Vortex asistida Microscale Electroporador para entrega secuencial Molecular
Summary
Una plataforma de electroporación asistida vórtice de microfluidos fue desarrollado para la entrega secuencial de múltiples moléculas en poblaciones de células idénticas con control de la dosificación precisa e independiente. Tamaño basado electroporación anterior etapa de purificación de células diana del sistema ayudado a mejorar la eficiencia de la entrega molecular y la viabilidad celular procesada.
Abstract
La electroporación ha recibido una creciente atención en los últimos años, debido a que es una técnica muy poderosa para la introducción de sondas moleculares físicamente exógenos no permeantes en las células. Este trabajo presenta una plataforma de electroporación de microfluidos capaz de realizar la entrega molécula múltiple para células de mamífero con control de parámetros precisos y molecular-dependiente. La capacidad del sistema para aislar células con una distribución de tamaño uniforme permite una menor variación en la eficiencia de la electroporación por intensidad de campo eléctrico dado; por lo tanto, una mayor viabilidad de la muestra. Además, su función de visualización de procesos permite la observación del proceso de absorción molecular fluorescente en tiempo real, lo que permite ajustes de parámetros de entrega moleculares rápidas in situ para la mejora de la eficiencia. Para mostrar las enormes capacidades de la plataforma informado, macromoléculas con diferentes tamaños y cargas eléctricas (por ejemplo, dextrano con un PM de 3.000 y 70.000 Da) fueronentregado a las células de cáncer de mama metastásico con altas eficiencias de entrega (> 70%) para todas las moléculas ensayadas. La plataforma desarrollada ha demostrado su potencial de uso en la expansión de los campos de estudio en el chip técnicas de electroporación pueden ser beneficiosos.
Introduction
En los últimos años, el uso de pulsos eléctricos para facilitar la entrega citosólica de moléculas extracelulares se ha convertido en un medio atractivo para la manipulación de células de mamífero. 1 Este proceso, también conocido como electroporación, permeabiliza reversiblemente la membrana celular, lo que permite la membrana inherentemente moléculas impermeables para acceder al medio intracelular de las células. Debido a que prácticamente cualquier molécula se puede introducir en el citosol a través de poros creados temporales en la membrana de cualquier tipo de células por medio de electroporación, la técnica ha sido reportado como siendo más reproducible, de aplicación universal, y más eficiente que otros métodos, incluyendo mediada por virus, química y los enfoques ópticos. 2-3 Esta técnica se ha utilizado para introducir moléculas fluorescentes, 4 drogas 5 y ácidos nucleicos 6-7 manteniendo células viables e intacto. Teniendo en cuenta estos beneficios, electroporación ha sido adoptado como un trabajo comúnAtory técnica de ADN para la transfección, in vivo la terapia génica 8 y estudios de vacunación celular. Es, sin embargo, sigue siendo difícil para los sistemas convencionales de electroporación para lograr simultáneamente eficiencia práctica y la viabilidad para las muestras con gran heterogeneidad en el tamaño debido a que la intensidad de campo eléctrico requerida para la electroporación éxito se correlaciona estrechamente con el diámetro de la célula. Por otra parte, esos sistemas no permiten un control preciso de los múltiples cantidades moleculares entregado debido a la confianza en el proceso de entrega molecular estocástico mayor. 9 A fin de abordar estas cuestiones, muchos grupos han desarrollado plataformas de electroporación de microfluidos, que ofrece la ventaja de voltajes inferiores poración, mejor eficiencia de transfección, una gran reducción de la mortalidad celular, y la capacidad de ofrecer múltiples moléculas. fueron posibles 10-13 Estas ventajas debido a las pequeñas dimensiones de los sistemas de electroporación microescala cuyo electrodo de tonolongitudes son sub-milímetros, disminuyendo drásticamente tensiones requeridas para la entrega exitosa. Además, estos sistemas de electroporación microescala pueden lograr una distribución de campo eléctrico uniforme y rápidamente disipar el calor generado, produciendo mortalidad celular reducida al tiempo que mejora la eficiencia de la entrega. La utilización de materiales transparentes para estos microchips adicionales permite la observación in situ del proceso de electroporación para las modificaciones de parámetros rápidas. 2,12 Sin embargo, el control de la dosificación precisa y el control de parámetros-molecular y celular dependiente, requerido para la investigación y aplicaciones terapéuticas, 6 emergente, 14-16 todavía siguen sin resolverse.
Este trabajo presenta un sistema de electroporación de microfluidos vórtice asistida, capaz de entregar múltiples moléculas secuencialmente en una población idéntica pre-seleccionado de las células diana. Las células con distribución de tamaño uniforme son aislados antes de la electroporación utilizando si se informó anteriormentemecanismo-ze selectiva de captura. 17-18 Al tener una distribución uniforme del tamaño, menor variación en la eficiencia de la electroporación y la mayor viabilidad por determinada intensidad de campo eléctrico se lograron. 19 Por otra parte, se agitaba continuamente células atrapadas utilizando vórtices microescala permitido para la entrega uniforme de moléculas a través de la citosol entero, de acuerdo con los resultados previamente reportados usando otra plataforma electroporación vórtice asistida. 20 Para demostrar que este sistema sería aplicable a una amplia gama de moléculas comúnmente utilizados en aplicaciones biológicas, macromoléculas con una amplia gama de pesos moleculares fueron entregados a metastásico de células de cáncer de mama. Además, con la ayuda de la monitorización de procesos en tiempo real, este trabajo proporciona más evidencias de poner fin al largo debate permanente sobre el mecanismo de entrega molecular durante electrporation, siendo predominantemente mediada por electroforesis versus difusión mediada. 14 </sup> A diferencia de otros sistemas de electroporación, esta plataforma proporciona de forma única las ventajas combinadas de entrega precisa multi-molécula, de alta eficiencia en la entrega molecular, la mortalidad celular mínima, un amplio abanico de tamaño y cargos de moléculas entregados, así como la visualización en tiempo real de la electroporación proceso. Dadas estas capacidades, el sistema de electroporación desarrollado tiene potencial práctico como una herramienta versátil para los estudios de reprogramación celular, aplicaciones de suministro de drogas 6,14,21-22 10,19 y aplicaciones que requieren de la comprensión en profundidad de los mecanismos de entrega de electroporación moleculares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con la nueva plataforma de electroporación paralelizado, mejora de 10 veces en el rendimiento y la eficiencia de la prestación de múltiples molécula se logró, además de todas las ventajas que el sistema de una sola cámara previamente desarrollado proporciona. 18 méritos Anteriormente disponibles incluyen (i) antes de la purificación de dirigirse a las células con una distribución uniforme del tamaño para la mejora de la viabilidad, (ii) control de la dosificación precisa y molecular individual, y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el programa Rowland junior becario. Los autores desean expresar su agradecimiento a los científicos y el personal del Instituto Rowland en Harvard: Chris Stokes por su ayuda en el desarrollo de la, la configuración de control de presión asistida por computadora hecha a la medida, Diane Schaak, Ph.D. por su aportación para la manipulación de la muestra biológica, Winfield Hill por el desarrollo de la instalación eléctrica, Alavaro Sánchez, Ph.D. para conceder el acceso a la citómetro de flujo, Scott Bevis, Kenny Spencer y Don Rogers para el mecanizado de componentes de plomería mecánicos necesarios para la configuración de presión. Maestros de microfluidos fueron fabricados en el Centro de Sistemas de nanoescala (CNS) de la Universidad de Harvard.
Materials
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| high-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32"ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluiminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 mL centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
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