Summary
Grundläggande tekniker och förfiningar av frysfraktur bearbetning av biologiska prover och nanomaterial för undersökning med transmissionselektronmikroskopi beskrivs. Denna teknik är en föredragen metod för att avslöja ultra funktioner och inriktningar av biologiska membran och för att erhålla dimension och rumsliga data ultra nivå inom materialvetenskap och nanoteknik produkter.
Abstract
Fryst fraktur / frysetsning beskriver en process där prover, vanligen biologisk eller nanomaterial i naturen, är frysta, sprucket, och replikeras för att generera ett kol / platina "cast" avsedd för undersökning med transmissionselektronmikroskop. Prover utsattes för ultrasnabba frysningshastigheter, ofta i närvaro av kryoskyddande medel för att begränsa iskristallbildning, med efterföljande sprickbildning av provet vid flytande kväve kylda temperaturer under högvakuum. Den resulterande brutna ytan replikeras och stabiliseras genom avdunstning av kol och platina från en vinkel som ger ytan tredimensionell detalj rösterna. Denna teknik har visat sig vara särskilt upplysande för utredning av cellmembran och deras inriktningar och har bidragit väsentligt till förståelsen av cellulära formen till relaterad cellfunktion. I denna rapport har vi kartlägga de krav organ och tekniska protokoll för att utförafrys fraktur, tillhörande nomenklatur och egenskaper sprickplan, variationer på det konventionella förfarandet, och kriterier för tolkning av fryst fraktur bilder. Denna teknik har använts i stor omfattning för ultra utredning inom många områden av cellbiologi och håller löftet som en framväxande bildteknik för molekylär, nanoteknik och material naturkunskap.
Introduction
Konceptet och praktisk tillämpning av frysfraktur bearbetning av biologiska prover introducerades av Steere 1 över ett halvt sekel sedan. Den tidiga apparater disponeras disparata delar till en fungerande självständig enhet 1. Den ursprungliga apparaten ändrades och förädlas till kommersiellt tillgängliga instrument för att tillgodose det stora behovet av fjärr manipulation, underhåll av högvakuum, och avdunstningen av kol och metaller för att producera en replik medger granskning av transmissionselektronmikroskop (Figur 1 och Figur 2).
Den typiska instrument består av en hög vakuumkammare med provbord och mikrotom arm som har reglerbara flytande kväve försäljning (Figur 1). Kammaren finns också två elektronkanoner, en för att stabilisera koldioxid avdunstning placerad i en 90 ° vinkel mot provstadiet och en för platinum / kol skuggning på en justerbar vinkel, vanligtvis 15 ° - 45 ° (Figur 2). Ström till enheten används för att driva vakuumpumpen och elektroniska paneler reglerar temperaturjustering och elektron vapenkontroll.
Ursprungligen tänkt som ett sätt att uppnå förbättrad avbildning av virus, frys fraktur vunnit ännu mer popularitet som en teknik för undersökning och analys av cellmembran och deras inriktningar 2, 3. I själva verket har detta förfarande varit integrerad belysa struktur / funktionssamband i celler och vävnader och många av dessa studier står som klassiska bidrag till cell och molekylärbiologi 4-9. Det främsta målet och logisk grund för utvecklingen av frysfraktur teknik var att begränsa artefakter observer på elektron mikroskopisk upplösning härrör från kemisk fixering och bearbetning som används i konventionell biologisk elektronmikroskopi. Här är målet att begränsa kemiskafixering och frysa provet med tillräcklig hastighet och ofta i närvaro av ett frysskyddsmedel för att begränsa iskristallbildning och andra frysning artefakter. På senare tid har denna teknik hittat ett återuppvaknande av intresse från molekylärbiologer och materialvetenskapliga utredare för undersökning av nanopartiklar och nanomaterial.
Frystfraktur och frystetsning bilderna uppvisar en tredimensionell karaktär och ibland misstar för svepelektronmikro. Men fryst fraktur preparat undersöktes med transmissionselektronmikroskop och deras viktiga bidrag till högupplösta morfologiska studier är deras unika representation av strukturen / funktions delar av cellmembran. Frys-fraktur behandling initieras genom frysning celler och vävnader med tillräcklig hastighet för att begränsa is kristallisation och / eller med användning av kryoskyddande medel, såsom glycerol. Proverna sedan splittrade under vakuum och ett replica alstras genom förångning av kol och platina över brottyta. Den ursprungliga exemplaret rötas från kopian som hämtas på en standard EM prov nätet. En annan vanlig feltolkning av frystbrott bilder är att de skildrar cellytor. Men den grundläggande förutsättningen för frys fraktur är att biologiska membran är uppdelade genom membranet genom processen fraktur (Figur 3). Denna process i biologiska membran ger två brottytor, en som visar organisationen av hälften av membranet intill cytoplasman, PF-ansikte, och ett som avslöjar halva bimolekylära broschyr av membranet som ligger i anslutning till den extracellulära milieu, EF-ansikte. Sanna cellytor ingår inte i fryst fraktur bilder utan bara visas när det efterföljande lagt steget frys etsning enligt proceduren fraktur används. För att effektivt etsa tidigare brutna prover för att avslöja yta detail, skall proverna frysas i snabb takt och utan unetchablecryoprotectant. Etsning av vatten från ytan av de brutna provet avslöjar underliggande funktioner åstadkoms genom att placera avkylning mikrotomen armen över provet scenen skapar en temperaturskillnad mellan scenen som håller provet och kylnings mikrotomen arm som gör att vattnet sublimera från ytan. När vatten sublimeras från ytan av de brutna provexemplar under frysetsning manöver, då aspekter av faktiska cellytor, extracellulär matris, cytoskelettala strukturer och molekylära aggregat kan avslöjas med hög upplösning. Således frysfraktur och frys Etch inte utbytbara termer, utan snarare återspeglar en stegvis process den senare som kanske inte är nödvändigt eller önskvärt, beroende på behoven hos den specifika studien.
Efter frysfraktur / frysetsningsförfaranden är de brutna ytorna utsätts för riktade evaporativ rockar av kol och platina i syfte att tillhandahålla stöd och avbildning kontrast till repliken. Den platina / kol imaging avdunstning kan vara enkelriktad eller roterande och åstadkommes genom antingen motstånd eller elektronkanoner. Enkelriktad skuggning från en känd vinkel, vanligtvis 30 ° - 45 °, är användbar för att utföra vissa morfometriska beräkningar. Prover som har utsatts för djup etsning är typiskt rotations skuggad och de resulterande bilderna av dessa prover är fotografiskt återförs för utvärdering.
Den historiska såväl som present mål i frysfraktur / frysetsningstekniken är att begränsa kemisk fixering och bearbetning exemplar artefakter som är associerade med mer konventionella transmissionselektronmikroskopi förfaranden. Dock ger denna teknik en materiell fördel i sin förmåga att ge tredimensionella detaljer och därmed underlätta förvärv av morfometriska data i biologiska, materialvetenskap, och nanotechnology prover. Frystfraktur och fryst etsning förfarandena är komplexa och mångfacetterade, och vissa aspekter av dess tillämpning är anpassade. Denna presentation ger en översikt bild av de viktigaste egenskaperna hos processen och läsaren hänvisas till omfattande publicerade protokoll 10, 11 för att ta itu med detaljerna och anpassa processen för specifika forskningsbehov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Beredning av biologiska prov för Freeze-fraktur / Freeze-Etch
- Använd en konventionell EM fixativ formulering såsom 2% glutaraldehyd + 2% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffert under 1 tim. att utföra primär fixering av biologiska vävnader. OBS: Även om det kan vara önskvärt att frysa vissa typer av prover utan föregående fixering, universella blodburna patogener försiktighetsåtgärder mandat lämplig fixering om exemplaret består av mänsklig vävnad.
- Efter primär fixering, skölj förlagan i samma buffert kompletterad med 0,2 M sackaros i högst 1 timme.
- Överför provexemplaret till en kryoskyddande lösning bestående av 25% glycerol i 0,1 M fosfatbuffert under inte mer än en timme.
2 Frysning och förvaring av prover före Freeze-fraktur
- Välj guld eller koppar prov stubbar av lämplig storlek och form för att provet behandlas (Figur 4
- Med fin grade pincett och / eller liten gauge kanyler positions små fragment av provet på toppen av en metallprov stöta.
- Minska vätskeinnehållet i provet som en klibbig, något limma konsistens genom att ta bort vätska från kanten av stubben med filterpapper.
- För enstaka repliker, använder små mätare kanyler för att skapa en hög av vävnad på stubben. För dubbla repliker, invertera annan påbörjad och placera den exakt över stubben och placera försiktigt på preparatytan och skapar en smörgås (Figur 5A). Tryck inte preparatet fram mellan de två stubbar.
- Fyll två isolerade Dewar fartyg med flytande kväve. OBS: Det första kärlet inrymmer en metall inlägg som innehåller en liten brunn som används för att smälta en liten volym av propangas från en kommersiellt tillgänglig cylinder (figur 5B). Det andra fartyget är en partitionerad lagring / hållkärl för kortly upprätthålla frysta prover under flytande kväve.
- Med hjälp av cylindermunstycke placerat i propan väl öppnar flaskventilen och låta gasen flöda in i brunnen till det fartyg där det kommer att smälta. OBS: VIKTIGT !! Propan är EXPLOSIVE, KAN ORSAKA frysning SKADA PÅ KONTAKT OCH ÄR kvävande. Använd propan endast i en kemisk huva certifierade för sådan användning noga också för att undvika främmande antändningskällor, med hjälp av kläder skyddande mot låga temperaturer, och upprätthålla tillräcklig ventilation.
- Så snabbt som möjligt, plocka upp preparatet Fäste med fin kvalitet pincett och doppa den i flytande gas i det första fartyget i flera sekunder sedan snabbt över till den andra hålla fartyget flytande kväve (Figur 5B).
- När proverna är frysta, lagra i flytande kväve tills de överförs till frysfrakturanläggningen. Överför stubbar till en större förvaring av flytande kväve Dewar behållare för utökadlagring om så önskas, men försiktighet bör vidtas för att inte tillåta stubbar tina.
3 Drift av Freeze-fraktur Instrument och Specimen Processing
- Laddar prover på mässingshållare och in i kammaren
- Ladda guldprov stubbar till ett häfte typ dubbelt replik provhållare eller klämma enhet under flytande kväve och bibehålla det tills de ska placera i provet kammaren (Figur 6).
- När kammaren har uppnått högvakuum (cirka 2 x 10 -6 mbar) och scenen har kylts till temperaturen för flytande kväve, stäng av pumpen, ventilera kammaren, och placera de monterade prov stubbar på preparatbordet så snabbt som möjligt .
- Slå på pumpen, återupprätta högvakuum, och använda elektroniska scenen och arm temperaturkontroller för att justera provtabellen temperaturen till -100 ° C och direkt flytande kväve till mikrotomen armen och bring till temperatur flytande kväve.
- Brottet Processen
- Vid åstadkomma högvakuum, en etapp temperatur på -100 ° C och mikrotom arm vid temperatur flytande kväve, distans öppna dubbel replika provhållare och därmed sprickbildning exemplaren på provmonteringar (frys fracture_movie1.mov).
- I fråga om exemplar som är avsedda för etsning efter fraktur, använda ett rakblad upprätthålls i en klämma på mikrotomen armen att raka (dvs, fraktur) ytan av exemplaren i stället för steg 3.2.1 (frys etch_movie2.mov).
- Om den extra frysetsningssteg skall utföras, placera den kylda mikrotomen armen över de brutna ytor för en till flera minuter. OBS: Denna manöver kommer sublimera (dvs Etch) vatten från brutna ytan. Effekten av denna manöver är att avslöja sanna cellytor, extracellulär matris, och / eller molekylaggregaten genom sublimering av vatten, utöver fracture ansikten som passerar genom det dubbla lipidskiktet av membranen.
- Metal skuggning och replika stöd avdunstning använder elektronkanoner
- Aktivera platina / kol elektron eller motstånd pistol och låta den avdunsta ett tunt skikt (ca 2 nm) av platina / kol över den brutna ytan från en vinkel av 30 ° - 45 °. Detta kräver vanligen cirka 15 till 20 sek.
- Aktivera kolet elektron eller motstånd pistol som i steg 3.3.1 och avdunsta ett tunt lager av kol till brutna provytan från direkt overhead (90 °) för att ge stöd till repliken. Detta kräver vanligen cirka 15 till 20 sek.
- Hämtning av repliker
- Efter avslutad replikering skuggning och kol stabilisering, stäng av vakuumpumpen, ventilera kammaren, och ta bort preparatet montera ur instrumentet.
- Med hjälp av ett par fina klass tång ta bort varje guldprov stump från den dubblareplika häfte / klämma och låt tina i flera sekunder innan försiktigt sänka stöta på en vattenyta på en plats platta (Figur 7). OBS: kol / platina replik innehåller vidhäftande provmaterialet kommer att flyta på vattenytan.
- Manövrera repliker med hjälp av antingen ett fint trådslinga eller ett konventionellt mikroskop galler koppar elektron innehas av fin kvalitet pincett och överföring till en annan plats platta innehållande 5% natriumdikromat i 50% svavelsyra i en till flera timmar. OBS: Detta bad smälter själva biologiskt provmaterial från kopian. Full styrka blekmedel kan ersätta den dikromat / svavelsyralösning.
- När matsmältningen är klar, överföra repliken tillbaka till en ren vattenyta och hämta på en vanlig koppar elektronmikroskopi nätet. (OBS: Repliker kan splittra i mindre bitar under matsmältningen, men även mycket små repliker kan innehålla konkret information och bör vara retroieved och undersöks.) Butiks replik stödraster i kommersiellt tillgängliga rutnät lådor där de kommer att förbli stabila i år med varsam hantering.
4 Ultra Undersökning av Freeze-fraktur / etsnings Repliker
- Se repliker i ett transmissionselektronmikroskop med en accelererande spänning typiskt 50-80 kV.
- Spela relevanta bilder på standard TEM film eller med en digitalkamera med hög upplösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nyckel förutsättningen för frysfrakturbild tolkning är att sprickplan passerar genom membranet av membran som ger två brottytor, kallas av konventionen PF-face (plasma fraktur ansikte) och EF-face (extracellulärt fraktur ansikte) (Figur 3). PF-ansikte är det halv membranets lipiddubbelskikt angränsande till cytoplasman av cellen och EF-ansikte är det halv membranets lipiddubbelskikt angränsande till den extracellulära miljön. Den fryst fraktur tekniken är särskilt användbar för undersökning av membranstruktur och de två ytorna är oftast helt annorlunda med PF-ansikten som befolkas med många membran tillhörande partiklar i motsats till EF-ansikten som innehåller färre. De cytoplasmiska innehåll fryst brutna celler är vanligtvis grova utseende och inte är särskilt avslöjande trots membranbundna organeller såsom kärnor och Golgi kan lätt identifieras. Av särskilt intresse för investigators som använder denna teknik är specialiseringar av membranstruktur som kan tolkas för sin funktion. Dessa inkluderar specifika fördelningar av membranassocierade partiklar, ciliära membran inriktningar, och intercellulära korsningar.
Cilia associerade Konstruktioner
Bosatta i cellmembranet vid basen av varje eukaryot cilium och flagellum är en array med membranassocierade partiklar organiserade i trådar omger skaftet på cilium och kallas ciliära halsbandet (Figur 8) 12-16. Denna struktur uppvisar en viss grad av morfologisk heterogenitet i olika arter och det har spekulerats vara multifunktionell eftersom den verkar före uppkomsten av strålkroppen axeln under ciliogenesis och förblir på plats i den mogna cilium. Den begynnande ciliär halsbandet kommer från aggregering och organisation av membranpartikel arrayer innan tiden för emergence av ciliära axeln under ciliogenesis tyder dess eventuella deltagande i tidiga organisation utvecklas axoneme 14.
Tight junctions och Epithelial Permeabi het
I olika epitel, fryst fraktur studier visar en sofistikerad organisation anastomosering strand och spårkonstruktioner omger apikala aspekten av basolaterala gränser. Denna bandliknande struktur är känd som den snäva korsning eller zonulaoccludens (Figur 9) och tros fungera som en regulator av epitelial permeabilitet för den paracellulära flux 3, 17-20. Tight junctions med några delar har beskrivits som "läckande" medan de med mer komplex organisation beskrivs som "tight". Denna organisation verkar passa funktionen hos epitel till vilka de är associerade. PF-ansikten tight junctions visas som strängar medan EF-ansikten uppvisar complementary spåren.
Gap-junctions och Inter Communication
Gap-junctions (Figur 10) visas i fryst fraktur preparat av olika vävnader och representeras av täta kedjor av partiklar på PF-ansikten och kompletterande gropar på EF-ansikten. Dessa strukturer tros representera membran webbplatser som underlättar kommunikationen mellan. I vävnader där de finns, har demonstrationer av passagen av lågmolekylära fluorescerande färgämnen och kalciumflöden visats 21-24 tyder på att de representerar en fysisk väg för passage av signalmolekyler.
Figur 1 Layout av en kommersiell frys fraktur / etch anläggning. Vid längst till vänster är en tryck Dewar feeding kylvätska kväve med förlagan stadiet och kylning mikrotom arm under kontrollerade förhållanden. På mitten är den enhet med provkammaren och elektroniska kontrollpaneler till höger. Till höger är en ytterligare flytande kväve tank på vilken restgasen användes för att bringa provkammaren till atmosfären.
Figur 2 Freeze-fraktur / etch anläggningen provkammare med dörr öppnas för att avslöja ståndpunkter riktnings syftar elektronkanoner, kyla svepning, och prov posta där exemplaren i innehavare mässing är placerade. Exemplar förs till kammaren genom en port till vänster om kammaren.
ig6highres.jpg "width =" 500 "/> 4 / 51694fig11highres.jpg "width =" 500 "/> 
Figur 4 Två typer av provmonteringar för frys fraktur / etsningsförfaranden. (Vänster) En dubbel replik preparathållarfixtur häfte används för konventionella fryst fraktur åtgärder som vidtas utan etsning. Provet är inklämd mellan två guldprov stubbar och placeras i mässings häftet. Provet fractured genom att öppna häftet under vakuum i provkammaren (Se fryst fract ure_movie1.mov). (Höger) En fäste som används främst för frysetsning. Provet placeras på guld stubbar och låsas in i mässingshållare. Provet fraktur genom försiktig rakning med ett rakblad fast i mikrotomen armen. Denna konfiguration är föredragen för etsningsförfaranden (Se frys etch_movie2.mov). 
Figur 5 Framställning av en frysfraktur provmontering. Provet är inklämd mellan två guld fästen (A) och frystes i en brunn som innehåller flytande kväve kyld propan (förgrunden) med efterföljande transport till en anläggning Dewar innehåller flytande kväve (bakgrund) ( B).
Figur 6 Demonstration av placering av en frusen fryst fraktur prov i den dubbla replika preparathållaren häfte som förberedelse för introduktion till provkammaren i frysfraktur / etch anläggning. 
Figur 7 Hämtning av kopior efter fraktur och skuggning i frysfraktur / etch anläggning. "A" är en ren vattenyta på en plats platta. Repliken flöt från preparat stub överförs till "B" en brunn innehållande en surgjord lösning av natriumdikromat eller full styrka hushållsblekmedel för uppslutning av vävnaden från replika. "C" står för efterföljande ren vattenytor som rensade replika överförs före bEing hämtas på en koppar elektronmikroskopi nätet. 
Figur 8 Cilia relaterade strukturer avslöjas vid frys fraktur. Vita pilarna pekar till specialiserade membranpartikel matriser på luminala gränsen av epitelceller genomgår ciliogenesis. Dessa partikel matriser representerar begynnande ciliära halsband som bor på grunderna för framväxande och mogna flimmerhår (svart pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 9 Fraktur genom epiteliala cellmembran avslöjar ing exempel på PF- och EF-fraktur ansikten. Strängen och spår organisation snäva junctionala komplex är uppenbart och det intercellulära utrymmet markeras med pilar. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 10 En frysfrakturbild av ett gap junction i råttlever. Partiklar är uppenbara på PF-ansikte och kompletterande gropar är uppenbara på EF-ansikte. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11 Immunhistokemisk lokalisering av en connexin använder ett kolloidalt guld märkt antikropp på en frysfraktur förberedelser illustrerar specifik lokalisering på gapet korsningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 12 Ett exempel på snabb nedfrysning med djup etsning och roterande skuggor. Den epitelceller har brutits genom cytoplasman och en PF-ansikte är uppenbara (pilspetsar). Bakom pilspetsar syns en äkta cellytan avslöjas av efterföljande etsning. Please click här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 13 Ett exempel på snabb nedfrysning med djup etsning och roterande skuggning att avslöja molekylkomplex som omfattar ett nötkreatur luftrör ciliaryaxoneme. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under åren efter dess införande och kommersiell tillgänglighet, frys fraktur / etsningsförfaranden allmänt används för undersökningar av biologiskt membran struktur. I själva verket har de bästa utsikterna för en del av de strukturella specialiseringar av membran erhållits i beredningar frysfraktur / etsnings. Dessa studier inte bara bidragit till förståelsen av organisationsstruktur membran utan också insikter i hur struktur och funktion är relaterade.
Tillkomsten av rutinen biologisk elektronmikroskopi lett till en medvetenhet om att kemiska behandlingar med aldehyd fixativ, reaktiva kemikalier och tungmetaller som krävs för att ge differentiell elektrondensitet för biologiska prover själva bidragit till uppkomsten av artefakt. Utvecklingen av frysfraktur tekniken bygger delvis på ett försök att minska bearbetnings artefakt. Ändå har man insett att frys-fraktur/ Etch introducerar sin egen uppsättning av artefakter, en större en av vilka är iskristall skador. Vävnader plunged direkt i flytande erfarenhet kväve en reducerad kylningshastighet på grund av bildandet av ett isolerande skikt av kvävgas som omger provet som resulterar i bildningen av iskristaller som utplåna ultrastrukturella detaljer. Detta problem har lösts med hjälp av kryoskyddsmedel såsom glycerol och genom att frysa vävnaden först i flytande kväve kyld propan. Historiskt sett var dopp frysning utförs i flytande kväve kylda klorfluorkarboner, men dessa material har fasats ur bruk på grund av deras negativa effekter på miljön. Även i de bästa kryoskyddande förhållanden, arten av processen resulterar oundvikligen i en grov, grus som underlag i cytoplasma frakturer; Men frakturer genom membranstrukturer avslöjar väl organiserade funktioner som har specifika plana organisationer i förhållande till sin läggning i cellmembranet. Dessa bilder ärmöjligt endast med hjälp av kryoskyddande medel såsom glycerol som begränsar iskristall skador och glycerol sig i vissa fall också får införa artefaktuella omfördelning av membranassocierade partiklar. Dessutom kan glycerol inte sublimeras från brutna ytan vilket begränsar möjligheten till lyckad etsning. Om den efterföljande etsningsförfarandet är önskvärt, då måste provet vara antingen fryses snabbt på ett sätt som begränsar iskristall skador med användning av antingen flytande helium eller kväve slask och / eller närmade sig genom användning av ett kryoskyddande medel, såsom aceton, som lätt sublimeras från sprucket ytor.
Även Steer ursprungliga rapporten var inriktad på att avbilda virus, det är i membranstruktur som frysfraktur / etch hittade mer omfattande program. Faktum strukturer såsom täta och gap junctions och ciliär membran inriktningar har elegant avslöjas i fryst fraktur preparat. Freeze-fraktur har found betydande verktyg för att uppnå en förståelse för membran differentiering under utveckling 15, 17,24 och membran patologi 25-30. Tidigare rapporter från detta laboratorium har visat mönstret för differentiering av snäva junctionala komplex under utvecklingsvägarna, störningar av ciliära membranstrukturer i samband med experimentell smittämnet exponering och nedbrytning av snäva junctionala komplex i epitelceller i luftvägarna i samband med luftföroreningar och tobaksrök exponering på försöksdjur och människor.
Tekniska Förlängningar av Freeze-Fracture / Freeze-Etch Tillvägagångssätt
Den släckning metod som använder flytande propan att frysa proverna som beskrivs här är kanske den vanligaste metoden för att frysa biologiska prover för konventionell frys fraktur. Dock måste andra metoder för frysning disponeras där frys etsning skall utförared. Eftersom glycerol är en icke-etchablecryoprotectant genom prover för frys etsning skall frysas på ett sätt som begränsar iskristallbildning. Detta kan åstadkommas genom användning av en etchablecryoprotectant såsom aceton och / eller genom att frysa förlagan montera mot en metallyta kyls med flytande helium eller flytande kväve slask. Snabb frysning utan kryoskyddsmedel också kan åstadkommas med användning av sprutfrysning eller högtrycks frysning i flytande propån.
Nya ansträngningar för att ytterligare relatera struktur och funktion med hjälp av frysfraktur teknik har tillägnat denna teknik i samförstånd med immunhistokemisk märkning 31, 32. Här kan antikroppar mot specifika antigener på ett effektivt och noggrant lokaliserad till membranställen (Figur 11).
Medan frys fraktur med enkelriktad skuggning är den i särklass mest använda protokollet, kommer vissa experimentell design kräver snabb frysning med little eller begränsad kryoskydd, åtföljd av etsning av den brutna ytan för att avslöja sanna cellytor, extracellulär matris, och / eller makromolekylära komplex, och roterande skuggning för att förläna kontrast 16 (Figur 12 och Figur 13).
Det finns ett växande intresse för tillämpningar av frys fraktur i nanoteknik, materialvetenskap, och använda denna teknik som en avbildning verktyg i molekylärbiologi. I själva verket kan nanomaterial på många sätt vara konsekvent i sin organisation med virala strukturer för vilka frys-fraktur ursprungligen tänkt som ett medel för avbildning. Dessutom tillverkas liposomer, strukturer liknande i formen till biologiska membran, är i stor utsträckning studerats för målinriktad tillförsel av farmaceutiska medel och riktad genterapi. Eftersom deras organisation är i huvudsak membran som kan frysfraktur bearbetning har stor användbarhet i att producera avslöjande bilder som en komponent i utveckping dessa terapier 33.
Sammanfattningsvis har fryst fraktur teknik varit av historisk betydelse i karaktärisera organisation och funktion i cellmembranen. Dock är frysfraktur hitta nya områden för användbarhet i samordning med molekylärbiologi och nanoteknologi och nästan säkert kommer att bidra till framsteg inom dessa snabbt framväxande fält.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| Standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| Sodium dichromate | various suppliers | ||
| Sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Propane | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
References
- Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
- Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
- Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
- Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
- Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of the outer dynein arm. J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).
- Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
- Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
- Chandler, D. E., Sharp, W. P. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kuo, J. ohn 1117, 95-132 (2014).
- Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).
- Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
- Rohatgi, R., Snell, W. J. The ciliary membrane. CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).
- Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
- Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
- Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
- Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
- Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
- Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
- Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
- Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
- Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
- Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
- Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).
