Summary
Basistechnieken en verfijningen van freeze-fractuur verwerking van biologische monsters en nanomaterialen voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie worden beschreven. Deze techniek is een aangewezen methode voor het onthullen ultrastructureel functies en specialisaties van biologische membranen en voor het verkrijgen van Ultrastructureel dimensionale en ruimtelijke gegevens in materials sciences en nanotechnologie producten.
Abstract
Freeze-fractuur / vries-ets beschrijft een proces waarbij exemplaren, meestal biologisch of nanomateriaal in de natuur, zijn bevroren, gebroken, en gerepliceerd naar een carbon / platinum "cast" bestemd voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie genereren. Specimens worden onderworpen aan ultrasnelle vriessnelheden, vaak in aanwezigheid van cryoprotectieve middelen voor ijskristalvorming beperken latere breken van het model in vloeibare stikstof gekoelde temperaturen onder hoog vacuüm. De resulterende gebroken oppervlak wordt gerepliceerd en gestabiliseerd door verdamping van koolstof en platina vanuit een hoek die oppervlak verleent driedimensionale detail aan de cast. Deze techniek is bijzonder verhelderend voor het onderzoek van de celmembranen en hun specialisaties bewezen en heeft aanzienlijk bijgedragen aan het begrip van cellulaire vorm aan verwante celfunctie. In dit rapport geven we een overzicht van de eisen instrument en technisch protocol voor het uitvoeren vanbevriezen-breuk, de bijbehorende nomenclatuur en de kenmerken van breukvlakken, variaties op de klassieke procedure en criteria voor de interpretatie van de freeze-fractuur beelden. Deze techniek is op grote schaal gebruikt voor ultrastructurele onderzoek in veel gebieden van de celbiologie en houdt belofte als een opkomende beeldvormende techniek voor moleculaire, nanotechnologie en materiaalkunde studies.
Introduction
Het concept en de praktische toepassing van freeze-fractuur verwerking van biologische monsters werd een eeuw geleden geïntroduceerd door Steere 1 meer dan de helft. De vroege apparaat toegeëigend ongelijksoortige onderdelen in een werkende zelfstandige unit 1. De oorspronkelijke inrichting werd aangepast en verfijnd tot commercieel beschikbare instrumenten om de kritische behoefte aan externe manipulatie, het onderhoud van hoog vacuüm tegemoet te komen, en de verdamping van koolstof en metalen om een replica geschikt is voor onderzoek door transmissie elektronenmicroscopie (Figuur 1 en Figuur produceren 2).
De typische instrument bestaat uit een hoog vacuümkamer specimens tafel en microtoom arm met regelbare vloeibare stikstof omzet (figuur 1). De kamer beschikt ook over twee elektron geweren, een voor het stabiliseren van koolstof verdamping gepositioneerd op een hoek van 90 graden met het model podium en de andere voor Platinum / carbon schaduw onder een instelbare hoek, meestal 15 ° - 45 ° (figuur 2). Stroom naar het apparaat wordt toegepast op de vacuümpomp werken en elektronische panelen reguleren temperatuurregeling en electron gun control.
Oorspronkelijk opgevat als middel om verbeterde beeldvorming van virussen bereiken, vries-breuk kreeg nog meer populariteit als een techniek voor het onderzoek en analyse van celmembranen en hun specialisaties 2, 3. Inderdaad, deze procedure integraal ophelderen structuur / functie relaties in cellen en weefsels en veel van deze studies passief klassieke bijdragen aan cellulaire en moleculaire biologie 4-9 geweest. Het hoofddoel en redenen voor de ontwikkeling van de freeze-fractuur technisch artefacten waarneembaar elektronenmicroscopische resolutie voortvloeien uit chemische fixatie en verwerking in gebruikelijke biologische elektronenmicroscopie beperken. Hier is het doel om chemische beperkenfixatie en het monster voldoende snel en vaak in de aanwezigheid van een koude beschermend om ijskristalvorming en andere artefacten invriezen beperken bevriezen. Meer recent heeft deze techniek een heropleving van interesse van moleculair biologen en materiaalkunde onderzoekers voor onderzoek van nanodeeltjes en nanomaterialen gevonden.
Freeze-breuk en vries-etch beelden vertonen een driedimensionaal karakter en soms verward scanning electronenmicroscoop. Echter, freeze-fractuur voorbereidingen onderzocht door transmissie elektronenmicroscopie en hun belangrijke bijdrage aan de hoge resolutie morfologische studies is hun unieke voorstelling van structuur / functie-elementen van de celmembranen. Freeze-breuk verwerking geïnitieerd bevroren cellen en weefsels met voldoende snelheid ijskristallisatie beperken en / of bij gebruik van cryoprotectant middelen zoals glycerol. De monsters worden vervolgens gebroken onder vacuüm en een repLica wordt gegenereerd door verdamping van koolstof en platina via breukvlak. Het originele exemplaar wordt verteerd van de replica die wordt opgehaald op een standaard EM specimen net. Een andere veel voorkomende verkeerde interpretatie van freeze-fractuur beelden is dat ze uitbeelden celoppervlak. Maar het uitgangspunt van freeze-fractuur is dat biologische membranen worden gesplitst door de lipide dubbellaag van de fractuur-proces (figuur 3). Dit proces in biologische membranen levert twee breuk vlakken, een die de organisatie van de helft van het membraan grenzend aan het cytoplasma, de PF-face openbaart, en een die helft van de bimoleculaire bijsluiter van het membraan dat grenst aan het extracellulaire openbaart milieu, de EF-face. True cel oppervlakken zijn niet vertegenwoordigd in freeze-fractuur beelden, maar alleen wanneer de volgende toegevoegde stap van freeze-etsen na de breuk procedure wordt gebruikt. Om effectief te etsen eerder gebroken exemplaren aan de oppervlakte detai onthullenl, moeten de monsters bij een snel tempo en zonder unetchablecryoprotectant worden bevroren. Ets water van het oppervlak van het proefstuk gebroken openbaren onderliggende factoren wordt bewerkstelligd door het zo koelen microtoom arm via specimen stadium creëren van een temperatuurverschil tussen de fase die het specimen en het koelen microtoom arm die water veroorzaakt sublimeren van het oppervlak. Wanneer water wordt gesublimeerd van het oppervlak van het proefstuk gebroken tijdens het bevriezen etsen manoeuvre, dan aspecten daadwerkelijk celoppervlakken, extracellulaire matrix, cytoskeletstructuren en moleculaire assemblages kunnen worden onthuld met hoge resolutie. Aldus bevriezen-breuk en vries-etch zijn niet uitwisselbaar termen maar tijdens een stapsgewijze werkwijze waarbij de laatste niet nodig of wenselijk zijn afhankelijk van de behoeften van de specifieke studie.
Naar aanleiding van de vries-fractuur / vries-ets procedures, het gebroken oppervlakken zijn onderworpen aan gerichte verdampertief lagen van koolstof en platina met het oog op ondersteuning en beeldvorming contrast met de replica te bieden. De platina / koolstof imaging verdamping kan unidirectioneel of roterende en wordt bewerkstelligd door een weerstand of elektronenkanonnen. Unidirectionele shadowing uit een bekende hoek, meestal 30 ° - 45 °, is handig in het uitvoeren van bepaalde morfometrische berekeningen. Monsters die zijn onderworpen aan diepe etsen typisch roterende schaduw en de resulterende afbeeldingen van deze monsters zijn fotografisch teruggedraaid evalueren.
De historische en een doelstelling van de onderhavige freeze-fractuur / vries-etch techniek chemische fixatie en verwerking beperken specimen artefacten die worden geassocieerd met conventionele transmissie elektronenmicroscopie procedures. Deze techniek levert een wezenlijke voordeel in zijn vermogen om driedimensionale detail kennen en dus de verkrijging van morfometrische data in biologisch, materiaalkunde vergemakkelijken en nanotechnology specimens. Freeze-fractuur en vries-ets procedures zijn complex en veelzijdig en sommige aspecten van de toepassing worden aangepast. Deze presentatie biedt een overzicht aanzicht van de belangrijkste kenmerken van de werkwijze en de lezer om de gegevens adres en pas de werkwijze specifieke onderzoekbehoeften uitgebreide gepubliceerde protocollen 10, 11 bedoeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Voorbereiding van biologische monsters voor Freeze-fractuur / Freeze-etch
- Gebruik een conventionele EM fixeermiddel formulering zoals 2% glutaaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer gedurende 1 uur. primaire fixatie van biologisch weefsel uitvoeren. OPMERKING: Hoewel het wenselijk om een aantal soorten van specimens bevriezen zonder voorafgaande fixatie kunnen zijn, universele bloed overgebrachte ziekteverwekkers voorzorgsmaatregelen mandateren geschikte fixatie waar het specimen bestaat uit menselijk weefsel.
- Volgende primaire fixatie, spoel het model in dezelfde buffer aangevuld met 0,2 M sucrose voor niet meer dan 1 uur.
- Het analysemonster in een cryobeschermingsoplossing bestaande uit 25% glycerol in 0,1 M fosfaatbuffer voor niet meer dan 1 uur.
2 Invriezen en opslag van monsters in Advance van Freeze-fractuur
- Kies goud of koper specimen stompjes van de juiste grootte en vorm van het monster wordt verwerkt (Figuur 4
- Met een fijn pincet en / of kleine gauge naalden positie kleine fragmenten van het monster op de top van een metalen monster stub.
- Verminder de vloeistofinhoud van het monster tot een kleverige, licht lijm consistentie door afzuigen vloeistof van de rand van de stomp met filtreerpapier.
- Voor enkele replica's, gebruik maken van kleine gauge injectienaalden tot een heuvel van het weefsel te maken op de stomp. Voor dubbele replica, omkeren ander stomp en plaats het precies over de stomp en plaats licht op het monster oppervlak creëren van een broodje (figuur 5A). Druk niet op het model uit van tussen de twee stompen.
- Vul twee geïsoleerde Dewar vaten met vloeibare stikstof. OPMERKING: De eerste vat bevindt zich een metalen post met een kleine bron die wordt gebruikt om een klein volume vloeibaar propaangas uit de handel verkrijgbare cilinder (figuur 5B). Het tweede schip is een gepartitioneerde opslag / die het vaartuig voor het kortly handhaven bevroren monsters onder vloeibare stikstof.
- De cilinder mondstuk gelegen in het propaan goed openen van de cilinder en om gas te laten stromen in de put van het vaartuig waar het vloeibaar. LET OP: LET !! PROPANE explosief is, KAN FREEZING LETSEL BIJ CONTACT EN IS verstikkend. Gebruik propaan alleen in een chemische kap gecertificeerd voor een dergelijk gebruik de zorg ook om vreemde ontstekingsbronnen te voorkomen, gebruik beschermende kleding tegen lage temperaturen, en het behoud van voldoende ventilatie.
- Zo snel mogelijk af te halen van het model te monteren met fijne kwaliteit pincet en duik het in het vloeibaar gemaakte gas in het eerste vat gedurende enkele seconden daarna snel over te dragen aan de tweede opslagvat van vloeibare stikstof (figuur 5B).
- Zodra de monsters worden bevroren, op te slaan onder vloeibare stikstof totdat klaar om over te dragen aan de freeze-fractuur plant. Breng de stompjes aan een grotere opslag van vloeibare stikstof Dewar container voor uitgebreidopslag desgewenst echter zorg worden afgezien om de stubs ontdooien.
3 Werking van de Freeze-fractuur Instrument en Specimen Processing
- Laden exemplaren op de koperen houder en in de kamer
- Laad het goud specimen stompjes in een boekje-type double replica exemplaar houder of klem apparaat onder vloeibare stikstof en daar houden totdat klaar om te positioneren in het monster kamer (Figuur 6).
- Wanneer de kamer hoog vacuüm (ongeveer 2 x 10 -6 mbar) heeft bereikt en het podium is afgekoeld tot temperatuur van vloeibare stikstof, schakelt u de pomp, ventilatie van de kamer, en de positie van de gemonteerde exemplaar stompjes op het monster tafel zo snel mogelijk .
- Zet de pomp, herstellen hoog vacuüm, en het gebruik van elektronische podium en arm temperatuurregeling met het model tafel temperatuur tot -100 ° C en directe vloeibare stikstof om de microtoom arm en bri passenng aan vloeibare stikstof geroerd.
- Het breukproces
- Bij het bereiken van een hoog vacuüm, een podium temperatuur van -100 ° C en microtoom arm temperatuur van vloeibare stikstof, op afstand te openen dubbele replica monsterhouder daarmee het doorbreken van de exemplaren van het specimen mounts (freeze-fracture_movie1.mov).
- In het geval van specimens die voor etsen na breuk, gebruikt een scheermesje gehouden in een klem op de microtoom arm scheren (dwz breuk) het oppervlak van de monsters in plaats van stap 3.2.1 (vries-etch_movie2.mov).
- Als de toegevoegde bevriezing etsstap wordt uitgevoerd, plaatst de gekoelde microtoom arm via breukvlakken een tot enkele minuten. LET OP: Deze manoeuvre zal sublimeren (dwz, ets) water van het gebroken oppervlak. Het effect van deze manoeuvre ware celoppervlakken, extracellulaire matrix en / of moleculaire samenstellingen tonen door sublimatie van water, naast fracture gezichten die door de lipide dubbellaag membranen.
- Metal shadowing en replica ondersteuning verdamping met behulp van elektronenkanonnen
- Activeer de platina / koolstof elektron of weerstand pistool en laat een dunne laag (circa 2 nm) platina / koolstof verdampen via breukvlak van een hoek van 30 ° - 45 °. Dit vereist gewoonlijk ongeveer 15 - 20 sec.
- Activeer de koolstof elektron of resistentie gun als in stap 3.3.1 en damp een dunne laag van koolstof het gebroken preparaatoppervlak rechtstreeks overhead (90 °) steun aan de replica geven. Dit vereist gewoonlijk ongeveer 15 - 20 sec.
- Ophalen van replica's
- Na voltooiing van de replicatie shadowing en carbon stabilisatie, schakelt u de vacuümpomp, ventilatie van de kamer, en verwijder het monster de bevestiging uit het instrument.
- Met behulp van een paar fijne kwaliteit tang te verwijderen elke gouden exemplaar stomp van de dubbelereplica booklet / klem en laat ontdooien enkele seconden voordat langzaam verlagen van de stub op een wateroppervlak in een spot plaat (figuur 7). OPMERKING: De carbon / platina replica met aanhangend specimen materiaal blijft drijven op het wateroppervlak.
- Manoeuvreer de replica's met behulp van een fijne draad lus of een conventionele elektronenmicroscoop koperen rooster waarover fijne rang pincet en overdracht naar een andere spot plaat die 5% natriumdichromaat in 50% zwavelzuur gedurende een tot verscheidene uren. OPMERKING: Dit bad verteert de werkelijke biologische specimen materiaal van de replica. Volle sterkte bleekmiddel kan worden vervangen door het dichromaat / zwavelzuur oplossing.
- Wanneer de spijsvertering is voltooid, de overdracht van de replica terug naar een schoon wateroppervlak en op te halen op een standaard koperen elektronenmicroscopie raster. (NB: Replica's kunnen uiteenvallen in kleinere stukken tijdens de spijsvertering, maar zelfs zeer kleine replica's kan een aanzienlijke hoeveelheid informatie bevatten en moet r zijnieved en onderzocht.) winkel replica ondersteunen van roosters in de handel verkrijgbare rooster dozen, waar ze al jaren met voorzichtige behandeling stabiel zal blijven.
4 Ultrastructurele Onderzoek van Freeze-fractuur / etch Replica
- Bekijk replica's in een transmissie-elektronenmicroscoop in versneld spanning meestal 50-80 kV.
- Noteer relevante beelden op standaard TEM film of met een hoge resolutie digitale camera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het belangrijkste uitgangspunt van freeze-fractuur afbeelding interpretatie is dat breukvlakken passeren de lipide dubbellaag membranen verlenen twee fractuur gezichten, riep volgens afspraak de PF-face (plasma fractuur-face) en EF-face (extracellulaire fractuur-face) (Figuur 3). De PF-face is helft van de membraan lipide dubbellaag grenzend aan het cytoplasma van de cel en de EF-gezicht helft van de membraan lipide dubbellaag naast het extracellulaire milieu. De vries-breuk techniek is bijzonder bruikbaar voor het onderzoek van membraanstructuur en de twee vlakken zijn meestal opvallend verschillend met PF-vlakken bevolkt met vele membraangebonden deeltjes in tegenstelling tot EF-vlakken die minder bevatten. De cytoplasmatische inhoud van bevriezing gebroken cellen typisch grof uiterlijk en zijn niet bijzonder onthullend hoewel membraan gebonden organellen zoals kernen en Golgi gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd. Van bijzonder belang voor Investigators behulp van deze techniek zijn specialisaties van membraan structuur die geïnterpreteerd kunnen worden voor hun functie. Deze omvatten specifieke verdelingen van membraan-geassocieerde deeltjes, ciliaire membraan specialisaties, en intercellulaire verbindingen.
-Trilharen bijbehorende bouwwerken
Die in het celmembraan aan de basis van elke eukaryote cilium en flagellum is een array van membraangebonden deeltjes georganiseerd in strengen rondom de as van de cilium en bekend als de ciliaire ketting (figuur 8) 12-16. Deze structuur vertoont een zekere morfologische heterogeniteit in verschillende soorten en het is gespeculeerd multifunctioneel zover als het lijkt vóór het ontstaan van de ciliaire as tijdens ciliogenese en blijft op zijn plaats in het rijpe cilium. De ontluikende ciliaire ketting afgeleid uit de samenstelling en organisatie van membraan deeltje arrays voorafgaand aan het tijdstip van de evermenging van de ciliaire as tijdens ciliogenese suggereert de mogelijke deelname in het begin van de organisatie van de ontwikkeling van axoneme 14.
Strakke Knooppunten en Epithelial Permeabi liteit
In diverse epitheel, freeze-fractuur studies blijkt een uitgekiende organisatie van anastomose streng en groef structuren rondom de apicale aspect van de basolaterale grenzen. Dit bandvormige structuur is bekend als de tight junction of zonulaoccludens (figuur 9) en wordt verondersteld te werken als een regulator van epitheliale permeabiliteit voor de paracellulaire flux 3, 17-20. Tight junctions met weinig onderdelen zijn omschreven als "leaky" terwijl die met meer complexe organisatie worden "tight". Deze organisatie blijkt de werking van het epitheel waaraan ze zijn verbonden passen. De PF-gezichten van tight junctions verschijnen als strengen, terwijl de EF-gezichten vertonen complementary groeven.
Gap junctions en intercellulaire communicatie
Gap junctions (figuur 10) zijn opgenomen in vries-breuk preparaten van verschillende weefsels en worden vertegenwoordigd door dichte arrays van partikels PF-vlakken en complementaire putjes op EF-vlakken. Deze structuren worden gedacht aan membraan sites die intercellulaire communicatie vergemakkelijken vertegenwoordigen. In weefsels voor zover aanwezig, zijn demonstraties van de passage van laagmoleculaire fluorescente kleurstoffen en calcium fluxen aangetoond 21-24 suggereren dat zij een fysieke route voor de passage van signaalmoleculen.
Figuur 1 Indeling van een commerciële freeze-fractuur / etch plant. Uiterst links is een onder druk Dewar feeding koeling met vloeibare stikstof met het model podium en koeling microtoom arm onder gecontroleerde omstandigheden. In het midden is de eenheid met het monster kamer en elektronische bedieningspanelen aan de rechterkant. Rechts is een extra vloeibare stikstof tank waarop het afvoergas wordt gebruikt om het monster kamer atmosfeer zorgt.
Figuur 2 Freeze-fractuur / etch fabriek exemplaar ruimte met een deur geopend naar posities van directioneel gericht elektronenkanonnen, koeling lijkwade te onthullen, en specimen plaatsen waar monsters in messing houders zijn geplaatst. Monsters worden ingevoerd om de kamer via een poort aan de linkerkant van de kamer.
ig6highres.jpg "width =" 500 "/> 4 / 51694fig11highres.jpg "width =" 500 "/> 
Figuur 4 Twee soorten specimen mounts voor freeze-fractuur / etch procedures. (Links) Een dubbele replica monsterhouder boekje wordt gebruikt voor conventionele freeze-fractuur procedures uitgevoerd zonder etsen. Het monster is ingeklemd tussen twee goud specimen stubs en geplaatst in het messing boekje. Het monster wordt gebroken door het openen van het boekje onder vacuüm in het monster kamer (Zie bevriezen-fract ure_movie1.mov). (Rechts) Een mount voornamelijk gebruikt voor vries-ets. Het monster wordt op de gouden stubs en vergrendeld in de koperen houder. Het monster wordt gebroken door zachte scheren met een in de microtoom arm vast scheermesje. Deze configuratie heeft de voorkeur voor het etsen procedures (zie bevriezen-etch_movie2.mov). 
Figuur 5 Voorbereiding van een freeze-fractuur exemplaar monteren. Het monster is ingeklemd tussen twee goud mounts (A) en in een putje met vloeibare stikstof bevroren gekoeld propaan (voorgrond) met aansluitend vervoer naar een holding Dewar met vloeibare stikstof (achtergrond) ( B).
Figuur 6 Demonstratie van de positionering van een bevroren bevriezen-breuk specimen in de dubbele replica monsterhouder boekje in voorbereiding voor kennismaking met het model kamer van de vries-fractuur / etch plant. 
Figuur 7 Retrieval van replica's na breuk en schaduwvorming in het vries-fractuur / ets plant. 'A' is een schoon wateroppervlak in een plek plaat. De replica dreven van het monster stub overgebracht naar "B" een putje met een aangezuurde oplossing van natriumdichromaat of onverdund bleekmiddel voor digestie van het weefsel van de replica. "C" staat voor de daaropvolgende schoon water oppervlakken waaraan de gereinigde replica voorafgaand wordt overgebracht naar bEing opgehaald op een koperen elektronenmicroscopie raster. 
Figuur 8 Cilia verwante structuren onthuld door vries-fractuur. Witte pijlen wijzen naar gespecialiseerde membraan deeltje arrays op de luminale grens van epitheelcellen ondergaan ciliogenese. Deze deeltje arrays vertegenwoordigen ontluikende ciliary kettingen die aan de basis van de opkomende en volwassen cilia (zwarte pijl) wonen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 
Figuur 9 Fracture door epitheliale membranen openbaren ing voorbeelden van PF-en EF-fractuur gezichten. De streng en groef organisatie van strakke junctionele complexen is evident en de intercellulaire ruimte wordt gemarkeerd door middel van pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 
Figuur 10 Een freeze-fractuur beeld van een gap junction in rattelever. Deeltjes zijn duidelijk op de PF-gezicht en complementaire kuilen zijn duidelijk op de EF-face. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 11 Immunohistochemische lokalisatie van een connexin gebruik van een colloïdaal goud gemerkt antilichaam dat op een freeze-fractuur voorbereiding illustreren specifieke lokalisatie van de gap junction. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 
Figuur 12 Een voorbeeld van snelle bevriezing met diepe etsen en roterende shadowing. Heeft de epitheelcellen werd gebroken door het cytoplasma en een PF-gezicht is evident (pijlpunten). Achter de pijlpunten is te zien een echte celoppervlak geopenbaard door latere etsen. Gelieve click hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 
Figuur 13 Een voorbeeld van snelle bevriezing met diepe etsen en roterende shadowing moleculaire complexen bestaande uit een runder tracheale ciliaryaxoneme onthullen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de jaren na de invoering ervan en de commerciële beschikbaarheid, freeze-fractuur / etch procedures werden op grote schaal gebruikt voor het onderzoeken van de biologische membraan structuur. Inderdaad, de beste perspectieven van een aantal van de structurele specialisaties van membranen is verkregen in freeze-fractuur / etch voorbereidingen. Deze studies niet alleen bijdragen tot begrip van de structurele organisatie van de membranen maar ook ontvangen inzichten in structuur en functie zijn verbonden.
De komst van routine biologische elektronenmicroscopie bracht besef dat chemische behandelingen met de aldehyde fixeermiddelen, reactieve chemicaliën en zware metalen moeten differentiële elektronendichtheid biologische monsters verlenen zich bijgedragen aan de vorming van artefact. De ontwikkeling van de vries-fractuur technologie is deels gebaseerd op een poging om de verwerking artefact te verminderen. Niettemin heeft men onderkend dat vries-fractuur/ Etch introduceert zijn eigen set van artefacten, een belangrijk waarvan een ijskristal schade. Weefsels ondergedompeld direct in vloeibare stikstof bieden een verlaagd afkoelsnelheid door de vorming van een isolerende laag van stikstofgas rond het specimen dat resulteert in de vorming van ijskristallen die ultrastructurele detail vernietigen. Dit probleem wordt overwonnen door het gebruik van koude beschermende middelen zoals glycerol en bevroren eerst het weefsel in vloeibare stikstof gekoeld propaan. Historisch, werd duik invriezen uitgevoerd in vloeibare stikstof gekoeld chloorfluorkoolwaterstoffen maar deze materialen zijn gefaseerd buiten gebruik als gevolg van de negatieve effecten op het milieu. Zelfs in de beste cryobeschermende omstandigheden, de aard van de werkwijze onvermijdelijk een grof, gravel zoals oppervlakte in cytoplasmatische fracturen; echter breuken door membraan structuur blijkt goed georganiseerde functies met specifieke planaire organisaties verhouding tot hun oriëntatie in de celmembraan. Deze beelden zijnalleen mogelijk met het gebruik van cryoprotectant middelen zoals glycerol dat ijskristal schade te beperken en glycerol zich in sommige gevallen kunnen kunstmatig herverdeling van membraangebonden deeltjes voeren. Bovendien kan glycerol niet sublimeren van het breukvlak bijgevolg ruimte voor succesvolle etsen beperken. Als ook de ets procedure gewenst is, dan moet het monster in een mode die ijskristal schade beperkt met vloeibare helium of stikstof slush ofwel snel bevroren en / of benaderd door het gebruik van een koude beschermend middel zoals aceton dat eenvoudig gesublimeerd uit gebroken oppervlakken.
Hoewel de eerste verslag Steer's was gericht op de beeldvorming van virussen, het is in de membraan structuur die freeze-fractuur / etsen voldeden meer uitgebreide toepassing. Inderdaad, structuren zoals strak en gap junctions en ciliaire membraan specialisaties zijn elegant geopenbaard in freeze-fractuur voorbereidingen. Freeze-fractuur heeft gevod veel nut in het bereiken van een goed begrip van membraan differentiatie tijdens de ontwikkeling van 15, 17,24 en in het membraan pathologie 25-30. Eerdere rapporten van dit laboratorium, hebben het patroon van differentiatie van strakke junctionele complexen tijdens luchtwegen ontwikkeling aangetoond, verstoring van de ciliaire membraan structuren in verband met experimentele besmettelijke blootstelling middel, en de degradatie van strakke junctionele complexen in epitheelcellen in verband met luchtverontreinigende stof en tabaksrook blootstelling bij proefdieren en proefpersonen.
Technische Uitbreidingen van de Freeze-Fracture / Freeze-etch Procedure
Het blussen methode met behulp van vloeibaar propaan specimens hier beschreven bevriezen is misschien wel de meest voorkomende benadering van bevriezing biologische monsters voor conventionele freeze-fractuur. Moet echter andere benaderingen om bevriezing bestemmen wanneer vries-etsen wordt uitgevoerded. Omdat glycerol is een non-etchablecryoprotectant, specimens freeze-etsen dienen op een manier die ijskristalvorming beperken worden bevroren. Dit kan worden bewerkstelligd met behulp van een etchablecryoprotectant zoals aceton en / of bevroren het specimen monteren tegen een metalen oppervlak gekoeld met vloeibaar helium of vloeibare stikstof slush. Snel invriezen zonder koude beschermende middelen ook kunnen worden uitgevoerd via spuiten bevriezing of hoge druk invriezen in vloeibaar propaan.
Recente pogingen om de structuur en functie met behulp van freeze-fractuur technologie verder betrekking hebben deze techniek in concert toegeëigend met immunohistochemische etikettering 31, 32. Hier kunnen antilichamen tegen specifieke antigenen effectief en nauwkeurig gelokaliseerd membraan plaatsen (Figuur 11).
Terwijl freeze-breuk met eenrichtingsverkeer shadowing is veruit het meest gebruikte protocol, zullen sommige experimentele ontwerpen oproep voor snel invriezen met little of beperkte cryoprotection, vergezeld door etsen van het gebroken oppervlak waar celoppervlakken, extracellulaire matrix en / of macromoleculaire complexen en roterende shadowing contrast 16 (Figuur 12 en Figuur 13) geven onthullen.
Er is een groeiende interesse in toepassingen van freeze-breuk in de nanotechnologie, materiaalkunde, en in het gebruik van deze techniek als een imaging tool in de moleculaire biologie. Inderdaad, nanomaterialen op vele manieren consistent in hun organisatie virale structuren waarvoor freeze-fractuur werd oorspronkelijk voorgesteld als een middel voor beeldvorming. Bovendien vervaardigd liposomen, structuren vergelijkbaar in vorm biologische membranen, worden op grote schaal bestudeerd voor gerichte toediening van farmaceutische middelen en gentherapie. Omdat hun organisatie is in wezen membraan als, freeze-fractuur verwerking kan aanzienlijke nut hebben in het produceren van het onthullen van beelden als een component in ontwikpingen deze therapieën 33.
Samengevat zijn freeze-fractuur technologieën van historisch belang geweest karakteriseren de inrichting en functie van celmembranen. Echter, freeze-fractuur vinden van nieuwe gebieden van nut in coördinatie met de moleculaire biologie en nanotechnologie en vrijwel zeker zal bijdragen aan de vooruitgang in deze snel opkomende velden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| Standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| Sodium dichromate | various suppliers | ||
| Sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Propane | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
References
- Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
- Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
- Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
- Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
- Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E.
- Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
- Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
- Chandler, D. E., Sharp, W. P. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kuo, J. ohn 1117, 95-132 (2014).
- Severs, N. J.
- Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
- Rohatgi, R., Snell, W. J.
- Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
- Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
- Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
- Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
- Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
- Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
- Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
- Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
- Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
- Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
- Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).
