Abstract
Kappeklædte vira udnytter membranglycoproteiner på deres overflade for at mægle indrejse i værtsceller. Tre-dimensionel strukturel analyse af disse glycoprotein 'pigge' ofte er teknisk udfordrende, men vigtig for forståelsen af viral patogenese og i udviklingen af lægemidler. Her er en protokol præsenteres for viral spike struktur beslutsomhed gennem beregningsmæssige gennemsnit af elektron kryo-tomografi data. Electron cryo-tomografi er en teknik i elektronmikroskopi anvendes til at udlede tredimensionale tomografiske volumen rekonstruktioner eller tomogrammer, af pleomorfe biologiske prøver såsom membran virus i en nær-indfødt, frosne hydreret tilstand. Disse tomogrammer afsløre strukturer af interesse i tre dimensioner, men ved lav opløsning. Computational gennemsnitsberegning af sub-mængder, eller sub-tomogrammer, er nødvendig for at opnå højere opløsning detalje gentage strukturelle motiver, såsom virale glycoprotein spikes. En detaljeret beregningsmæssige tilgang til Aligning og gennemsnit sub-tomogrammer hjælp af Jsubtomo softwarepakken er skitseret. Denne fremgangsmåde muliggør visualisering af strukturen af virale glycoprotein pigge til en opløsning i området 20-40 Å og undersøgelse af studiet af højere ordens spike-til-spids interaktioner på virion membran. Typiske resultater er præsenteret for Bunyamwera virus, en kappevirus fra familien Bunyaviridae. Denne familie er en strukturelt forskelligartet gruppe af patogener udgør en trussel for menneskers og dyrs sundhed.
Introduction
Electron cryo-tomografi er en elektron kryo-mikroskopi billeddannelse teknik tillader beregningen af en tredimensional (3D) genopbygning af komplekse biologiske prøver. Egnede prøver spænder fra oprensede makromolekylære komplekser 1, filamenter 2, coatede vesikler 3 og pleomorfe membran vira 4 til hele prokaryote celler 5 og endda tynde områder af hele eukaryote celler 6. Efter indsamling af data af en tilt-serie, 3D tomografiske mængder, eller tomogrammer, kan beregnes ved hjælp af flere etablerede softwarepakker, herunder Bsoft 7 og israelske forsvarsminister 8.
To aspekter, der er forbundet med studiet af biologiske prøver ved elektronmikroskopi kryo-tomografi grænse biologiske fortolkning af de tilsvarende tomografiske mængder. Først på grund af den begrænsede elektron dosis, der kan anvendes til biologiske materialer, før indførelse af betydelig skade stråling signal-til-støj-forhold i tomografiske data er typisk meget lav. For det andet, som et resultat af begrænset prøve tilt geometri under dataindsamlingen, nogle visninger af objektet forbliver fraværende, hvilket fører til en såkaldt "manglende kile 'artefakt i tomografisk volumen. Imidlertid kan begge disse begrænsninger kan overvindes, hvis tomografiske volumen indeholder gentage identiske strukturer, såsom makromolekylære komplekser, der kan være held midlede 9-12.
Før gennemsnit strukturer fra tomogram rekonstruktioner, skal genstande af interesse findes og afstemt med samme orientering. Lokalisering af sådanne strukturer kan opnås ved krydskorrelation af en skabelon struktur i tomografiske volumen ved hjælp af en fremgangsmåde, der ofte omtales som template matching 13. Den skabelon, der anvendes i dette matchende proces kan udledes elektron kryo-mikroskopi eller elektronmikroskopi kryo-tomografi kombineret med 3D-rekonstruktion, eller det kan være en densitet kort simuleret fraen atomare struktur. Adskillige beregningsmæssige pakker er blevet udviklet til at udføre disse opgaver 11.
Midling glycoproteinkomponenter pigge af membran vira, såsom HIV-1, har været en særdeles vellykket strategi for at studere deres struktur 14-16. En forståelse af strukturen er integreret for at afsløre både det molekylære grundlag for virus-værts interaktioner og vejlede antivirale og vaccine design udvikling. Mens makromolekylære krystallografi er den teknik valg for høj opløsning (normalt bedre end 4 Å) strukturel analyse af individuelle virale glycoproteiner og deres komplekser, X-ray strukturer af denne metode af proteiner isoleret fra naturlige membranøs miljø virionet . Således vigtige detaljer såsom højere orden arkitektur af virale glycoproteiner, i forbindelse med virionet fortsat mangler. På den anden side, elektronstråler kryo-mikroskopi og enkelt partikel genopbygningaf hele kappeklædte vira er begrænset til virioner med tyvefladet symmetri 17,18. Electron cryotomography kombineret med sub-volumen justering har således vist sig som en supplerende teknik tillader studiet af glycoprotein pigge af uregelmæssigt formede, pleomorfe vira in situ.
Vi har udviklet software opkaldt Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) til påvisning, justering og gennemsnitsberegning af tomografiske sub-mængder. Jsubtomo er blevet anvendt i strukturen bestemmelse af en række cellulære og virale strukturer 19-26. Her skitserer vi en detaljeret protokol, som gør det muligt bestemmelsen viral-overflade spike strukturer. For at omgå overdreven forfinelse af midlede strukturer ved at korrelere støj, er den "gyldne standard 'raffinement, der er vedtaget 10,27. Endelig strategier til visualisering og fortolkning af typiske resultater diskuteres.
Protocol
En detaljeret protokol for beregningsmæssige justering og efterfølgende gennemsnitsberegning af virale glycoprotein pigge er skitseret. Protokollen følger arbejdsgangen illustreret i figur 1 og kombinerer en automatiseret søgning efter spikes anvender oprindelige skabelon strukturer og en guld-standard struktur raffinement.
Input data for denne protokol er et sæt af tomografiske rekonstruktioner af virionerne. Én tomogram indeholder en eller flere virioner. I første omgang er en lille delmængde af pigge manuelt plukkes og bruges til gennemsnittet og forfine to uafhængige modeller. Disse modeller bruges til automatisk at finde pigge på alle virionerne. Endelig er to uafhængige raffinementer køre og de resulterende gennemsnit sammenlignes og kombineres til at producere den endelige struktur.
Udbygningen fremgangsmåde påvises ved hjælp af programmer fra Jsubtomo pakken. Anvendes programmer fra Bsoft pakke 28 for almindelig billedbehandling processing opgaver og molekylære grafik pakke UCSF Chimera 29 anvendes til at visualisere resultaterne. Navnene på de enkelte programmer er angivet i kursiv og filformater er betegnet med store filtypenavne.
Figur 1:.. Generel strategi til bestemmelse af strukturer af glycoprotein spike komplekser fra pleomorfe membran virus Tallene svarer til forskellige sektioner i protokollen Klik her for at se en større version af dette tal.
1. Udpakning Virus Sub-mængder fra Fuld størrelse tomogrammer
- Pick viruspartikler manuelt i tomogrammer.
- Åbn en tomogram fil i bshow. Definer centrum koordinat for en virus partikle ved hjælp af partikel-picking værktøj. Gentag dette trin, indtil alle virioner er blevet behandlet. Gem virus koordinater i et STAR-fil.
- Gentag trin 1.1.1, indtil alle tomogrammer er blevet behandlet. Notér virionen diameter i pixel.
BEMÆRK: Hvis spikes er svære at se i tomogrammer bruge bfilter til low-pass filtrere tomogrammer til 80-beslutning (parameteren "-bandpass 80,10000").
- Kør jsubtomo.py i ekstrakt (parameter "--mode ekstrakt") for at udtrække virion sub-mængder til de enkelte volumen filer. Brug STAR gemt i trin 1.1.1 som input filer.
- Giv en størrelse (parameteren "--size") ~ 25% større end den største virionen i datasættet. Eg, hvis virionen er ~ 200 pixels i diameter, bruger størrelse 250 x 250 x 250 pixels.
- Output filer af virion mængder vil være i MAP-format. Desuden skaber en ledsagende STAR-fil for hver virion volumen (Parameter "--output").
- Normalisere virion mængder i bimg (parameteren "-rescale 0,1").
2. generation af to uafhængige første modeller
- Pick en delmængde af pigge i sub-volumen virion.
- Åbn en virion delvolumen MAP fil i bshow. Definer centrum koordinat for et spyd ved hjælp af partikel-picking værktøj, der er tilgængelig via Værktøjskasse vinduet. Gentag dette trin, indtil alle klart adskilte spikes er blevet behandlet. Gem spike koordinater i et STAR-fil.
- Gentag om nødvendigt trin 2.1.1 til andre virioner indtil cirka 200 glycoprotein pigge er blevet behandlet. Bemærk spike dimensioner i pixels.
BEMÆRK: ~ 200 spikes er en grov rettesnor og kan kræves mere for nogle programmer. Hvis det er muligt, har til formål at samle spidser i forskellige orienteringer. Undgå at plukke de allerbedste udsigt.
- Tildel en indledende udsigt vektor piggene ved at køre jviews.py. Brug STAR filer genereret i trin 2.1.1 som input filer.
BEMÆRK: Denne visning vektor tilnærmer retning af spyd med henvisning til virionen.- Brug den centrale koordinere at tildele de synspunkter for en sfærisk virion. For eksempel, hvis virionet er centreret (efter trin 1.2) i en kasse med en størrelse på 250 x 250 x 250 pixels, centrale koordinat er 125125125 pixel (indstilling "--Radial 125125125").
- At tildele visninger for en filamentøs virion, åbne hver virion delvolumen i bshow ved hjælp af STAR-fil defineret i trin 2.1.1 som input fil. Definer de to endepunkter af glødetråden hjælp glødetråden dirkeværktøj og gem STAR-filen. Gentag dette trin, indtil alle STAR-filer er blevet opdateret og køre jviews.py hjælp af de opdaterede STAR-filer som input filer (--option segment).
- Generer en reel plads maske hjælp jsubtomo_create_mask.py. Sørg for, at den virkelige rum masken er af de samme Dimensioner, som vil blive anvendt til den midlede struktur (se 2.6.2) og er stor nok til at indeholde både spidsen og et plaster på den underliggende membran.
- Generer en gensidig rum maske hjælp jsubtomo_create_wedgemask.py. Den gensidige rum maske bruges til at udelukke regionerne i den "manglende kile-regionen som følge af en enkelt akse indsamlingen tomografisk data. Sørg for, at det er af samme dimensioner, som vil blive anvendt til det gennemsnit struktur (se 2.6.2).
- Generer et udvalg fil (SEL fil) definerer virioner tilhører sæt "1" og "2" ved hjælp jsubtomo_evenodd.py og stjernen filer genereret i trin 2.2.
- Generer to oprindelige gennemsnit hjælp jsubtomo_create_averages.py.
- Brug SEL fil genereret i trin 2.5 som input fil.
- Giv en størrelse (parameteren "--size") mindst 32 pixels større end den største dimension af spyd. Eg, hvis spidsen er ~ 40 pixels lang, bruge størrelse 72 x 72 x 72 pixels.
- Påfør en høj symmetri (f.eks C100) på gennemsnittene (parameteren "--symmetry C100"), at tilnærme en cylindrisk gennemsnit omkring den lange akse af spyddet. Brug symmetrization at reducere støj i de indledende gennemsnit.
- Giv et entydigt navn til output-filer i projektet (parameteren "--suffix").
- Brug det virkelige rum maske genereret i trin 2.3 til at maskere væk baggrund (parameteren "--mask"). Brug reciprokke rum masken frembragt i trin 2.4 til at redegøre for signaltab indført ved tilstedeværelsen af en manglende kile (parameteren "--Mask").
3. Guld-standard Iterativ Tilpasning og gennemsnit af de to oprindelige spike modeller
Iterativt tilpasse og gennemsnittet af de to første modeller genereret i afsnit 2 med jsubtomo_iterate_gold.py.
- Stage I. Målet med denne fase er at forfineretning af den opfattelse vektor. Indfilen er SEL fil genereret i trin 2.5.
- Brug en 8 graders kantet prøvetagning (parameteren "--angles 8,8,8").
- Tillad 16-graders ændringer i retning af piggen vis vektor (parameteren "--thetaphilimit 16"), men holde vinklen omkring piggen længdeakse fast (parameteren "--alphalimit 0").
- Tillad små translationelle forskydninger (f.eks 5 pixel) for at tage højde for unøjagtigheder i manuel plukning af spikes (parameteren "--shiftlimit 5").
- Påfør en høj symmetri (f.eks C100) på gennemsnittene (parameteren "--symmetry C100"), at tilnærme en cylindrisk gennemsnit omkring den lange akse af spyddet.
BEMÆRK: Symmetrization anvendes til at reducere støj i gennemsnit. - Brug det virkelige rum maske og gensidig rum maske genereret i trin 2.3 og 2.4 for at maskere væk omgivende pigge og redegøre for den manglende kile (parametre "--mspørge "og" --Mask ", henholdsvis).
- Brug de to MAP filer genereret i 2.6 (forsynet med tags "selv" og "ulige" i filnavnet) som skabeloner (parametrene "--Template1" og "--Template2", henholdsvis).
- Påfør et low pass filter ved 50-beslutning (parameteren "--resolution") for at forhindre tilpasning bias.
- Påfør en bin faktor 2 for at fremskynde forfinelse (parameteren "--bin 2").
- Kør 5 gentagelser af tilpasning og gennemsnit (parametre "--firstiter 1 --lastiter 5").
- Fase II. Målet med denne fase er at forfine vinklen omkring visningen vektor. Indfilen er output SEL filen fra trin 3.1.9.
- Mål de nøjagtige dimensioner af spyddet ved at åbne lavpasfiltrerede MAP fil genereret i den sidste iteration i trin 3.1.9 (angivet med tag "_lp" i filnavnet) i bshow. Generer en ny reelplads maske ligeledes til trin 2.3, der definerer spidsen, men udelukker de fleste af membranen og tilstødende pigge.
BEMÆRK: Den optimale størrelse af masken afhænger af størrelsen og funktioner i spidsen. - Brug 8 graders kantet prøvetagning (parameteren "--angles 8,8,8"), som før.
- Tillad 180-graders ændringer i vinkel omkring spike udsigt vektor (parameteren "- alphalimit 180"), men holde theta og phi vinkler faste (parameteren "--thetaphilimit 0").
- Lad ikke nogen translationelle forskydninger (parameteren "--shiftlimit 0").
- Må ikke anvendes nogen symmetri på gennemsnittene (udelad parameteren "--symmetry").
- Brug reciprokke rum masken frembragt i trin 2.4 til at redegøre for de manglende kile.
- Brug de to MAP filer genereret i det sidste iteration af trin 3.1.9 uden symmetri (angivet med tags "even_nosym" og "odd_nosym" i filnavnet) som skabeloner (parametre R20 - Skabelon1 "og" --Template2 ", henholdsvis).
- Påfør et low pass filter ved 50-beslutning (parameteren "--resolution"), i den første iteration for at forhindre tilpasning bias. Juster filterparametrene i de efterfølgende iterationer automatisk (parameteren "--adaptivefilter") baseret på guld-standard Fourier Shell korrelation (FSC) mellem de to uafhængige gennemsnit. Brug 0.143-kriterium (parameteren "--fsccrit 0,143"). Lad ikke raffinement forbi den første nul af funktionen kontrast overførsel (CTF) (parameter "--minhires"), medmindre CTF korrektion er blevet anvendt på de tomogrammer.
- Kør 5-10 gentagelser af tilpasning og gennemsnit (f.eks parametre "--firstiter 6 --lastiter 15"). Overvåg ændringer i rapporteret opløsning. Når der ikke er observeret markante ændringer, kan processen stoppes.
- Mål de nøjagtige dimensioner af spyddet ved at åbne lavpasfiltrerede MAP fil genereret i den sidste iteration i trin 3.1.9 (angivet med tag "_lp" i filnavnet) i bshow. Generer en ny reelplads maske ligeledes til trin 2.3, der definerer spidsen, men udelukker de fleste af membranen og tilstødende pigge.
- Vurdere graden af symmetri i strukturen af examining det resulterende lavpasfiltrerede MAP fil (betegnet ved tag "_lp" i filnavnet) i kimære. Hvis f.eks piggen er et trimert kompleks, skal 3-fold symmetri være indlysende.
- Trin III. Målet med denne fase er at raffinere den vinkel omkring det synspunkt vektor videre med korrekt symmetri. Indfilen er output SEL filen fra trin 3.2.9. Parametrene er de samme som i trin 3.2 med nogle få undtagelser:
- Tillad nødvendige ændringer i vinklen omkring spyddet udsigt vektor. For eksempel, hvis struktur har 3-fold symmetri tillade ændringer i 60 grader i alfavinklen (parameter "--alphalimit 60").
- Anvend den korrekte symmetri (f.eks C3) på gennemsnittene (parameter --symmetry c3 ").
- Brug de to MAP filer genereret i den sidste iteration i trin 3.2.9 (angivet med tags "selv" og "ulige" i filnavnet) som input skabelonfiler (parametrene "--Template1" og --Template2).
- Kør 5-10 gentagelser af tilpasning og gennemsnit (f.eks parametre "--firstiter 16 --lastiter 25"). Overvåg ændringer i rapporteret opløsning. Når der ikke er observeret markante ændringer, kan processen stoppes.
- Stage IV. Målet med denne fase er at præcist at forfine alle tre vinkler samtidig. Indfilen er output SEL filen fra trin 3.4.4. Parametrene er de samme som i trin 3.4 med nogle få undtagelser:
- Tillad 8-graders ændringer i vinklen omkring piggen vis vektor (parameteren "- alphalimit 8") og 8-graders ændringer i retning af piggen vis vektor (parameter "--thetaphilimit 8"). Forfine retningslinjerne til 4 graders nøjagtighed (parametrene "--angles 8,8,8 --iterate 2").
- Tillad små forskydninger (f.eks 5 pixel) for at tage højde for unøjagtigheder i tidligere opretningstrinene (parameteren "--shiftlimit 5").
- USE to MAP filer genereret i den sidste iteration i trin 3.4.4 (forsynet med tags "selv" og "ulige" i filnavnet) som input skabelonfiler (parametrene "--Template1" og --Template2).
- Kør 5-10 gentagelser af tilpasning og gennemsnit (f.eks parametre "--firstiter 26 --lastiter 35"). Overvåg ændringer i rapporteret opløsning. Når der ikke er observeret markante ændringer, kan processen stoppes.
4. generation og justering af frø til Virus overflade til Skabelon Matching
- Generer frø placeret jævnt på virusoverfladen til skabelon matching og tildele en indledende udsigt vektor til frøene ved at køre jviews.py. Brug STAR filer genereret i trin 1.2.2 som input filer. Generer ca. 1,5 gange flere frø end det forventede antal pigge.
BEMÆRK: Denne visning vektor tilnærmer retning af spyd nærmest hvert kernepunkt.- For at generere jævnt fordelt frø på en nogenlunde sfærisk virion (parameteren "--Even") giver radius (parameteren "--radius") kantet adskillelse (fx 20 grader) af frø (parameteren "--angle 20" ) og det centrale koordinat virionet. Hvis f.eks virionen er centreret (efter trin 1.2) i en kasse med en størrelse på 250 x 250 x 250 pixels, den centrale koordinat er 125.125.125 pixel (option "--origin 125125125") .
- For at generere jævnt fordelt frø på en filamentøs partikel, skal du bruge parameteren "--Filament", og angive både radius og spiralformede symmetri parametre (rise og twist).
BEMÆRK: spiralformede symmetri parametre anvendes her kun som en bekvem måde at definere jævnt fordelte frø holdninger, og de behøver ikke at afspejle den faktiske ordning af pigge på glødetråd.
- Generere to uafhængige gennemsnit af virus overflade som explained i afsnit 2.
- Generer en SEL fil definerer virioner tilhører sæt "1" og "2" ved hjælp jsubtomo_evenodd.py og stjernen filer genereret i trin 4.1.
BEMÆRK: For at sikre uafhængigheden af datasæt, en tidligere tildeling af virionerne i grupper "1" og "2", skal forblive den samme.
- Generer en SEL fil definerer virioner tilhører sæt "1" og "2" ved hjælp jsubtomo_evenodd.py og stjernen filer genereret i trin 4.1.
- Tilpas position frøene.
- Følg instruktionerne i trin 3.1, medmindre andet er angivet. Brug SEL fil genereret i trin 4.2.1 som input fil.
- Lad frøene kun at skifte langs normalen til membranen (parameteren "--zshiftlimit"). Juster den tilladte mængde af skift afhængig af hvor meget virionerne afvige fra ideel sfærisk geometri (fx parameteren --zshiftlimit 25 ").
- Brug de to MAP filer genereret i trin 4.2 (forsynet med tags "selv" og "ulige" i filnavnet) som input skabelonfiler (parametre "--TemPlate1 "og --Template2).
- Brug en unik endelse for at undgå at overskrive de originale input STAR-filer (f.eks parameteren "--suffix _seeds").
- Brug Binning på 4 for at fremskynde beregningen (parameteren "--bin 4") og en low-pass filter op (f.eks parameteren "--resolution 50").
- Generer Chimera markør filer (CMM) af det raffinerede frø STAR filer ved hjælp af (parameteren "--cmm") jviews.py. Undersøg frøene ved at åbne CMM filer (og de tilhørende virion MAP-filer) i kimære. Sørg for, at de raffinerede frø er justeret korrekt i forhold til virus membran.
BEMÆRK: Forskellige farver kan anvendes til at differentiere separate sæt af markører (parameteren "--color"). Alternativt de raffinerede markører kan farves på grundlag af deres kors korrelationskoefficient (fx parameteren "--fomcolor 0.1,0.3").
5. Guld-stativARD Iterativ Tilpasning og Midling af Spike Struktur
Find automatisk alle spidser i virion sub-volumen ved hjælp af lokale skabelon matching omkring de raffinerede frø og tilpasse og gennemsnittet i beliggende spikes. Brug gennemsnit genereret fra en delmængde af manuelt plukkede pigge som indledende skabeloner.
- Udfør lokal skabelon matching omkring frøene til gennemsnittet alle de pigge ved hjælp af programmet jsubtomo_iterate_gold.py. Følg instruktionerne i trin 3.5, medmindre andet er angivet.
- Indfilen er SEL filen for de raffinerede frø genereret i trin 4.3.
- Brug en tilstrækkelig stor grænse for visningen vektor vinkel. Eg, hvis frø blev genereret hver 20 grader (trin 4.1), skal du bruge en vinkel lidt større end halvdelen af denne værdi (parameter "--thetaphilimit 12"). Tillad nødvendige ændringer i vinklen omkring spyddet udsigt vektor.
- Tillad frø til at flytte i planet af membranen (parameter"--xyshiftlimit"). Eg, hvis frø-til-frø afstand er 25 pixel, skal du bruge alt skift lidt mere end halvdelen af dette (f.eks parametrene "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
Der kan kræves ekstra translationelle forskydninger Hvis kortet filer genereret i trin 3.5, der er centreret ved en anden afstand fra virion midten end frøene: NOTE. - Brug de to MAP filer genereret i trin 3.5 (forsynet med tags "selv" og "ulige" i filnavnet) som input skabelonfiler (parametrene "--Template1" og --Template2).
- Brug den aktuelle opløsning af MAP filer genereret i trin 3.5 (parameter --resolution).
- Kør 5-10 gentagelser af skabelon matching, tilpasning og gennemsnitsberegning (f.eks parametrene "--firstiter 1 --lastiter 10"). Overvåg ændringer i rapporteret opløsning. Når der ikke er observeret markante ændringer, kan processen stoppes.
- Efter hver iterationUdelukke overlappende hits. Eg, hvis bredden af piggen er 30 pixel, udelukke hits, der er tættere end 30 pixel til andre hits (parameter "--mindist 30").
- Udeluk hits med en lav krydskorrelation koefficient. For eksempel omfatter de bedste 75% pigge for hver virion (parameteren "--topp 75").
NOTE: Hits med lav krydskorrelation koefficient sandsynligvis repræsentere falske positive hits.
6. Visualisering af resultater
- Åbn den raffinerede struktur af spyd i kimære til visualisering og montering af atomare strukturer.
- Brug lavpasfiltrerede MAP fil (betegnet ved tag "LP") skabte i den endelige iteration i trin 5.1.6 som input fil.
- Brug opløsningen er angivet i trin 5.1.6 til krydskorrelation baseret montering i kimære "Fit i kort" værktøj.
- Opret en sammensat model af virioN Brug jsubtomo_create_model.py.
- Brug lavpasfiltrerede MAP fil (betegnet ved tag "LP") skabte i den endelige iteration i trin 5.1.6 som input MAP fil til (parameteren "--Template").
- Brug en STAR fil genereret i den endelige iteration i trin 5.1.6 som input STAR-fil.
- Brug masken fil genereret i trin 3.2.1 at tage højde for overlappende tætheder i det sammensatte model (parameteren "--mask").
- Angiv størrelsen af virion KORT fil til at generere en sammensat model af samme størrelse (parameteren "--size").
- Åbn den sammensatte model til visualisering i kimære.
Representative Results
Vi demonstrere anvendelsen af sub-tomogram gennemsnitsberegning arbejdsgang skitseret ovenfor for kappeglycoproteinet kompleks af Bunyamwera virus (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) ved hjælp af en tidligere offentliggjort datasæt 24. Parametre Dataindsamling og forfining er anført i tabel 1. En repræsentant tomogram er vist i figur 2.
| Parameter (enhed) | Værdi |
| Dataindsamling | |
| Spænding (kV) | 300 |
| Kalibreret forstørrelse (X) | 111.000 |
| Pixelstørrelse (A) | 5.4 |
| Estimeret dosis (e - / A 2) | 100 |
| Underfocus (um) | 4,0-4,5 |
| Første CTF nul (A) en | 26-30 |
| Tilt (°) | -60-60 |
| Tilt prøvetagning (°) | 3 |
| Data og raffinement | |
| Tomogrammer | 11 |
| Virioner | 29 |
| Frø per virion | 106 |
| Samlet antal frø | 3.074 |
| Spikes opdaget | 1.346 |
| Spikes efter fjernelse overlapninger | 1.401 |
| Spikes efter krydskorrelation baseret udvælgelse | 1.022 |
| Spikes indgår i den endelige gennemsnit | 1.022 |
| Symmetri | C3 |
| Kantet prøvetagning (°) | 8 |
| Opløsninganvendes i raffinement område (Å) | 42-334 |
| Endelig resolution skøn (a) b | 35 |
Tabel 1: Bunyamwera dataindsamling og forfining statistik.
en CTF, funktion kontrast overførsel.
b Beregnet Fourier shell korrelation mellem to uafhængigt raffinerede strukturer på en tærskel på 0,143.
Figur 2:. Skive gennem et tomogram af Bunyamwera virioner Flere spike synspunkter tydeligt i periferien af hver virion side er angivet med pilespidser. Den tomogram har været lavpasfiltreres til 60 Å. Scale bar 100 nm.
Først raffineret vi en indledende model med 205 manuelt plukket pigge (
Figur 3: Refinement af den oprindelige skabelon struktur. (A) cylindrisk gennemsnit (C100) skabelon fremstillet af manuelt definerede positioner af pigge. (B) i gennemsnit densitet efter fem runder af raffinement uden symmetri (C1) indførte viser en stigning med tre gangesymmetriske funktioner. Resolutionen af modellen er 48 Å. (C) Gennemsnit af piggen blev løst ved 41 Å efter fem runder af raffinement med tre gange symmetri.
Figur 4:. Videreudvikling af frøene AB) En undergruppe af frø før (A) og efter (B) raffinement bliver vist på et virion tæthed fra figur 2 Frø i (b) er blevet farvekodet baseret på det respektive tværs. korrelationskoefficienter (blå, lav korrelation, rød, høj korrelation).
Den bedste korrelation glycoprotein spike patches (top 75% efter fjernelse overlapninger; ~ 1000 pigge) blev anvendt til at beregne den endelige gennemsnit. Gennemsnittet blev løst til 35-beslutning (figur 5). Den afslørede en trimert spike struktur i midten, iUd over nogle bidrag fra seks tilstødende pigge. Composite modeller af virioner, beregnet ved at strukturen i de kendte positioner, afslørede placeringen af pigge på virionoverfladen (figur 6A). Lejlighedsvis, lokalt bestilt pletter af pigge var tydelig (figur 6B).
Figur 5: Raffineret struktur af et plaster af glycoproteinet spike lag efter skabelon matchning. (AB) To kort »selv« og »ulige«, rekonstrueret fra to halvdele af data er vist. De to kort viser en bemærkelsesværdig grad af lighed, at kontrollere validness af den strategi. Orienteringen omkring piggen længdeakse er forskellig de to kort er blevet rekonstrueret fuldstændigt uafhængig af hinanden. (C) Gennemsnit af de to kort er vist vedden endelige løsning af 35 Å.
Figur 6: Placering af pigge på Bunyamwera virion. (A) Sammensat model af en virion. Vis vektorer (sticks) angiver de orienteringer af piggene. Farver indikerer krydskorrelationen mellem hver spyd og skabelonen struktur (blå, lav korrelation, rød, høj korrelation). (B) Et nærbillede af en ordnet plaster på spikes.
Discussion
Kendskab til viral glycoprotein spike struktur på virion membranen er væsentlige for forståelsen af virusreplikation og udvikling af lægemidler til at behandle og forebygge infektion. Electron cryo-mikroskopi kombineret med enkelt partikel gennemsnitsberegning er blevet den mest anvendte metode til at løse de strukturer omsluttede viruspartikler, herunder glycoprotein pigge. Imidlertid er denne fremgangsmåde begrænset til icosahedrally symmetriske virus. Her ved anvendelse af elektron kryo-tomografi og subtomogram gennemsnitsberegning i Jsubtomo, har vi skitseret en generel protokol til bestemmelse af glycoprotein pigge på pleomorfe indkapslede vira, der ikke er modtagelige for andre aktuelle strukturelle biologi metoder. Vores repræsentative resultater viser, at løsningen af denne metode er tilstrækkelig til at afsløre indsigt i domæne arkitektur, oligomerisering og højere orden organisering af glycoprotein pigge på intakte virioner.
jove_content "> Det mest kritiske skridt i denne protokol er ved at opføre to pålidelige udgangspunkter modeller, der er statistisk uafhængige af hinanden. vellykket gennemførelse af dette trin forudsætter, at glycoprotein spikes er tilstrækkeligt stort og ikke pakket mod hinanden for stramt, så de enkelte pigge kan genkendes visuelt og manuelt plukkes i tomogrammer, og to uafhængige modeller gennemsnit. Hvis dette ikke er muligt, to ændringer til protokol kan forsøges. Først to uafhængige stokastiske modeller kan konstrueres ved først at definere to tilfældige delmængder af subtomograms og derefter gennemsnittet af subtomograms inden for disse delmængder 30. andet, hvis en struktur af den isolerede spike er afledt af andre midler, for eksempel ved røntgenkrystallografi, kan den anvendes som et udgangspunkt model. Dog skal der drages omsorg for lavt indhold pass filter denne model med en lav opløsning cut-off (50-70 Å), da de to resulterende modeller i den næste runde af raffinement vilvære statistisk uafhængig kun ud over denne beslutning. På grund af denne advarsel, anbefales det tidligere tilgang.Den opnåelige opløsning fra denne protokol afhænger af fire vigtige faktorer: i. dataindsamling strategi og kvaliteten af input-data, ii. antal subtomograms iii. tilpasning nøjagtighed subtomograms, og iv. heterogenitet af strukturerne. Mens den første og anden begrænsning i vid udstrækning kan overvindes ved hjælp af højt signal-til-støj direkte elektron detektorer kombineret med CTF korrigerede tomografi og automatiserede dataindsamling er tilpasningen nøjagtighed påvirket yderligere af størrelsen og formen af strukturen af interesse selv. Ved anvendelse af denne protokol på små pigge mangler fremtrædende træk, kan det være fordelagtigt at binde Fab fragmenter til spyddet til at forbedre tilpasningen nøjagtighed og dermed opløsning 31. Endelig, hvis de strukturer, som middelværdier udviser flere konformationer, sub-tomogram klassifikation metoder kan anvendes til gennemsnittet forskellige konformationer separat. Med henblik herpå Jsubtomo integreres med Dynamo pakke, der tilbyder kraftfuld subtomogram klassificering 9.
Ovennævnte protokol er komplementær til røntgenkrystallografi af isolerede virale glycoproteiner. Krystallografiske strukturer kan monteres i sub-tomogram gennemsnit for at opnå den nøjagtige orientering af glycoproteinet med hensyn til virion-membran. Anvendelse af denne metode vil uden tvivl fortsætte med at kaste lys på kappeklædte virus struktur og Patobiologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
| Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
| UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |
References
- Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography. Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).
- Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography. Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).
- Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly. Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).
- Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
- Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor. Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).
- Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).
- Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).
- Fernández, J. J. Computational methods for electron tomography. 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).
- Briggs, J. A. G. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging). Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Frangakis, A. S., et al. Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).
- Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ. PLoS pathogens. 2 (8), (2006).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455 (7209), (2008).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
- Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).
- Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids. Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).
- Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).
- Arranz, R., et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins. Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).
- Karotki, L., et al. Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold. Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).
- Pietilä, M. K., et al. Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea. Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).
- Huiskonen, J. T., et al. Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses. Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).
- Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike. PLoS pathogens. 9 (5), (2013).
- Maurer, U. E., et al. The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction. Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).
- Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature. 9 (9), 853-854 (2012).
- Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Faini, M., et al. The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions. Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).
- Wu, S., et al. Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins. Structure. 20 (4), London, England. 582-592 (2012).
