العناصر الفنية الأساسية من تجميد كسر / تجميد حفر في البيولوجية المجهر الإلكتروني

Summary

ويرد التقنيات الأساسية والتحسينات معالجة تجميد كسر العينات والمواد النانوية البيولوجية للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. هذا الأسلوب هو الأسلوب المفضل للكشف عن الملامح التركيبية والتخصصات الأغشية البيولوجية وللحصول على البيانات والأبعاد المكانية مستوى التركيبية في علوم المواد وتكنولوجيا النانو المنتجات.

Abstract

يصف تجميد كسر / تجميد عملية يتم بموجبها حفر العينات والبيولوجية عادة أو المواد متناهية الصغر في الطبيعة، والمجمدة، ومتشظية، وتكراره لتوليد الكربون / البلاتين "الزهر" يهدف للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. تخضع العينات معدلات تجميد ultrarapid، وغالبا في وجود وكلاء واق من البرد للحد من تكوين بلورات الجليد، مع انقسام لاحق من العينة في النيتروجين السائل تبريد تحت درجات حرارة عالية فراغ. يتم نسخ سطح بكسر الناتجة واستقرت عن طريق التبخر من الكربون والبلاتين من زاوية أن يمنح السطح التفاصيل ثلاثي الأبعاد لالمدلى بها. وقد أثبتت هذه التقنية المنير خاصة للتحقيق في أغشية الخلايا وتخصصاتهم، وساهمت إلى حد كبير في فهم النموذج الخلوي للخلية وظيفة ذات الصلة. في هذا التقرير، إلا أننا مسح متطلبات الصك والبروتوكول الفني لأداءتجميد الكسر، والتسمية وخصائص الطائرات كسر المرتبطة بها، الاختلافات على الإجراء التقليدي، ومعايير لتفسير الصور للتجمد الكسر. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع لتحقيق التركيبية في العديد من مجالات بيولوجيا الخلية ويبشر بالخير باعتبارها تقنية التصوير الناشئة عن الجزيئي، وتكنولوجيا النانو، ودراسات علوم المواد.

Introduction

تم تقديم مفهوم والتطبيق العملي لمعالجة تجميد كسر العينات البيولوجية بواسطة Steere ¹ قبل أكثر من نصف قرن. جهاز أوائل خصصت المكونات المتباينة إلى مكتفية ذاتيا وحدة العمل ^1. تم تعديل الجهاز الأصلي وصقلها في الأدوات المتاحة تجاريا من أجل استيعاب الحاجة الماسة للتلاعب عن بعد، وصيانة فراغ عالية، وتبخر الكربون والمعادن لإنتاج نسخة طبق الأصل مناسبة للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (الشكل 1 والشكل 2).

يتكون الصك النموذجي لفراغ الغرفة عالية مع جدول العينة وجود الذراع مشراح ريغولابلي الانتاجية النيتروجين السائل (الشكل 1). يضم غرفة أيضا على مسدسين الإلكترون، واحدة لتحقيق الاستقرار تبخر الكربون المتمركزة على 90º زاوية لمرحلة عينة والآخر لالبلاتين عيوالأسطوانات / الكربون التظليل في زاوية قابلة للتعديل، وعادة 15º - 45º (الشكل 2). يتم تطبيق السلطة الى وحدة لتشغيل مضخة فراغ والألواح الإلكترونية ينظم تعديل درجة الحرارة والإلكترون السيطرة على السلاح.

تصور أصلا كوسيلة لتحقيق تحسين التصوير من الفيروسات وتجميد كسر اكتسبت المزيد من الشعبية كأسلوب لفحص وتحليل أغشية الخلايا وتخصصاتهم ^{2، 3.} في الواقع، كان هذا الإجراء جزءا لا يتجزأ من توضيح العلاقات هيكل / وظيفة في الخلايا والأنسجة والعديد من هذه الدراسات الوقوف صفا ومساهمات الكلاسيكية إلى الخلية والبيولوجيا الجزيئية ^4-9. كان الهدف الرئيسي والأساس المنطقي لتطوير تقنية تجميد كسر للحد من التحف ملاحظتها في الإلكترون المجهري المستمدة من قرار التثبيت الكيميائية والمعالجة التقليدية المستخدمة في المجهر الإلكتروني البيولوجي. هنا الهدف هو الحد الكيميائيةتثبيت وتجميد العينة مع سرعة كافية وغالبا في وجود cryoprotectant من أجل الحد من تكوين بلورات الجليد والتحف تجميد الأخرى. وفي الآونة الأخيرة، وقد وجدت هذه التقنية تجدد الاهتمام من علماء البيولوجيا الجزيئية والمحققين علوم المواد للفحص الجسيمات النانوية والمواد النانوية.

تجميد كسر وتجميد حفر الصور تظهر طابع ثلاثي الأبعاد، وأحيانا مخطئون لالميكروسكوب الإلكتروني الماسح. ومع ذلك، يتم فحص الاستعدادات للتجمد الكسر بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ ومساهمة رئيسية لدراسات مورفولوجية عالية الدقة هو تمثيلها فريد من عناصر هيكل / وظيفة أغشية الخلايا. يبدأ التجهيز تجميد كسر من خلال تجميد الخلايا والأنسجة مع سرعة كافية للحد من بلورة الجليد و / أو مع استخدام وكلاء cryoprotectant مثل الجلسرين. ثم يتم كسر العينات تحت فراغ ومندوبيتم إنشاء LICA عن طريق التبخر من الكربون والبلاتين على سطح كسر. يتم هضم العينة الأصلية من النسخ المتماثلة التي يتم استردادها على معيار EM العينة الشبكة. سوء تفسير آخر شائع من الصور للتجمد الكسر هي أنها توضح سطوح الخلايا. لكن المنطلق الأساسي لتجميد كسر هو أن يتم تقسيم الأغشية البيولوجية من خلال طبقة ثنائية الدهون من خلال عملية كسر (الشكل 3). هذه العملية في الأغشية البيولوجية غلة جهان كسر، واحد الذي يكشف عن تنظيم نصف الغشاء الملاصق للالسيتوبلازم، وPF وجه، واحد الذي يكشف عن نصف النشرة ثنائي الجزيء من الغشاء الذي هو المتاخمة للخارج الخلية الوسط، وEF وجه. لا تمثل سطوح الخلايا الحقيقية في الصور تجميد كسر ولكن تظهر فقط عند استخدام الخطوة اللاحقة أضاف تجميد الحفر باتباع الإجراء الكسر. من أجل حفر العينات بشكل فعال بكسر سابقا للكشف عن سطح التفصيللتر، يجب أن يتم تجميد العينات بمعدل سريع وبدون unetchablecryoprotectant. ويتم إنجاز الحفر من المياه من سطح العينة بكسر كشف الميزات الأساسية عن طريق وضع ذراع مشراح التبريد خلال المرحلة عينة خلق فرق درجة الحرارة بين مرحلة عقد العينة والتبريد الذراع مشراح الذي يسبب الماء لسامية من على سطح الأرض. عندما يتم تصعيد المياه من سطح العينة بكسر خلال المناورة-الحفر تجميد، ثم قد كشفت جوانب الأسطح الفعلية الخلية المصفوفة خارج الخلية، والهياكل هيكل الخلية، والتجمعات الجزيئية في ارتفاع القرار. وبالتالي تجميد كسر وتجميد حفر ليست حيث تبادل بل تعكس عملية تدريجية وهذه الأخيرة التي قد لا يكون ضروريا أو مرغوبا فيه تبعا لاحتياجات الدراسة معينة.

بعد تجميد كسر / حفر إجراءات تجميد، تتعرض السطوح المتصدعة إلى evapora موجهةTIVE المعاطف من الكربون والبلاتين من أجل تقديم الدعم والتصوير النقيض من النسخة المتماثلة. قد يكون البلاتين / الكربون أحادي الاتجاه أو التبخر التصوير الدوارة ويتم إنجاز إما المقاومة أو البنادق الإلكترون. التظليل أحادي الاتجاه من زاوية معروفة، وعادة 30º - 45º، مفيد في أداء العمليات الحسابية المورفولوجية معينة. العينات التي تعرضوا إلى أعماق الحفر وعادة ما تكون دوارة مظلل ويتم عكس الصور الناتجة من هذه العينات فوتوغرافيا للتقييم.

التاريخية فضلا عن الهدف الحالي للتجميد كسر / تجميد حفر تقنية هو الحد التثبيت الكيميائية ومعالجة العينات القطع الأثرية التي ترتبط مع المزيد من إجراءات انتقال المجهر الإلكتروني التقليدية. ومع ذلك، توفر هذه التقنية ميزة جوهرية في قدرته على إضفاء التفاصيل ثلاثي الأبعاد، وبالتالي تسهيل الحصول على البيانات المظهرية في البيولوجي، وعلم المواد، ونالعينات anotechnology. إجراءات تجميد كسر وتجميد حفر معقدة ومتعددة الأوجه، ويتم تخصيص بعض جوانب تطبيقها. يقدم هذا العرض وجهة نظر الدراسة من السمات الرئيسية لعملية ويشار القارئ لبروتوكولات شاملة نشرت ^{10 و 11} من أجل معالجة التفاصيل وتخصيص عملية لتلبية احتياجات بحثية محددة.

Protocol

1. إعداد العينات البيولوجية لتجميد كسر / تجميد حفر

1. استخدام صياغة تثبيتي EM التقليدية مثل غلوتارالدهيد 2٪ + 2٪ امتصاص العرق في 0.1 م العازلة الفوسفات لمدة 1 ساعة. لإجراء التثبيت الأولي من الأنسجة البيولوجية. ملاحظة: في حين أنه قد يكون من المرغوب فيه تجميد بعض أنواع العينات دون تثبيت مسبق، والدم المنقولة الاحتياطات العالمية الممرض ولاية تثبيت المناسبة حيث تتكون العينة من الأنسجة البشرية.
2. بعد التثبيت الأولي، وشطف العينة في نفس عازلة تستكمل مع 0.2 M السكروز مدة لا تزيد عن 1 ساعة.
3. نقل العينة إلى حل cryoprotectant تتكون من الجلسرين 25٪ في 0.1 م العازلة الفوسفات مدة لا تزيد عن 1 ساعة.

2. تجميد وتخزين العينات قبل تجميد كسر

1. اختر الذهب أو النحاس عينة بذرة من حجم وشكل العينة المناسب ليتم معالجتها (الشكل 4
2. باستخدام ملقط الصف غرامة و / أو قياس موقف إبر حقنة صغيرة شظايا صغيرة من العينة على رأس كعب عينة المعدن.
   1. خفض محتوى السائل من العينة إلى زجة، الغراء قليلا مثل الاتساق عن طريق رسم خارج السائل من حافة كعب مع ورق الترشيح.
   2. النسخ المتماثلة واحدة، استخدام إبر صغيرة مقياس حقنة لخلق كومة من الأنسجة على كعب. النسخ المتماثلة مزدوجة، عكس كعب آخر وضعه بالضبط على كعب ووضعه برفق على سطح العينة خلق شطيرة (الشكل 5A). لا تضغط على عينة من بذرة من بين اثنين.
3. ملء سفينتين ديوار معزولة مع النيتروجين السائل. ملاحظة: السفينة الأولى يستوعب وظيفة المعدنية التي تحتوي على بئر صغير الذي يستخدم لتسييل كمية صغيرة من غاز البروبان من اسطوانة المتاحة تجاريا (الشكل 5B). السفينة الثانية هي التخزين المقسمة / عقد سفينة للجيزةلاي الحفاظ على العينات المجمدة تحت النيتروجين السائل.
   1. باستخدام فوهة الاسطوانة وضعه في البئر البروبان، افتح صمام اسطوانة والسماح لتدفق الغاز في البئر السفينة الأولى حيث سيتم تسييل. ملاحظة: تحذير! البروبان متفجر، قد تسبب تجميد الإصابة على الاتصال، ويعتبر خانقة. استخدام البروبان فقط في غطاء الكيميائية المعتمدة لمثل هذا الاستخدام مع الحرص على تجنب مصادر الاشتعال غريبة، وذلك باستخدام الملابس الواقية ضد درجات الحرارة المنخفضة، والحفاظ على التهوية الكافية.
   2. في أسرع وقت ممكن، والتقاط عينة جبل بالملقط الصف غرامة ويغرق عليه في الغاز المسال في أول سفينة لعدة ثوان ثم نقل بسرعة الى السفينة عقد الثانية من النيتروجين السائل (الشكل 5B).
   3. مرة واحدة يتم تجميد العينات وتخزينها تحت النيتروجين السائل حتى جاهزة للنقل إلى محطة تجميد كسر. نقل بذرة إلى تخزين أكبر النيتروجين السائل الحاويات ديوار للتمديدينبغي أن تؤخذ تخزين إذا رغبت، ولكن الحرص على عدم السماح للبذرة لذوبان الجليد.

3. عملية لتجميد كسر صك وتجهيز العينات

1. تحميل العينات على حامل نحاس والى غرفة
   1. تحميل بذرة عينة الذهب في كتيب من نوع نسخة مزدوج حامل عينة أو المشبك الجهاز تحت النيتروجين السائل والحفاظ هناك حتى على استعداد لوضع في غرفة العينة (الشكل 6).
   2. عندما حقق فراغ الغرفة عالية (حوالي 2 × 10 ^-6 م بار) وتم تبريد المرحلة إلى درجة حرارة النيتروجين السائل، وإيقاف المضخة، وتنفيس الغرفة، ووضع عينة بذرة شنت على الطاولة عينة في أسرع وقت ممكن .
   3. بدوره على مضخة، إعادة فراغ عالية، واستخدام مرحلة ودرجة الحرارة ذراع التحكم الإلكترونية لضبط درجة الحرارة جدول العينة إلى -100 درجة مئوية والنيتروجين السائل مباشرة إلى الذراع مشراح وBRIنانوغرام إلى درجة حرارة النيتروجين السائل.
2. عملية كسر
   1. على تحقيق فراغ عالية، ودرجة حرارة -100 درجة مئوية مرحلة والذراع مشراح في درجة حرارة النيتروجين السائل، وفتح عن بعد مزدوج حامل عينة طبق الأصل مما كسر العينات على يتصاعد العينة (تجميد fracture_movie1.mov).
   2. في حالة العينات المعدة للالحفر كسر التالية، استخدم شفرة حلاقة الاحتفاظ بها في المشبك على الذراع مشراح أن يحلق (أي كسر) سطح العينات بدلا من خطوة 3.2.1 (تجميد-etch_movie2.mov).
   3. إذا كانت خطوة الحفر تجميد المضافة هي التي يتعين القيام بها، ضع الذراع مشراح تبريد فوق السطوح كسر واحد لعدة دقائق. ملاحظة: هذه المناورة سامية (أي حفر) الماء من سطح كسر. تأثير هذه المناورة هو الكشف عن خلية الأسطح الحقيقية، المصفوفة خارج الخلية، و / أو التجمعات الجزيئية من التسامي من المياه، بالإضافة إلى FRActure يواجه تمر عبر طبقة ثنائية المادة الدهنية من الأغشية.
3. التظليل المعدنية والدعم نسخة التبخر باستخدام البنادق الإلكترون
   1. تفعيل البلاتين / الإلكترون الكربون أو بندقية المقاومة والسماح لها تتبخر طبقة رقيقة (حوالي 2 نانومتر) من البلاتين / الكربون على سطح كسر من زاوية من 30º - 45º. وهذا يتطلب عادة حوالي 15-20 ثانية.
   2. تفعيل الإلكترون الكربون أو بندقية المقاومة كما في الخطوة 3.3.1 وتتبخر طبقة رقيقة من الكربون على سطح عينة من كسر مباشرة (90º) النفقات العامة لتقديم الدعم إلى النسخة المتماثلة. وهذا يتطلب عادة حوالي 15-20 ثانية.
4. استرجاع النسخ المتماثلة
   1. عند الانتهاء من التظليل التكرار والاستقرار الكربون، إيقاف مضخة فراغ، وتنفيس الغرفة، وإزالة عينة من جبل الصك.
   2. باستخدام زوج من ملقط الصف غرامة إزالة كل كعب عينة الذهب من ضعفكتيب متماثلة / المشبك والسماح لذوبان الجليد لعدة ثوان قبل خفض بلطف كعب على سطح الماء في لوحة البقعة (الشكل 7). ملاحظة: النسخة المتماثلة الكربون / البلاتين تحتوي على مواد العينة ملتصقة سوف تطفو على سطح الماء.
   3. مناورة النسخ المتماثلة باستخدام سلك حلقة غرامة أو التقليدية النحاس الإلكترون شبكة المجهر عقدت بواسطة ملقط الصف غرامة ونقل إلى مكان آخر لوحة تحتوي على 5٪ ثاني كرومات الصوديوم في حامض الكبريتيك 50٪ للواحد إلى عدة ساعات. ملاحظة: هذا الحمام يساعد على هضم المواد البيولوجية الفعلية عينة من النسخة المتماثلة. يمكن استبدال قوة الكامل التبييض المنزلية لثاني كرومات / محلول حمض الكبريتيك.
   4. عند اكتمال عملية الهضم، ونقل النسخة المتماثلة مرة أخرى إلى سطح المياه النظيفة واسترداد على معيار النحاس الإلكترون المجهري الشبكة. (ملاحظة: النسخ قد تفتيت إلى قطع صغيرة أثناء عملية الهضم ولكنها قد تحتوي حتى النسخ المتماثلة صغيرة جدا معلومات جوهرية ويجب أن تكون RETRieved وفحصها.) مخزن نسخة تدعم شبكات في صناديق الشبكة المتاحة تجاريا حيث ستبقى مستقرة لسنوات مع معالجة طيف.

4. التركيبية فحص تجميد كسر / النسخ حفر

1. مشاهدة النسخ المتماثلة في المجهر الإلكتروني النافذ في لتسريع الجهد عادة 50-80 كيلو فولت.
2. تسجيل الصور ذات الصلة على الفيلم TEM القياسية أو مع كاميرا رقمية عالية الدقة.

Representative Results

فرضية رئيسيا من تجميد كسر صورة التفسير هو أن الطائرات كسر تمر عبر طبقة ثنائية المادة الدهنية من الأغشية منح جهان الكسر الذي دعا اليه الاتفاقية وجه PF (البلازما كسر وجه) وEF-الوجه (خارج الخلية كسر وجه) (الشكل 3). وPF وجه هو النصف من الغشاء الدهني طبقة ثنائية المتاخمة للسيتوبلازم الخلية وEF-الوجه النصف من الغشاء الدهني طبقة ثنائية المتاخمة للبيئة خارج الخلية. تقنية تجميد كسر مفيدة بشكل خاص للتحقيق في بنية الغشاء وجهين وعادة ما تكون مختلفة بشكل متميز مع PF-جوه يجري ملؤها مع العديد من الجزيئات المرتبطة غشاء خلافا لEF-الوجوه التي تحتوي على أقل. محتويات هيولي من خلايا كسر التجميد هي الخشنة عادة في المظهر ولا سيما تكشف على الرغم من العضيات غشاء ملزمة مثل نوى وجولجي يمكن تحديدها بسهولة. ذات أهمية خاصة لإنفيstigators باستخدام هذه التقنية هي التخصصات هيكل الغشاء الذي يمكن أن يفسر لوظيفتها. تشمل هذه التوزيعات محددة من غشاء المرتبطة الجسيمات، التخصصات غشاء الهدبية، وتقاطعات بين الخلايا.

الهياكل المرتبطة أهداب

المقيمين في غشاء الخلية عند قاعدة كل هدب حقيقية النواة والسوط هو مجموعة من الجزيئات المرتبطة غشاء نظمت في فروع تطويق رمح من هدب والمعروفة باسم قلادة الهدبية (الشكل 8) ^12-16. هذا الهيكل المعارض قدرا من التجانس المورفولوجي في مختلف الأنواع وكان قد تردد أن يكون بقدر متعدد الوظائف كما يظهر قبل ظهور رمح الهدبية أثناء تكون الأهداب ويبقى في مكان في هدب ناضجة. قلادة الهدبية الوليدة مستمد من تجميع وتنظيم صفائف الجسيمات الغشاء قبل وقت الإلكترونيةmergence من رمح الهدبية أثناء تكون الأهداب يشير مشاركة ممكنة في منظمة الأولى من الخيط المحوري تطوير ^14.

منعطفات ضيقة وطلائي Permeabi عنه lity

في مختلف ظهائر، تجميد كسر دراسات تكشف عن منظمة متطورة من anastomosing الهياكل حبلا والأخدود تطويق الجانب قمي الحدود basolateral. ويعرف هذا بنية تشبه حزام وتقاطع ضيق أو zonulaoccludens (الشكل 9) ويعتقد ليكون بمثابة منظم من نفاذية الظهارية لتدفق paracellular ^{3، 17-20.} وقد وصفت منعطفات ضيقة مع فروع قليلة بأنه "يرشح" في حين أن تلك مع مزيد من التنظيم المعقدة وصفه ب "ضيق". يبدو أن هذه المنظمة لتناسب وظيفة ظهائر التي ترتبط بها. تظهر PF-جوه منعطفات ضيقة وفروع بينما EF-جوه المعرض complemeالأخاديد ntary.

الفجوة بين الخلايا المفارق والاتصالات

تظهر تقاطعات الفجوة (الشكل 10) في الأعمال التحضيرية للتجمد كسر في مجموعة متنوعة من الأنسجة ويتم تمثيل صفائف كثيفة من الجسيمات على PF-الوجوه وحفر تكميلية بشأن EF-الوجوه. ويعتقد أن هذه الهياكل لتمثيل مواقع غشاء التي تسهل الاتصالات بين الخلايا. في الأنسجة التي تتواجد فيها، وقد أثبتت المظاهرات مرور منخفضة الوزن الجزيئي الأصباغ الفلورية وتدفقات الكالسيوم ^21-24 يشير إلى أنها تمثل طريقا المادي لمرور جزيئات الإشارة.

الرقم 1. تخطيط لتجميد كسر مصنع / حفر التجاري. غادر في أقصى هو الضغط و ديوارeeding تبريد النيتروجين السائل إلى المرحلة عينة والتبريد الذراع مشراح تحت ظروف خاضعة للرقابة. في المركز هو وحدة مع غرفة العينة والتحكم الإلكتروني الألواح إلى اليمين. على اليمين هو خزان إضافي النيتروجين السائل الذي يستخدم الغاز تنفيس لجعل غرفة العينة إلى الغلاف الجوي.

الشكل 2. تجميد كسر / نبات حفر عينة غرفة مع الباب فتحت لكشف مواقف البنادق الإلكترون تهدف إتجاهي، كفن التبريد، وعينة البريد حيث يتم وضع العينات في أصحاب النحاس. يتم إدخال العينات إلى غرفة من خلال منفذ على يسار الغرفة.

الرقم 4. نوعين من يتصاعد العينة لتجميد كسر / إجراءات حفر. (يسار) ويستخدم المزدوج عينة طبق الأصل حامل كتيب لإجراءات تجميد كسر التقليدية القيام بها دون النقش. محصورة بين اثنين من العينة عينة الذهب بذرة والمتمركزة في كتيب النحاس. وكسر العينة عن طريق فتح كتيب تحت فراغ في غرفة العينة (انظر تجميد fract ure_movie1.mov). (يمين) وجبل تستخدم في المقام الأول لتجميد الحفر. يتم وضع العينة على بذرة الذهب ومقفل في حامل النحاس. وكسر عينة من حلق لطيف بشفرة حلاقة الثابتة في الذراع مشراح. ويفضل هذا التكوين لإجراءات الحفر (انظر تجميد etch_movie2.mov).

الشكل 5. إعداد تجميد كسر عينة جبل. محصورة بين اثنين من العينة يتصاعد الذهب (A) والمجمدة في النيتروجين السائل يحتوي أيضا تبريد البروبان (المقدمة) مع نقل لاحقا إلى عقد ديوار التي تحتوي على النيتروجين السائل (خلفية) ( B).

ig6highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الرقم 6. مظاهرة من المواقع من عينة تجميد كسر المجمدة في نسخة مزدوجة عينة حامل كتيب استعدادا لمقدمة إلى غرفة عينة من تجميد كسر / نبات حفر.

الرقم 7. استرجاع النسخ المتماثلة التالية الكسر والتظليل في تجميد كسر / نبات حفر. "A" هو سطح المياه النظيفة في لوحة الفور. يتم نقل نسخة طرحت من كعب العينة إلى "B" بئر تحتوي على حل المحمض من ثاني كرومات الصوديوم أو كامل قوتها التبييض المنزلية لهضم الأنسجة من النسخة المتماثلة. "C" يمثل اللاحقة المسطحات المائية النظيفة التي ينقل النسخة المتماثلة تنظيفها قبل بeing استرجاع الصعود إلى الشبكة النحاسية المجهري إلكترون.

الرقم 8. سيليا الهياكل ذات الصلة التي كشفت عنها تجميد كسر. السهام البيضاء المتخصصة تشير إلى صفائف الجسيمات غشاء على الحدود اللمعية من الخلايا الظهارية تمر تكون الأهداب. وتمثل هذه الجسيمات صفائف القلائد الهدبية الوليدة التي تتواجد في قواعد أهداب الناشئة والناضجة (السهم الأسود). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9. الكسر تكشف من خلال أغشية الخلايا الظهارية أمثلة على وجوه PF- EF-كسر جي. المنظمة حبلا والأخدود المجمعات صلي ضيقة واضحة ويتم وضع علامة الفضاء بين الخلايا بواسطة السهام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 10. صورة تجميد كسر في تقاطع الفجوة في كبد الفئران. الجسيمات واضحة على وجه PF وحفر التكميلية واضحة على EF وجه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

4 / 51694fig11highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الرقم 11. المناعى التعريب من connexin استخدام الذهب الغروية صفت الأجسام المضادة على إعداد تجميد كسر توضح توطين معين على مفترق الفجوة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 12. مثال التجميد السريع مع الحفر العميق والتظليل الدوار. وقد اصيب بكسر في الخلايا الظهارية من خلال السيتوبلازم ووجه PF هو واضح (السهام). خلف النصال يمكن رؤية سطح الخلية الحقيقية التي كشفت عنها النقش لاحقة. الرجاء المبادرة القطريةCK هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 13. مثال التجميد السريع مع الحفر العميق والتظليل دوارة للكشف المجمعات الجزيئية تضم ciliaryaxoneme القصبة الهوائية البقري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في السنوات التالية مقدمته والتوافر التجاري، تجميد كسر / واستخدمت على نطاق واسع لحفر إجراءات التحقيق في هيكل غشاء البيولوجي. في الواقع، لقد تم الحصول على أفضل وجهات النظر من بعض التخصصات الهيكلية للأغشية في الاستعدادات تجميد كسر / حفر. وساهمت هذه الدراسات ليس فقط لفهم التنظيم الهيكلي من الأغشية ولكن أيضا قدمت نظرة ثاقبة كيف ترتبط البنية والوظيفة.

ظهور روتيني المجهر الإلكتروني البيولوجي الناجمة عن إدراك أن العلاجات الكيميائية مع مثبتات ألدهيد، المواد الكيميائية المتفاعلة، والمعادن الثقيلة اللازمة لمنح كثافة الإلكترونات تفضيلية لالعينات البيولوجية نفسها ساهمت في توليد قطعة أثرية. واستند تطوير تكنولوجيا تجميد كسر في جزء منه على محاولة للحد من تصنيع قطعة أثرية. ومع ذلك، فقد تم الاعتراف بأن تجميد كسر/ يدخل حفر مجموعة خاصة بها من التحف، رئيسي واحد منها هو الضرر الجليد الكريستال. الأنسجة انخفضت خبرة مباشرة في النيتروجين السائل التبريد معدل انخفاض بسبب تشكيل طبقة عازلة من غاز النيتروجين المحيطة العينة مما يؤدي إلى تشكيل بلورات الجليد التي طمس التفاصيل التركيبية. تم التغلب على هذه المشكلة باستخدام cryoprotectants مثل الجلسرين وتجميد الأنسجة لأول مرة في البروبان السائل تبريد النيتروجين. تاريخيا، تم إجراء يغرق التجميد في النيتروجين السائل تبريد مركبات ولكن تم التخلص من هذه المواد استخدام بسبب آثارها الضارة على البيئة. حتى في أفضل الظروف واق من البرد، وطبيعة العملية تؤدي حتما في الخشنة والحصى مثل السطح في كسور حشوية. ومع ذلك، الكسور من خلال هياكل غشاء تكشف ملامح منظمة تنظيما جيدا وجود المنظمات مستو محددة النسبية لميولهم في غشاء الخلية. هذه الصور هيممكن فقط مع استخدام وكلاء cryoprotectant مثل الجلسرين التي تحد من الضرر وضوح الشمس الجليد، والجلسرين نفسها في بعض الحالات قد يعرض أيضا إعادة توزيع مصطنعة من غشاء المرتبطة الجسيمات. وعلاوة على ذلك، لا يمكن الجلسرين مصعد من سطح بكسر مما يحد من فرصة للنجاح الحفر. إذا كان الإجراء اللاحق النقش هو مرغوب فيه، ثم يجب أن تكون العينة إما تجميد بسرعة بطريقة تحد من الضرر الجليد الكريستال السائل باستخدام الهيليوم أو النيتروجين طين و / أو اقترب من استخدام cryoprotectant مثل الأسيتون الذي المتسامي بسهولة من متشظية السطوح.

على الرغم من أنه ركز التقرير الأولي ستير على التصوير الفيروسات، هو في بنية الغشاء الذي تجميد كسر / حفر وجدت تطبيق أكثر اتساعا. في الواقع، هياكل مثل منعطفات ضيقة والفجوة والتخصصات الغشاء الهدبي تم كشف ذكية في الاستعدادات للتجمد الكسر. تجميد كسر لديه founد فائدة كبيرة في تحقيق فهم التمايز الغشاء أثناء التطوير ^{15، 17،24} وعلم الأمراض في غشاء ^25-30. ، وقد أظهرت تقارير سابقة من هذا المختبر نمط التفريق بين المجمعات صلي ضيق مجرى الهواء أثناء التطوير، واختلال الهياكل الغشاء الهدبي المرتبطة التجريبي التعرض كيل المعدية، وتدهور المجمعات صلي الضيقة في الخلايا الظهارية الهوائية المرتبطة ملوثات الهواء والتعرض لدخان التبغ في حيوانات التجارب والبشر.

ملحقات الفنية للتجميد الكسر / تجميد حفر الداخلي

طريقة التبريد باستخدام غاز البروبان المسال إلى تجميد العينات الموضحة هنا ربما يكون النهج الأكثر شيوعا لتجميد العينات البيولوجية التقليدية لتجميد كسر. ومع ذلك، نهج أخرى لتجميد يجب خصصت حيث تجميد النقش هو أن أداءأد. منذ الجلسرين هو غير etchablecryoprotectant، العينات لليجب تجميد بطرق تحد تشكيل الكريستال الجليد تجميد الحفر. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام etchablecryoprotectant مثل الأسيتون و / أو من خلال تجميد العينة جبل على سطح المعدن تبريد مع الهيليوم السائل أو طين النيتروجين السائل. التجميد السريع دون cryoprotectants أيضا يمكن إنجازه باستخدام رذاذ تجميد أو ارتفاع ضغط تجميد في البروبان المسال.

وقد خصصت الجهود التي بذلت مؤخرا لزيادة ربط هيكل وظيفة باستخدام تقنية تجميد كسر هذه التقنية بالتنسيق مع وضع العلامات المناعى ^{31، 32.} هنا، والأجسام المضادة لمستضدات معينة يمكن أن تكون مترجمة بشكل فعال ودقيق لمواقع غشاء (الشكل 11).

في حين تجميد كسر مع التظليل أحادي الاتجاه هو إلى حد بعيد البروتوكول الأكثر استخداما، فإن بعض التصاميم التجريبية يطالبون بتجميد السريع مع قمة Littlالبريد أو cryoprotection محدود، يرافقه الحفر من السطح لتكشف عن كسر السطوح الحقيقية الخلية، ومصفوفة خارج الخلية، و / أو المجمعات الجزيئات، والتظليل دوارة لنقل المقابل ¹⁶ (الشكل 12 والشكل 13).

هناك اهتمام متزايد في تطبيقات تجميد كسر في تكنولوجيا النانو، وعلوم المواد، وباستخدام هذه التقنية كأداة التصوير في البيولوجيا الجزيئية. في الواقع، قد المواد النانوية في نواح كثيرة أن تكون متسقة في منظمتهم مع الهياكل الفيروسية التي تم تصور تجميد كسر أصلا كوسيلة للتصوير. وعلاوة على ذلك، الجسيمات الشحمية المصنعة، وهياكل مماثلة في شكلها الأغشية البيولوجية، ويجري حاليا دراسة على نطاق واسع لاستهداف تسليم وكلاء الأدوية والعلاج الجيني الموجه. لأن منظمتهم هي في الأساس مثل غشاء، قد يكون التجهيز تجميد كسر فائدة كبيرة في إنتاج الصور كشف كمكون في develoبينغ هذه العلاجات ^33.

باختصار، كانت التكنولوجيات تجميد كسر أهمية تاريخية في وصف تنظيم وظيفة أغشية الخلايا. ومع ذلك، تجميد كسر هو إيجاد مجالات جديدة للفائدة بالتنسيق مع البيولوجيا الجزيئية وتكنولوجيا النانو ويكاد يكون من المؤكد سوف تساهم في التقدم في هذه المجالات الناشئة بسرعة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
Standard aldehyde fixatives	various suppliers
Sodium dichromate	various suppliers
Sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Propane	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.