap Junctions und interzelluläre Kommunikation
Gap Junctions (Figur 10) werden in Gefrierbruch-Präparationen aus einer Vielzahl von Geweben und durch dichte Anordnungen von Partikeln auf PF-Flächen und komplementären Vertiefungen auf EF-Flächen dargestellt. Diese Strukturen sind vermutlich Membran-Sites, die interzelluläre Kommunikation zu erleichtern stellen. In Geweben, in denen sie vorhanden sind, Vorführungen des Durchgangs von niedermolekularen fluoreszierenden Farbstoffen und Calciumströme nachgewiesen wurden 21-24 hindeutet, daß sie einem physikalischen Weg für den Durchgang von Signalmolekülen.
Abbildung 1. Aufbau eines kommerziellen Gefrierbruch / Etch Anlage. Ganz links ist ein Druck Dewar feeding Kühl flüssigem Stickstoff auf dem Probentisch und Kühl Mikrotom Arm unter kontrollierten Bedingungen. Im Zentrum ist die Einheit mit Probenkammer und elektronische Schalttafeln nach rechts. Rechts ist eine zusätzliche Flüssigstickstofftank, auf dem das Entlüftungsgas wird verwendet, um die Probenkammer mit der Atmosphäre zu bringen.
Abbildung 2. Gefrierbruch / Etch Anlage Probenkammer mit Tür geöffnet, um Positionen gerichtet gerichtet Elektronenkanonen, Kühlgehäuse zu offenbaren, und Probe zu schreiben, in denen Proben in Messing Inhaber positioniert sind. Proben werden in die Kammer durch eine Öffnung auf der linken Seite eingeführt die Kammer.
ig6highres.jpg "width =" 500 "/> 4 / 51694fig11highres.jpg "width =" 500 "/> 
Abbildung 4. Zwei Arten von Probenhalterungen für Gefrierbruch / Etch Verfahren. (Links) Ein Doppel Replik Probenhalter Broschüre ist für herkömmliche Gefrierbruch-Verfahren durchgeführt, ohne Ätzen verwendet. Die Probe wird zwischen zwei Gold Probe Stubs eingeklemmt und in der Broschüre Messing positioniert. Die Probe wird durch das Öffnen der Broschüre unter Vakuum in der Probenkammer gebrochen (Siehe gefrier fract ure_movie1.mov). (Rechts) einer Halterung in erster Linie für die Gefriert Ätzen verwendet. Die Probe wird auf den Gold Stubs positioniert und in den Messinghalter gesperrt. Die Probe wird durch sanfte Rasur mit einem im Mikrotom Arm befestigt Rasierklinge gebrochen. Für Ätzverfahren wird diese Konfiguration bevorzugt (siehe gefrier etch_movie2.mov). 
Abbildung 5: Herstellung eines Gefrierbruchprobenhalterung. Die Probe wird zwischen zwei Gold Halterungen (A) eingeklemmt und in einem gut mit flüssigem Stickstoff eingefroren gekühlt Propan (Vordergrund) mit anschließender Überweisung auf ein Halte Dewar mit flüssigem Stickstoff (Hintergrund) ( B).
Figur 6 Nachweis der Positionierung eines gefrorenen Gefrierbruch-Probe in die Probenhalter Doppel Replik Broschüre in Vorbereitung für die Einführung in die Probenkammer des Gefrierbruch / Ätz-Anlage. 
Abbildung 7. Retrieval von Repliken folgenden Fraktur und Shadowing in der Gefrierbruch / Etch Anlage. "A" ist eine saubere Wasseroberfläche an einer Stelle, Platte. Die Replik von der Probe Stub schwamm auf "B" eine Vertiefung mit einer angesäuerten Lösung von Natriumdichromat oder voller Stärke Haushaltsbleichmittel für die Verdauung des Gewebes von der Replik übertragen. "C" steht für Anschluss an dem das gereinigte Replik vor über zu b saubere WasserflächenEing auf eine Kupfer Elektronenmikroskopie Raster abgerufen. 
Abbildung 8. Cilia verwandte Strukturen durch Gefrierbruch offenbart. Weiße Pfeile weisen auf spezielle Membranpartikelanordnungen auf der luminalen Grenze von epithelialen Zellen, die eine ciliogenesis. Diese Partikel-Arrays darstellen Entstehen begriffenen ciliary Halsketten, die an den Grundlagen emergenter und reifen Zilien (schwarzer Pfeil) befinden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 9. Bruch durch Epithelzellmembranen zeigen ing Beispiele für PF-und EF-Bruchflächen. Strang und Nut Organisation der Tight Junction-Komplexe ist offensichtlich, und die interzellulären Raum ist durch Pfeile gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 10. Ein Gefrierbruchbild eines Gap Junction in der Rattenleber. Partikel sind offensichtlich auf der PF-Gesicht und ergänzende Gruben sind offensichtlich auf der EF-Gesicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 11. Immunhistochemische Lokalisierung eines Connexin mit einem kolloidalem Gold markierten Antikörper auf einem Gefrierbruch-Vorbereitung illustriert spezifische Lokalisation auf der Gap Junction. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 12. Ein Beispiel für schnelles Einfrieren mit tiefen Ätzen und Dreh Shadowing. Die Epithelzellen hat durch das Zytoplasma gebrochen worden und ein PF-Gesicht ist offensichtlich (Pfeilspitzen). Hinter den Pfeilspitzen kann eine echte Zelloberfläche durch anschließendes Ätzen ergab, gesehen werden. Bitte click hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 13. Ein Beispiel für schnelles Einfrieren mit tiefen Ätzen und Dreh Abschattung zu Molekülkomplexe, die eine Rinderluftröhren ciliaryaxoneme offenbaren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In den Jahren nach seiner Einführung und kommerzielle Verfügbarkeit, Gefrierbruch / Etch Verfahren wurden häufig für Untersuchungen der biologischen Membran-Struktur genutzt. In der Tat haben die besten Perspektiven der einige der strukturellen Spezialisierungen von Membranen in der Gefrierbruch / Etch Präparate erhalten. Diese Studien nicht nur dazu beigetragen, das Verständnis der strukturellen Organisation der Membranen, sondern auch Einblicke in Struktur und Funktion bezogen sind.
Das Aufkommen der Routine biologischen Elektronenmikroskopie brachte eine Erkenntnis, dass chemische Behandlungen mit den Aldehyd Fixiermittel reaktiven Chemikalien, Schwermetalle erforderlichen Differenzelektronendichte an biologischen Proben übertragen sich auf die Erzeugung von Artefakten bei. Die Entwicklung der Gefrierbruchtechnik wurde zum Teil auf dem Bemühen, Verarbeitung Artefakt schmälern. Dennoch hat sich gezeigt, dass der Gefrierbruch erkannt/ Etch stellt seine eigene Reihe von Artefakten, von denen ein Groß man Eiskristall Schäden. Gewebe stürzte direkt in flüssigen Stickstoff Erfahrung eine reduzierte Kühlrate auf die Bildung einer isolierenden Schicht aus Stickstoffgas um die Probe, die bei der Bildung von Eiskristallen, die ultrastrukturelle Detail zu verwischen führt. Dieses Problem wird bei der Verwendung von Gefrierschutzmitteln, wie Glycerin und durch Einfrieren des Gewebes zuerst in flüssigem Stickstoff abgekühlt Propan überwinden. Historisch wurde stürzen Einfrieren in flüssigem Stickstoff gekühlt, sondern Fluorchlorkohlenwasserdurchgeführt diese Materialien aus der Nutzung aufgrund ihrer nachteiligen Auswirkungen auf die Umwelt nicht mehr eingesetzt. Selbst in den besten Bedingungen kryoprotektiver, die Art des Prozesses führt zwangsläufig zu einer groben Kies artige Oberfläche in cytoplasmatischen Frakturen; Jedoch Frakturen durch Membranstrukturen offenbaren gut organisierte Strukturen mit spezifischen planaren Einrichtungen relativ zu ihrer Ausrichtung in der Zellmembran. Diese Bilder sindkann nur mit der Verwendung von Tieftemperaturschutzmittel, wie Glycerin, die Eiskristall Schaden zu begrenzen, und Glycerin selbst in einigen Fällen kann auch ein Artefakt Umverteilung von Membran-assoziierten Partikel einzuführen. Darüber hinaus kann Glycerin nicht aus der Bruchfläche so die Möglichkeit für eine erfolgreiche Ätzen Begrenzung sublimiert werden. Wenn die nachfolgenden Ätzvorgang ist erwünscht, dann muss die Probe entweder rasch in einer Weise, die Eiskristall Schaden begrenzt entweder flüssiges Helium oder Stickstoff schlammgefroren und / oder durch die Verwendung eines Kälteschutzmittels, wie Aceton, die leicht von gebrochenen sublimiert genähert Oberflächen.
Obwohl erste Bericht wurde am Steer Abbilden Viren konzentriert, ist es in der Membranstruktur, die Gefrierbruch / Etch gefunden umfangreichere Anwendung. Tatsächlich Strukturen wie eng und Gap Junctions und Zilienmembran Spezialisierungen wurden elegant in Gefrierbruch-Präparate ergab. Gefrierbruch hat found erheblichen Nutzen bei der Schaffung eines Verständnisses von Membran Differenzierung während der Entwicklung 15, 17,24 und in der Membran Pathologie 25-30. Frühere Berichte von diesem Labor haben das Muster der Differenzierung von Tight Junction-Komplexe bei Atemwegs Entwicklung gezeigt, Störung der Zilienmembran Strukturen mit experimentellen Infektionserreger Engagements, Abbau von Tight Junction-Komplexe in Epithelzellen der Atemwege mit Luftschadstoffen und Tabakrauch-Exposition bei Versuchstieren und Menschen.
Technische Erweiterungen der Gefrierbruch-/ Stand-Etch-Verfahren
Die Löschmethode, die mit Flüssiggas Propan hier beschriebenen Proben einzufrieren, ist vielleicht die häufigste Methode, um das Einfrieren von biologischen Proben für herkömmliche Gefrierbruch. Allerdings müssen andere Ansätze, um ein Einfrieren eignet, wo gefrier Ätzen ist, werden durchgeführt werden,Hrsg. Da Glycerin ist ein nicht-etchablecryoprotectant, Proben für die Gefriert Ätzen muss in einer Weise, die die Bildung von Eiskristallen zu begrenzen froren werden. Dies kann durch Verwendung eines etchablecryoprotectant wie Aceton und / oder durch Einfrieren der Probenhalterung gegenüber einer Metalloberfläche mit flüssigem Helium oder flüssigem Stickstoff gekühlt Slush erfolgen. Schnelles Einfrieren ohne Kälteschutzmittel können auch unter Verwendung Sprühgefrieren oder Hochdruckgefrier in verflüssigtem Propan erreicht werden.
Die jüngsten Bemühungen zur weiteren beziehen sich Struktur und Funktion mit Gefrierbruchtechnik haben diese Technik im Konzert mit immunhistochemischen Markierung 31, 32 angeeignet. Hier können Antikörper gegen spezifische Antigene effektiv und genau zu Membranseiten (11) lokalisiert werden.
Während Gefrierbruch mit unidirektionalen Shadowing ist mit Abstand die am weitesten verbreitete Protokoll werden einige experimentelle Designs für schnelles Einfrieren mit littl nennene oder beschränkt Kryokonservierung durch Ätzen der Bruchfläche zu wahren Zelloberflächen, extrazellulären Matrix und / oder makromolekularen Komplexen und Drehschattenkontrast 16 (Abbildung 12 und Abbildung 13) verleihen offenbaren begleitet.
Es gibt ein wachsendes Interesse an Anwendungen der Gefrierbruch in der Nanotechnologie, Materialwissenschaften, und in diese Technik als bildgebendes Werkzeug in der Molekularbiologie. Tatsächlich können Nanomaterialien in vielerlei Hinsicht konsistent in ihrer Organisation mit viraler Strukturen, für die Gefrierbruch war ursprünglich als Mittel zur Bilderzeugung vorgesehen sein. Außerdem hergestellt Liposomen, in der Form ähnlich zu biologischen Membranen Strukturen, ist weit verbreitet für die gezielte Abgabe von Arzneimitteln und gerichteten Gentherapie untersucht. Weil ihre Organisation ist im Wesentlichen wie Membran, Gefrierbruch Verarbeitung erhebliche Dienstprogramm in der Herstellung enthüllt Bilder als Komponente in develo habenping diese Therapien 33.
Zusammenfassend haben Gefrierbruchtechnik von historischer Bedeutung für die Charakterisierung der Organisation und der Funktion von Zellmembranen sind. Allerdings wird der Gefrierbruch neue Bereiche der Gebrauchs in Abstimmung mit der Molekularbiologie und Nanotechnologie und fast sicher finden wird, um Fortschritte in diesen sich schnell entwickelnden Bereichen beizutragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| Standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| Sodium dichromate | various suppliers | ||
| Sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Propane | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
References
- Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
- Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
- Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
- Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
- Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E.
- Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
- Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
- Chandler, D. E., Sharp, W. P. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kuo, J. ohn 1117, 95-132 (2014).
- Severs, N. J.
- Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
- Rohatgi, R., Snell, W. J.
- Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
- Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
- Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
- Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
- Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
- Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
- Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
- Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
- Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
- Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
- Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).
