Biyolojik Elektron Mikroskopi Freeze-kırık / Freeze etche Temel Teknik Elemanları

Summary

Temel teknikler ve transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için biyolojik örneklerin ve nanomateryallerin dondurularak kırık işleme iyileştirmeler açıklanmıştır. Bu teknik ultrastrüktürel özellikleri ve biyolojik membranların uzmanlık ifşa ve malzeme bilimleri ve nanoteknoloji ürünleri ultrastrüktürel düzeyde boyutlu ve konumsal verilerin elde edilmesi için tercih edilen bir yöntemdir.

Abstract

Doğada numuneler, genellikle biyolojik veya nano malzeme, kırık, dondurulmuş ve bir karbon / platin "cast" transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için tasarlanan oluşturmak için çoğaltılır sayede Freeze-kırık / donma-etch bir süreci anlatmaktadır. Örnekler sıvı azot, yüksek vakum altında sıcaklıklara soğutulan numune daha sonra kırılma ile, çoğu kez buz kristal oluşumunu sınırlamak için kriyo-koruyucu maddelerin mevcudiyetinde, ultra hızlı dondurma oranlarına tabi tutulurlar. Elde edilen kırık yüzey çoğaltılır ve döküm yüzeyi için üç boyutlu detay kazandıran bir açıdan karbon ve platinyum buharlaştırma ile stabilize edilir. Bu teknik, hücre zarlarında ve uzmanlık soruşturma için özellikle aydınlatıcı kanıtlamıştır ve ilgili hücre fonksiyonu hücresel form anlayışı önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Bu raporda, biz gerçekleştirmek için alet gereksinimleri ve teknik protokolünü anketdondurularak kırılmış hali olduğundan, ilgili isimlendirme ve kırılma düzlemlerinin özellikleri, donma-fraktür görüntülerin yorumlanması için geleneksel prosedür içinde yapılacak değişikliklerin ve kriterleri. Bu teknik yaygın hücre biyolojisi birçok alanda ultrastrüktürel inceleme için kullanılan ve moleküler, nanoteknoloji için gelişmekte olan bir görüntüleme tekniği olarak sözünü tutar ve malzeme bilimi çalışmaları olmuştur.

Introduction

Kavramı ve biyolojik örneklerin dondurularak kırık işleme pratik uygulama bir yarım yüzyıl önce üzerinde Steere ¹ tarafından tanıtıldı. Erken cihaz çalışan bir kendi kendine yeten ¹ içerisinde farklı bileşenleri tahsis. Orijinal alet değiştirilmiş ve uzak manipülasyonu, yüksek vakum bakımı için kritik ihtiyacı karşılamak için, ticari olarak temin edilebilen cihazlarla rafine ve karbon ve metal buharlaşma transmisyon elektron mikroskobu (Şekil 1 ve Şekil tarafından incelenmesi için uygun bir kopyasını üretmek için olan 2).

Tipik örnek tablo ve alet kolu mikrotom düzenlenebilir sıvı azot throughput olan (Şekil 1) ile yüksek bir vakum odasına oluşur. Hazne aynı zamanda örnek aşamasına 90 ° bir açı ve PLATI için diğer uçta yer alan C-buharlaşma stabilize edilmesi için, iki elektron tabancası, bir ev45º (Şekil 2) - ayarlanabilir açı, tipik 15º de gölgeleme num / karbon. Ünitesine güç vakum pompayı çalıştırmak için uygulanır ve elektronik paneller sıcaklık ayarı ve elektron tabancası kontrolünü düzenlemek.

Başlangıçta muayene ve hücre zarlarının analizi ve uzmanlık ^{2, 3} için bir teknik olarak daha popülerlik kazanmıştır-kırığı, dondurma virüslerin gelişmiş görüntüleme elde etmek için bir araç olarak tasarlanmıştır. Nitekim, bu prosedür hücrelerin ve dokuların ve bu çalışmaların birçok hücre ve moleküler biyoloji ^4-9 klasik katkıları olarak standı yapı / işlev ilişkileri nedenlerine açıklık ayrılmaz olmuştur. Donma-kırık tekniğinin gelişimi için ana amaç ve gerekçesi konvansiyonel biyolojik elektron mikroskobu kullanılan kimyasal sabitleme ve işleme kaynaklanan elektron mikroskobik çözünürlükte gözlemlenebilir eserler sınırlamak oldu. Burada amaç kimyasal sınırlamak içinsabitleme yeterli hızda ve genellikle buz kristal oluşumunu ve bir dondurucu eserler sınırlamak amacıyla, bir kriyokoruyucu mevcudiyetinde örnek dondurma ve. Daha yakın zamanlarda, bu teknik nanopartiküller ve nanomateryallerin incelenmesi için moleküler biyologlar ve malzeme bilimi araştırmacıları bir ilgi patlaması buldu.

-Kırığı dondurma ve dondurarak-etch görüntüleri üç boyutlu bir karakter sergileyen ve bazen tarama elektron mikroskopta için yanlış vardır. Bununla birlikte, donma-fraktür preparatlar transmisyon elektron mikroskobu ile incelenir ve yüksek çözünürlüklü morfolojik çalışmalarında, önemli bir katkı, hücre zarlarının yapı / fonksiyon elemanlarının kendi benzersiz bir temsilidir. Dondurarak kırık işlenmesi ve / veya gliserol gibi dondurarak saklama maddelerin kullanımı ile buz kristalleşmesini sınırlandırmak için yeterli bir hız ile hücreler ve dokuların dondurma ile başlatılır. Numuneler daha sonra vakum ve bir temsilcisi altında kırılmıştır edilirLica çatlak yüzeyi üzerinde platin, karbon ve buharlaştırılması ile elde edilir. Orijinal numune standart EM numune ızgara üzerine alınır kopyadan sindirilir. Donma-kırık görüntülerin başka bir yaygın yanlış yorumlanması onlar hücre yüzeylerine tasvir olmasıdır. Donma-kırık temel dayanak biyolojik membranlar kırılma süreci (Şekil 3) ile çift katlı lipid yoluyla bölünmüş olmasıdır Ancak. Biyolojik membranların Bu işlem, iki kırılma yüzü, hücre dışı bitişik membranın biyomoleküler broşürün yarısını ortaya sitoplazmadaki PF yüze bitişik membranın yarısının organizasyonunu göstermektedir bir ve bir verir ortam, EF-yüz. Gerçek hücre yüzeyleri donma kırık görüntüleri temsil ama kırık prosedür takip donma-gravür sonraki adımı eklendi kullanıldığında, yalnızca görünür değildir. Etkin yüzey detai ortaya çıkarmak için daha önce kırık örnekleri etch içinl numuneler bir hızla ve unetchablecryoprotectant olmadan donmuş olması gerekir. Yatan özellikleri ortaya kırık numunenin yüzeyinden suyun Gravür numune tutma aşaması arasında bir ısı farkı oluşturarak numune sahne üzerinde soğutma mikrotom kol ve yüzeyden süblime suyun neden soğutma mikrotom kolu konumlandırılmasıyla gerçekleştirilir. Su donma-etching manevrasında kırılan numune yüzeyinden süblime olduğu zaman, gerçek hücre yüzeylerinde, hücre dışı matrisin, sito-skeletal yapıları ve moleküler düzeneklerinin gereksinimleri yüksek çözünürlükte açığa çıkarılabilir. Böylece-donma kırık ve-etch dondurma değiştirilebilir terimler değil, aksine son hangi belirli çalışmanın ihtiyaçlarına bağlı olarak gerekli veya arzu olmayabilir adım adım sürecini yansıtmaktadır.

Donma-kırığı sonrası / donma-etch prosedürleri, kırılan yüzeyler yönettiği evapora tabi tutulurlaryineleme destek ve görüntüleme kontrast sağlamak amacıyla karbon ve platin kat tive. Platin / karbon görüntüleme buharlaştırma tek yönlü ya da döner olabilir ve direnç veya elektron tabancası ya da gerçekleştirilir. Bilinen bir açı, tipik 30º tek yönlü gölgeleme - 45º, bazı morfometrik performans hesaplamaları yararlıdır. Derin dağlama maruz kalmış örnekler, normalde gölgeli döner ve bu örneklerin sonuçta görüntüleri fotografik değerlendirme için tersine çevrilir.

Tarihi hem de donma-fraktür / donma etch tekniğin mevcut bir amacı daha geleneksel bir transmisyon elektron mikroskobu prosedürler ile ilişkilidir eşya örneği, kimyasal tespiti ve işleme sınırlamaktır. Ancak, bu teknik ve n, üç boyutlu detay görüşmek ve dolayısıyla biyolojik, malzeme bilimi morfometrik verilere edinimini kolaylaştırmak için yeteneği bir maddi avantaj sağlaranotechnology örnekler. Kırık-Freeze ve donma-etch işlemleri karmaşık ve çok boyutludur ve uygulamanın bazı yönleri özelleştirilmiş. Bu sunum sürecinin önemli özelliklerinden bir anket görünüm sunuyor ve okuyucu özel araştırma ihtiyaçları için süreci ayrıntıları ele almak ve özelleştirmek amacıyla kapsamlı yayınlanan protokolleri ^{10, 11} anılır.

Protocol

Freeze-kırık / Freeze-rölyefler için Biyolojik Örneklerinin 1. Hazırlık

1. 1 saat süre ile 0.1 M fosfat tampon maddesi içinde bir geleneksel sabitleyici EM formülasyon örneğin% 2 glutaraldehid +% 2 paraformaldehid kullanın. Biyolojik dokuların primer fiksasyonu gerçekleştirmek için. NOT: önceden tespit edilmeden örneklerinin bazı türleri dondurmak için istenebilir bir husussa da, genel kan kökenli patojen önlemler numune insan dokusu oluşur uygun tespit mecburi kılmaktadır.
2. Birincil tespit sonra, en fazla 1 saat süre ile 0.2 M sukroz ile takviye edilmiş aynı tampon maddesi içinde örnek yıkayın.
3. 1 saat daha fazla bilgi için, 0.1 M fosfat tamponu içinde% 25 gliserol içeren bir dondurarak saklama çözeltisi için numune aktarın.

Freeze-kırık Advance 2. Donma ve Örneklerinin Depolama

1. Uygun boyutu ve numune için şekil seçin altın veya bakır numune taslakları işleniyor (Şekil 4
2. Iyi dereceli forseps ve / veya bir metal örnek, çubuk üzerine numunenin küçük ebatlı şırınga iğneleri konumun küçük fragmanların kullanılması.
   1. , Bir yapışkan için numunenin sıvı içeriğini azaltmak hafifçe filtre kağıdı ile saplama kenarından sıvı alımı ile tutkal karışımı gibi.
   2. Tek kopyaları için, saplama üzerinde doku bir höyük oluşturmak için küçük ebatlı şırınga iğneleri kullanın. Çift kopyaları için, tam olarak saplama üzerinden başka bir taslaktır ve konumu ters ve bir sandviç (Şekil 5A) oluşturarak örnek yüzeyine hafifçe yerleştirin. İki taslakları arasından dışarı örneği basmayın.
3. Sıvı nitrojen ile iki izole edilmiş bir Dewar kabı doldurmak. NOT: İlk kap, bir ticari olarak temin edilebilir bir silindir (Şekil 5B) 'den gelen propan gazı küçük bir hacim sıvılaştırılması için kullanılan küçük bir kuyu metal içeren bir yazı barındırmaktadır. İkinci gemi için kısa gemi tutma / bölümlenmiş bir depolamaly sıvı azot altında donmuş numuneler sürdürmek.
   1. Propan kuyuda yer alan silindir sıkma enjektörü kullanılarak, silindir valfini açmak ve gazın sıvılaştırılması olan ilk kabın kuyunun içine akmasına izin verir. NOT: DİKKAT !! PROPAN İLETİŞİM AÇIK YARALANMA DONMA VEREBİLİR, PATLAYICI OLDUĞU VE BİR boğucudur. Sadece bu tür kullanımı, düşük sıcaklıklara karşı koruyucu giysiler kullanarak, aynı zamanda yabancı tutuĢmayı önlemek için özen ve yeterli havalandırma korumak için sertifikalı bir kimyasal kaputu propan kullanın.
   2. Mümkün olduğu kadar çabuk, örnek, iyi derecedeki forseps ile bağlayın ve sonra hızlı bir şekilde sıvı azot içinde ikinci tutma aracına (Şekil 5B) aktarmak için bir kaç saniye için birinci kap içinde likid gazın içine dalma al.
   3. Numuneler dondurulmuş sonra, hazır olana kadar, sıvı azot altında saklamak dondurularak kırılmış bitki aktarmak için kullanılır. Genişletilmiş için daha geniş bir depolama sıvı azot Dewar kabına aktarın taslaklarıistenirse, ancak bakım depolama taslakları çözülme izin vermemek için alınmalıdır.

Freeze-kırık 3. Operasyon Çalgı ve Numune İşleme

1. Pirinç tutucu ve yükleme odasına numuneleri
   1. Bir kitapçık tipi çift çoğaltma numune tutucu içine altın örnek taslakları yükleyin veya sıvı azot altında cihazı kelepçe ve numune odasının (Şekil 6) Pozisyona hazır kadar orada korumak.
   2. Odası, yüksek vakum (yaklaşık 2 x 10 ^-6 mbar) elde etti ve kademeli sıvı azot sıcaklığına soğutulmuş edildiğinde, pompa kapatmak odasına havalandırma ve mümkün olduğunca çabuk numune masanın üzerine monte edilmiş numune taslakları konumlandırmak .
   3. , Pompa açın yüksek vakum yeniden ve mikrotom kol ve bri için örnek tablo -100 ° C sıcaklık ve doğrudan sıvı azot ayarlamak için elektronik sahne ve kol sıcaklık denetimlerini kullanınSıvı azot sıcaklığa ng.
2. Kırılma sürecidir
   1. Sıvı azot sıcaklığında yüksek vakum, -100 ° C 'bir sıcaklıkta ve mikrotom kolu sağlanması üzerine, uzaktan böylece numune üzerindeki bağlar örnekleri kırılma çift kopya numune tutucuyu açmak için (dondurularak fracture_movie1.mov).
   2. Dağlama aşağıdaki kırık yönelik örneklerin durumunda, tıraş mikrotom kolunda bir kelepçede muhafaza edilen bir jilet kullanın (yani, kırılma) aşama 3.2.1 yerine numunelerin yüzeyi (dondurularak etch_movie2.mov).
   3. Ilave dondurularak gravür adım yapılacak ise, bir kaç dakika için bir yayın çatlak yüzeyler üzerinde soğutuldu mikrotom kolu yerleştirin. NOT: kırık yüzeyinden Bu manevra süblime (yani, aşındırma) su. Bu manevranın etkisi fra ek olarak, su, süblimleştirme yolu ile gerçek hücre yüzeyleri, hücre dışı matris ve / veya molekül yığınları ortaya çıkarmaktırcture zarların lipit ikili tabakasına geçen yüzleri.
3. Metal gölgeleme ve çoğaltma desteği buharlaşma elektron tabancaları kullanılarak
   1. Platin / karbon veya elektron tabancası direnç etkinleştirme ve 30º'lik bir açıdan çatlak yüzeyi üzerinde platin / karbon ince bir tabaka halinde (yaklaşık 2 nm) buharlaşmasına izin verin - 45 °. 20 saniye - Bu, tipik olarak yaklaşık 15 gerektirir.
   2. Adım 3.3.1 olarak karbon elektron ya da direnç silah etkinleştirin ve yineleme destek vermek için tepeme (90 °) den kırık numune yüzeyine karbon ince bir tabaka buharlaşır. 20 saniye - Bu, tipik olarak yaklaşık 15 gerektirir.
4. Kopyalarından Alma
   1. Çoğaltma gölgelenmesi ve karbon stabilizasyon işleminin tamamlanmasından sonra, vakum pompası devre dışı bölmesinin havalandırılması ve numune aletten sökün.
   2. Iyi dereceli bir çift forseps kullanarak çift her altın örnek saplama kaldırmakçoğaltma kitapçık / kelepçe ve yavaşça bir nokta plaka (Şekil 7) bir su yüzeyine saplama indirmeden önce birkaç saniye çözülme sağlar. Not: su yüzeyinin üzerine yüzer yapışkan numune materyali içeren karbon / çoğaltma platin.
   3. Ince tel bir halka ya da ince forseps dereceli ve bir kaç saat için bir% 50 sülfürik asit içinde,% 5 sodyum dikromat ihtiva eden bir başka nokta plakasına transferi ile yapılan geleneksel bir bakır ızgara elektron mikroskobu kullanılarak kopyaları manevra. NOT: Bu banyo kopyadan gerçek biyolojik örnek malzeme sindirir. Tam mukavemeti maddeleri ağartma dikromat / sülfürik asit çözeltisi için ikame edilebilir.
   4. Sindirim tamamlandığında, temiz su yüzeyine geri çoğaltma aktarmak ve standart bir bakır elektron mikroskobu ızgara üzerine almak. (NOT: Replikasyonlar sindirim esnasında daha küçük parçalara bölünmesini olabilir ama daha çok küçük maketler önemli bilgiler içerebilir ve retr olmalıuygulaması hedeflenmektedir ve muayene.) onlar nazik kullanımla yıllarca stabil kalır piyasada mevcut ızgara kutular ızgaraları destekleyen saklayın çoğaltma.

Freeze-kırık / aşındırma Replicas 4. ultrastrüktürel incelenmesi

1. 80 kV -, tipik olarak 50 'den itibaren artan bir voltajı bir transmisyon elektron mikroskobunda göster kopyaları.
2. Standart TEM film ya da yüksek çözünürlüklü bir dijital kamera ile ilgili görüntüleri kaydedin.

Representative Results

Donma-fraktür görüntü yorumlama anahtar öncül kırılma düzlemi esası PF-yüzü (plazma kırıklı-yüzü) ve EF-yüzü (hücre dışı kırıklı-yüz) (Şekil denilen iki kırılma yüzü kazandıran zarların lipit ikili tabakasına geçer, yani 3). PF-yüz hücre ve EF yüze sitoplazmasına bitişik membran lipid tabakasının yarısına bitişik hücre dışı ortamı membran lipid tabakasının yarısına eşittir. Donma-fraktür tekniği membran yapısının araştırılması için özellikle yararlı olduğu ve bu iki yüzü tipik olarak, PF-yüzler daha az içeren, EF-yüzleri aksine çok sayıda membran ilişkili tanecikler ile doldurulur ile belirgin bir biçimde farklıdır. Dondurulmuş-kırılmış hücrelerin sitoplazmik içeriği tipik olarak kaba bir görünüm olup, bu çekirdek ve Golgi gibi zara bağlı organeller kolaylıkla tespit edilebilir, ancak özellikle ifşa değildir. Özellikle ilgi çekici olan inve içinBu teknik kullanılarak stigators fonksiyonlarına yorumlanabilir membran yapısının uzmanlık vardır. Bu zar ilişkili tanecikler belirli dağılımları, siliyer membran uzmanlık ve hücrelerarası kavşaklar vardır.

Kirpikler ilişkili Yapıları

Her bir ökaryotik kirpiksi cisim ve flagellum'un tabanında hücre zarında ikamet eden (Şekil 8) ^12-16, zara bağlı bir parçacık dizisi kirpiksi cisim milini çevreleyen şeritler halinde düzenlenmiş ve siliyer kolye olarak bilinir. Bu yapı, çeşitli türlerde morfolojik bir derecede heterojenlik sergileyen ve bunun ciliogenesis sırasında siliyer milin ortaya çıkmasından önce görünür ve olgun kirpiksi cisim içinde yerinde kaldığı şekilde çok fonksiyonlu mademki olduğu tartışılmaktadır. Doğmakta olan siliyer kolye e zaman önce membran parçacık diziler toplama ve organizasyonu türemiştirGelişmekte olan axoneme ¹⁴ erken organizasyonunda olası katılımını gösteren ciliogenesis sırasında siliyer milinin mergence.

Sıkı Kavşaklar ve Epitelyal permeabi vasıflı

Çeşitli epitel, donma-kırık çalışmalar bazolateral sınırların apikal yönünü çevreleyen iplikçik ve oluk yapıları örgülü sofistike bir organizasyon ortaya koymaktadır. Bu bant-benzeri bir yapı sıkı bir bağlantı ya da zonulaoccludens (Şekil 9) olarak da bilinir ve paraselüler akı ^{3, 17-20} epitel geçirgenliği olan bir düzenleyicisi olarak görev yaptığına inanılmaktadır. Daha karmaşık bir organizasyonu ile, bu "sıkı" olarak tarif edilmekteyse de birkaç ayrılmaktadır sıkış kesişmeler "sızıntılı" olarak tarif edilmiştir. Bu organizasyon bunların ilişkili olduğu için, epitel fonksiyonunu uygun görünmektedir. Sıkı bağlantıların PF-yüzler EF-yüzler sergi compleme ise iplikçikler olarak görünürntary oluklar.

Gap Kavşaklar ve İntraselüler İletişim

Ara bağlantılar (Şekil 10) temel olarak çeşitli dokularda bir dondurularak kırılmış hali preparatlar görünür ve EF-yüzler PF-yüzler ve tamamlayıcı çukurlar parçacıkların yoğun dizileri ile temsil edilmektedir. Bu yapılar hücrelerarası iletişimi kolaylaştırmak membran siteleri temsil ettiği düşünülmektedir. Bunların mevcut bulunması durumunda dokularda, düşük molekül ağırlıklı floresan boyalar ve kalsiyum akışının geçişi gösteriler da sinyal molekülleri geçişi için fiziksel bir yol temsil düşündüren ^21-24 gösterilmiştir.

Ticari dondurma-kırık / aşındırma tesisi Şekil 1. Düzen. At kadar basınçlı Dewar f solnumune sahneye sıvı azot soğutma ve kontrollü koşullar altında microtome kolunu soğutma eeding. Merkezinde sağa örnek odası ve elektronik kontrol panelleri ile birimdir. Sağ tarafta boşaltım gazı atmosfere numune odasını getirmek için kullanılan sistemin bulunduğu bir ek sıvı azot tanktır.

Kapı ile Şekil 2. Freeze-kırık / aşındırma bitki örneği odası yönlü amaçlayan elektron tabancası konumlarını, soğutma örtüsünü açılacak, ve numune pirinç sahipleri numuneleri konumlandırılmıştır sonrası. Örnekler solundaki bir kapıdan odasına tanıtıldı odası.

Şekil 4. dondurarak kırma / aşındırma işlemleri için numune bağlar İki tür. (Sol) çift kopya örnek tutucu kitapçık aşındırma olmadan gerçekleştirilen, geleneksel dondurularak kırılmış hali prosedürler için kullanılmaktadır. Numune iki altın örnek taslakları arasında sıkıştırılır ve pirinç kitapçık konumlandırılmış. Örnek (donma-Fract bak numune odasında vakum altında kitapçığı açarak çatlatılmasının ure_movie1.mov). (Sağ) Dondurularak gravürü için öncelikle kullanılan montaj. Örnek altın lamı üzerine yerleştirilir ve pirinç tutucu içine kilitlenir. Numune mikrotom kolu sabit bir tıraş bıçağı ile tıraş nazik ile parçalanmıştır. Bu konfigürasyon (dondurularak etch_movie2.mov bak) dağlama işlemleri için tercih edilir.

Bir dondurularak kırılmış hali olduğundan, numunenin Şekil 5. hazırlanması monte edilir. Numune iki altın tamponla (A) arasında sıkıştırılır ve iyi olarak ihtiva eden, sıvı azot içinde dondurulmuş bir sıvı azot içeren bir Dewar tutma (arka plan) daha sonra transfer ile propan (ön) eklenmiştir ( B).

ig6highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil donma-fraktür / aşındırma bitkinin numune odasına giriş için hazırlık olarak çift kopya örnek tutucu kitapçık olarak donmuş bir dondurularak kırılmış hali olduğundan, numunenin konumlandırma 6. gösterilmesi.

Kırığı takip ve donma-kırık / aşındırma bitki gölgeleme kopyaları Şekil 7. Alım. "A" spot plaka temiz bir su yüzey. Örnek saplama yüzen çoğaltma "B" iyi olarak kopyadan doku sindirimi için bir sodyum dikromat veya tam güçlü çamaşır suyu bir çözeltisini ihtiva eden asitleştirilmiş aktarılır. "C" temizlenmiş çoğaltma b öncesinde transfer edildiği müteakip temiz su yüzeyleri temsilbir bakır ızgara üzerine elektron mikroskopisi geri eing.

Şekil 8. silyalar dondurularak kırılmış hali ile ortaya benzer yapıları. Beyaz oklar ciliogenesis geçiren epitel hücrelerinin lüminal sınırında özel bir zar parçacık dizilerine işaret etmektedir. Bu parçacık diziler acil ve olgun kirpikler (siyah ok) üslerinde bulunan olgunlaşmamış siliyer kolyeler temsil eder. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 9. Kırılma epitel hücre zarları ortaya yoluyla PF ve EF-kırık yüzleri örneklerini ing. sıkı kavşak komplekslerinin iplikçik ve oluk organizasyon belirgindir ve hücreler arası uzay oklarla işaretlenmiş. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 10. sıçan karaciğerinde bir boşluk kavşak bir dondurularak kırık görüntü. Parçacıklar PF-yüzünde belirgindir ve tamamlayıcı çukurlar EF-yüzünde belirgindir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

4 / 51694fig11highres.jpg "width =" 500 "/>
Kolloidal altın kullanarak bir konneksin Şekil 11. immünohistokimyasal lokalizasyonu boşluğu kavşağı belirli bir yeri gösteren bir dondurma-kırık hazırlanması antikor etiketli. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 12. Derin dağlama ve döner gölgelendirme ile hızlı dondurma örneği. Epitel hücre sitoplazmasında ile kırık olan ve bir PF-yüz belirgin (ok başları). Ok uçları arkasında sonraki aşındırma ortaya çıkardığı bir gerçek hücre yüzey görülebilir. Lütfen cliBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için burayı ck.

Şekil 13. sığır trakea ciliaryaxoneme içeren moleküler kompleksleri ortaya çıkarmak için derin aşındırma ve döner gölgelendirme ile hızlı dondurma örneği. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Onun tanıtımı ve ticari kullanılabilirliği takip yıllarda, donma-kırık / aşındırma prosedürleri yaygın biyolojik membran yapısının araştırmalar için kullanılmıştır. Aslında, membran yapısal özellikleri, bazı en iyi ve en bakış donma-fraktür / aşındırma preparasyonlarda elde edilmiştir. Bu çalışmalar sadece membranların yapısal organizasyonu anlaşılmasına katkıda ama aynı zamanda yapısı ve fonksiyonu ile ilgili nasıl içgörüler sağladı.

Rutin biyolojik elektron mikroskobu gelişi biyolojik örnekler diferansiyel elektron yoğunluğunu sağlamak için gerekli aldehit fiksatifleri, reaktif kimyasallar ve ağır metaller ile kimyasal tedaviler kendilerini dışlayıcı nesil katkıda dair bir farkındalık getirdi. Donma-kırık teknolojisinin gelişmesi işleme paraziti azaltmak için bir çaba kısmen dayanıyordu. Bununla birlikte, bu donma-fraktür kabul edilmiştir/ Aşındırma buz kristali hasar büyük biri eserler kendi kümesini tanıttı. Dokular bağlı ultrastrüktürel detay yoketmek buz kristallerinin oluşumuyla sonuçlanır örneği çevreleyen bir azot gazı yalıtım tabakasının oluşumuna sıvı azot deneyimi içine doğrudan indirgenmiş bir soğutma hızı düştü. Bu sorun, gliserin gibi dondurarak saklamada kullanılan koruyucuların kullanılması ile ve sıvı nitrojen soğutmalı propan ilk doku dondurma ile yenilmektedir. Tarihsel olarak, dalma donma klorofluorokarbonlar sıvı azot soğutmalı yapıldı, ancak bu malzemeler nedeniyle çevre üzerindeki olumsuz etkileri kullanımdan kaldırılmıştır. Hatta en iyi kriyokoruyucu koşullarda, işlemin niteliği kaçınılmaz sitoplazmik kırıklarda bir yüzey gibi bir kaba, çakıl ile sonuçlanır; Ancak, zar yapıları aracılığıyla kırıklar hücre zarındaki yönelime göre belirli bir düzlemsel örgütlere sahip, iyi organize özelliklerini ortaya koymaktadır. Bu görüntülerMümkün bazı durumlarda sadece buz kristali zararı en aza indirmek gliserol gibi dondurarak saklama maddelerinin kullanılması, ve gliserol kendisi de kaplamala bağlantılı olan parçacıklar, yapay, yeniden dağılımını katabilmektedir. Ayrıca, gliserol böylece başarılı gravürü için kısıtlanmış kırık yüzeyinden süblime edilemez. Takip eden dağlama işlemi prosedürü tercih edilir, daha sonra hızlı bir şekilde her iki numune, sıvı helyum veya nitrojen kullanarak çamuru, buz kristali hasarı sınırlandırır bir şekilde, dondurulmuş olması ve / veya hali hazırda çatlak ikinci süblimleşebilir, aseton gibi bir dondurarak saklama koruyucusu gibi kullanılmasıyla yaklaştı yüzeyler.

Steer'in ilk rapor virüsleri görüntüleme odaklanmış olmasına rağmen, donma-kırık / aşındırma daha geniş uygulama bulmuştur zar yapıdadır. Nitekim, bu tür sıkı ve boşluk bağlantıları ve kılcal membran uzmanlık olarak yapılar zarif dondurarak kırık hazırlıklarında ortaya konmuştur. Dondurulmuş kırık foun vardırgelişme ^{15, 17,24} sırasında ve membran patoloji ^25-30 membran farklılaşma bir anlayış ulaşmada d önemli yarar. Bu laboratuvardan Önceki raporlar, havayolu gelişimi sırasında sıkı bağlantı komplekslerinde farklılaşma desen göstermiştir, siliyer membran deneysel bir enfeksiyöz ajan maruziyeti ile ilişkili yapılar ve hava kirletici ve tütün dumanı maruziyeti ile ilişkili solunum yolu epitel hücrelerinde sıkı bağlantı komplekslerinde bozulması bozulması Deney hayvanları ve insan deneklerde.

Teknik Uzantıları Freeze-Kırılma / Freeze-etch Prosedürü

Burada anlatılan örnekleri dondurmak için sıvılaştırılmış propan kullanılarak söndürme yöntem belki de geleneksel dondurma kırığı için biyolojik örneklerin donma en yaygın yaklaşımdır. Fakat, donmuş diğer yaklaşımlar, dondurarak-dağlama gerçekleştirmek için burada tahsis edilmelidired. Gliserol olmayan bir etchablecryoprotectant olduğu için, buz kristal oluşumunu sınırlamak şekilde dondurulması gereken dondurularak gravürü için örnekler. Bu aseton gibi ve / veya örnek bir metal yüzeyine karşı, sıvı helyum veya sıvı azot bulamacı soğutuldu monte dondurma ile bir etchablecryoprotectant kullanılarak gerçekleştirilebilir. , Dondurarak saklama koruyucuları olmadan hızlı bir şekilde dondurulması da sıvılaştırılmış propanın dondurma sprey dondurma ya da yüksek basınç kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Ayrıca yapı ve fonksiyonu kullanılarak dondurularak kırık teknolojiyi ilişkilendirmek son çabalar immünohistokimyasal etiketleme ^{31, 32} ile uyum içinde bu tekniği benimsedik. Burada, belirli antijenlere karşı antikorlar etkili ve doğru bir membran sahaları (Şekil 11) ile lokalize edilebilir.

Tek yönlü gölgeleme ile dondurularak kırık kadar en yaygın kullanılan protokol tarafından iken, bazı deneysel tasarımlar Littl ile hızlı dondurulması için arayacakE ya da sınırlı donmaya karşı koruma, kontrast ¹⁶ (Şekil 12 ve Şekil 13) vermek üzere gerçek hücre yüzeyleri, hücre dışı matris ve / veya makro-moleküler kompleksler ve döner gölgeleme ortaya çıkarmak için, kırılmış yüzey aşındırma eşlik etmektedir.

, Ve moleküler biyoloji bir görüntüleme aracı olarak bu tekniği kullanarak nanoteknoloji dondurularak-kırığı, malzeme bilimi uygulamaları artan bir ilgi var. Nitekim, pek çok yönden nanomateryaller dondurularak kırık başlangıçta görüntüleme için bir araç olarak öngörüldü olan viral yapılar ile organizasyon tutarlı olabilir. Ayrıca, üretilen lipozomlar, biyolojik zarların form benzeri yapılar, yaygın olarak farmasötik maddelerin hedeflenen bir gönderim ve yönelmiş gene terapisi için çalışmalar yapılmaktadır. Organizasyonları esas olduğu gibi donma-fraktür işlem geliştirme ya bir bileşeni olarak ortaya görüntü üretiminde önemli bir kullanıma sahip olabilir zarBu terapileri ³³ ping.

Özetle, donma-kırık teknolojileri hücre zarlarının organizasyonunu ve fonksiyonunu karakterize tarihi önemi olmuştur. Ancak, donma-kırık bu hızla gelişmekte olan alanlarda gelişmeler katkıda neredeyse kesinlikle, moleküler biyoloji ve nanoteknoloji ile koordineli programı yeni alanlar bulmak.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant	Balzers	BAF400T
Standard buffers	various suppliers
Standard aldehyde fixatives	various suppliers
Sodium dichromate	various suppliers
Sulfuric acid	various suppliers
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation	Technotrade International
Liquid nitrogen	various suppliers
Propane	various suppliers
Disposable supplies for electron microscopy	Electron Microscopy Sciences
Transmission electron microscope	Carl Zeiss Inc.