Abstract
וירוסים אפפו לנצל גליקופרוטאינים קרום על פני השטח שלהם לתווך כניסה לתאי מארח. ניתוח מבני תלת ממדי של "הקוצים" גליקופרוטאין אלה הוא לעתים קרובות מאתגר מבחינה טכנית אך חשוב להבנת הפתוגנזה נגיפית ובתכנון תרופות. הנה, פרוטוקול מוצג לקביעת מבנה ספייק נגיפית באמצעות מיצוע חישובית של נתונים cryo-טומוגרפיה של אלקטרון. cryo-טומוגרפיה של האלקטרון היא טכניקה במיקרוסקופ אלקטרונים המשמשת לחישוב שחזורים תלת ממדיים טומוגרפית נפח, או tomograms, של דגימות ביולוגיות pleomorphic כגון וירוסי קרום במצב כמעט טבעי, קפוא התייבשות. tomograms אלה לחשוף מבנים של עניין בשלושה ממדים, אם כי ברזולוציה נמוכה. מיצוע חישובית של כרכי משנה, או תת tomograms, יש צורך לקבל פירוט ברזולוציה גבוה יותר של חזרה על מוטיבים מבניים, כגון קוצים גליקופרוטאין ויראלי. גישה חישובית מפורטת לעלייgning וממוצע משנה tomograms באמצעות חבילת תוכנת Jsubtomo מתוארת. גישה זו מאפשרת הדמיה של המבנה של קוצים גליקופרוטאין נגיפיים לרזולוציה בטווח של 20-40 A ומחקר של חקר אינטראקציות מסדר גבוהות יותר ספייק לספייק על קרום virion. תוצאות אופייניות מוצגות לוירוס Bunyamwera, וירוס עטף מהמשפחה Bunyaviridae. משפחה זו היא קבוצה מבנית מגוונת של פתוגנים מהווים איום על בריאות אדם ובעלי חיים.
Introduction
cryo-טומוגרפיה של האלקטרון היא טכניקת הדמיה cryo-מיקרוסקופ אלקטרונים המאפשרת החישוב של שחזור תלת ממדים (3D) של דגימות ביולוגיות מורכבות. דגימות מתאימות נעות בין מתחמים מטוהרים macromolecular 1, חוטים 2, שלפוחית מצופה 3, ווירוסים קרום pleomorphic 4 לתאים פרוקריוטים כל 5 ואפילו אזורים דקים של תאים האיקריוטים כל 6. בעקבות איסוף הנתונים של הטיה סדרה, כרכי טומוגרפיה 3D, או tomograms, ניתן לחשב באמצעות מספר חבילות תוכנה שהוקמו, כולל 7 Bsoft וIMOD 8.
שני היבטים חלק מהלימוד של דגימות ביולוגיות על ידי גבול cryo-טומוגרפיה של אלקטרון הפרשנות הביולוגית של הכרכים טומוגרפית המקבילים. ראשית, בשל המינון המוגבל האלקטרון שיכול להיות מיושם על חומרים ביולוגיים לפני הצגת נזקי קרינה משמעותיות, signaיחסי ליטר לרעש בנתונים טומוגרפיה הם בדרך כלל נמוכים מאוד. שני, כתוצאה ממדגם מצומצם גיאומטריה הטיה במהלך איסוף הנתונים, כמה תצוגות של האובייקט להישאר נעדרו, שמוביל לחפץ שנקרא 'טריז חסר' בטומוגרפיה הנפח. עם זאת, שניהם של מגבלות אלה ניתן להתגבר אם טומוגרפיה הנפח מכיל חוזר על מבנים זהים, כגון מתחמי macromolecular, שיכול להיות בהצלחה בממוצע 9-12.
לפני ממוצע של מבנים משחזורי tomogram, אובייקטים של עניין יש למצוא ומיושרים לאותו הכיוון. איתור מבנים כאלה עשויים להיות מושגת על ידי מתאם צולב של מבנה תבנית בטומוגרפיה עוצמת הקול באמצעות גישה המכונה לעתים קרובות כתבנית תואמת 13. התבנית המשמשת בתהליך התאמה זה יכול לנבוע מהאלקטרון cryo-מיקרוסקופיה או cryo-טומוגרפיה של אלקטרון בשילוב עם שחזור 3D, או שזה יכול להיות מפת צפיפות מדומה ממבנה אטומי. כמה חבילות חישובית פותחו כדי לבצע משימות אלה 11.
ממוצע של קוצים גליקופרוטאין של וירוסי קרום, כגון HIV-1, הייתה גישה מוצלחת במיוחד לחקר המבנה שלהם 14-16. הבנה של המבנה היא חלק בלתי נפרד לחשיפת שני הבסיס המולקולרי של אינטראקציות-מארח וירוס ומנחה פיתוח עיצוב אנטי וחיסון. בעוד קריסטלוגרפיה macromolecular היא הטכניקה שבה נקטה ברזולוציה גבוהה (בדרך כלל טובה יותר מאשר 4 א) ניתוח מבני של גליקופרוטאינים נגיפיים בודדים והמתחמים שלהם, מבני רנטגן וכתוצאה משיטה זו הם של חלבונים מבודדים מהסביבה הטבעית הקרומית על virion . לפיכך, פרטים חשובים כגון ארכיטקטורה גבוהה יותר בסדר גודל של גליקופרוטאינים נגיפיים, בהקשר של virion, יישארו חסרים. מצד השני, אלקטרון cryo-מיקרוסקופיה ושחזור חלקיק בודדשל וירוסים עטופים כולו מוגבל לvirions עם הסימטריה icosahedral 17,18. cryotomography אלקטרונים בשילוב עם יישור משנה נפח וכך יצא כטכניקה משלימה המאפשרת המחקר של קוצים גליקופרוטאין של, וירוסי pleomorphic בצורה סדירה באתר.
פיתחנו תוכנה בשם Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) לצורך זיהוי, היישור, והמיצוע של כרכים תת טומוגרפית. Jsubtomo נוצל בקביעת המבנה של מספר המבנים התאיים ונגיפיים 19-26. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט, המאפשר למבני ספייק נגיפי-משטח הנחישות. כדי לעקוף את יתר העידון של מבנים בממוצע על ידי קישור בין רעש, ערכת העידון "תקן זהב" תאומץ 10,27. לבסוף, אסטרטגיות להדמיה ופרשנות של תוצאות אופייניות הם דנו.
Protocol
פרוטוקול מפורט ליישור חישובית והמיצוע הבא של קוצים גליקופרוטאין נגיפיים מתואר. הפרוטוקול כדלקמן זרימת העבודה באיור 1 ומשלב חיפוש אוטומטי לקוצים באמצעות מבני תבנית ראשוניים ועידון מבנה זהב סטנדרטי.
נתוני קלט לפרוטוקול זה הוא קבוצה של שחזורים טומוגרפית של virions. tomogram אחת מכיל virions אחד או יותר. בתחילה, קבוצה קטנה של קוצים היא ידנית הרימה ומשמשת לממוצע ולחדד את שני דגמים עצמאיים. מודלים אלה משמשים לאיתור באופן אוטומטי קוצים על כל virions. לבסוף, שני חידודים עצמאיים מנוהלים וממוצעים וכתוצאה מכך הם בהשוואה ושילוב כדי להפיק את המבנה הסופי.
גישת העידון באה לידי ביטוי בשימוש בתוכניות מחבילת Jsubtomo. תוכניות מחבילת Bsoft 28 משמשות לp תמונה הכלליחבילת משימות rocessing וגרפיקה מולקולרית UCSF כימרה 29 משמשת כדי לחזות את תוצאות. השמות של תוכניות בודדות ניתנים בכתב נטוי ופורמטים של קבצים מסומנים עם סיומות שם הקובץ באותיות גדולות.
איור 1:.. אסטרטגיה כללית לקביעת מבנה של גליקופרוטאין מתחמי ספייק מפני וירוסים קרום pleomorphic המספרים מתאימות לחלקים שונים בפרוטוקול אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
.1 חילוץ כרכים-Sub וירוס בגודל מלא tomograms
- פיק חלקיקי וירוס באופן ידני בtomograms.
- פתיחת קובץ tomogram בbshow. הגדר את מרכז התיאום של partic וירוסle שימוש באפשרות מסיק החלקיקים. חזור על פעולה זו עד שכל virions עברה עיבוד. וירוס שמירת קואורדינטות בקובץ STAR.
- חזור על שלב 1.1.1 עד שכל tomograms עבר העיבוד. רשמו את קוטר virion בפיקסלים.
הערה: אם הקוצים קשים לראות בtomograms, להשתמש bfilter לנמוך לעבור סינון tomograms 80-רזולוציה (פרמטר "-bandpass 80,10000").
- הפעל jsubtomo.py במצב תמצית (פרמטר "תמצית --mode") כדי לחלץ משנה כרכי virion לקבצים בנפח בודד. השתמש בקבצי STAR שמרו בשלב 1.1.1 כקבצי קלט.
- תן גודל (פרמטר "--size") ~ 25% יותר מאשר virion הגדול ביותר בערכת נתונים. לדוגמא, אם virion הוא ~ 200 פיקסלים בקוטר, גודל שימוש 250 x 250 x 250 פיקסלים.
- קבצי פלט של כרכי virion יהיו בMAP-פורמט. בנוסף, ליצור STAR-קובץ נלווה לכל virion נפח (parameter "--output").
- לנרמל כרכי virion בbimg ("0,1 -rescale" פרמטר).
2 דור של שני דגמים ראשוניים עצמאיים
- בחר קבוצת משנה של קוצים בכרכים תת virion.
- פתיחת קובץ MAP משנה נפח virion בbshow. הגדר את מרכז התיאום של ספייק באמצעות כלי חלקיקי הקטיף, נגיש דרך חלון ארגז הכלים. חזור על פעולה זו עד שכל הקוצים נבדלים באופן ברור כבר מעובד. ספייק שמור קואורדינטות בקובץ STAR.
- אם יש צורך, חזרו על שלב 2.1.1 לvirions אחרת עד כ 200 קוצים גליקופרוטאין עברו עיבוד. הערה ממדי עלייה חדה בפיקסלים.
הערה: ~ קוצים 200 הם קו מנחה גס ויותר עשוי להידרש עבור יישומים מסוימים. במידת האפשר, במטרה לאסוף קוצים באורינטציות שונות. הימנע מבחירת צפיות עליונה בלבד.
- הקצאת וקטור תצוגה ראשונית לקוצים על ידי הפעלת jviews.py. השתמש בקבצי STAR שנוצרו בשלב 2.1.1 כקבצי קלט.
הערה: וקטור השקפה זו קרוב לכיוון של ספייק עם התייחסות לvirion.- השתמש המרכזי לתאם להקצות הצפיות לvirion כדורי. לדוגמא, אם virion מרוכז (לאחר שלב 1.2) בקופסא עם גודל של 250 x 250 x 250 פיקסלים, המרכזי לתאם הוא 125125125 פיקסלים (אפשרות "--Radial 125125125").
- כדי להקצות את התצוגות עבור virion סיבי, לפתוח כל תת נפח virion בbshow על ידי שימוש בקובץ STAR המוגדר בשלב 2.1.1 כקובץ הקלט. להגדיר שתי נקודות הקצה של חוט הלהט באמצעות כלי קטיף נימה ולשמור את קובץ STAR. חזור על פעולה זו עד שכל קבצי STAR עודכנו ולהפעיל jviews.py באמצעות קבצי STAR המעודכנים כקבצי קלט (--option מגזר).
- צור מסכת חלל ממשי באמצעות jsubtomo_create_mask.py. ודא שמסכת המרחב האמיתי היא של אותו dimensיונים כישמשו למבנה בממוצע (ראו 2.6.2), והוא גדול מספיק כדי להכיל גם את ספייק ותיקון של הקרום הבסיסי.
- צור מסכת חלל הדדית באמצעות jsubtomo_create_wedgemask.py. מסכת חלל הגומלין משמשת ללכלול אזורים באזור "חסר הטריז" כתוצאה מאיסוף הנתונים טומוגרפית ציר יחיד. ודא שזה של אותם הממדים כמו ישמש למבנה בממוצע (ראה 2.6.2).
- ליצור קובץ בחירה (קובץ SEL) הגדרת virions המשתייכת לקבוצות "1" ו "2" באמצעות קבצי STAR שנוצרו בשלב 2.2 jsubtomo_evenodd.py ו.
- צור שני ממוצעים ראשוניים באמצעות jsubtomo_create_averages.py.
- השתמש בקובץ SEL שנוצר בשלב 2.5 כקובץ הקלט.
- תן גודל (פרמטר "--size") לפחות 32 פיקסלים גדולים יותר מהממד הגדול ביותר של ספייק. לדוגמא, אם ספייק הוא ארוך 40 פיקסלים ~, גודל שימוש 72 x 72 x 72 פיקסלים.
- החל סימטריה גבוהה (למשל, c100) על הממוצעים (פרמטר "c100 --symmetry"), לקירוב ממוצע גלילי סביב ארוך הציר של ספייק. השתמש symmetrization כדי להפחית את הרעש בממוצעים הראשוניים.
- ציין שם ייחודי עבור קבצי הפלט של הפרויקט (הפרמטר "--suffix").
- השתמש במסכת החלל האמיתית שנוצרה בשלב 2.3 כדי להסוות משם רקע (פרמטר "--mask"). השתמש במסכת החלל ההדדית שנוצרה בשלב 2.4 לתת דין וחשבון על אובדן האות הוצג על ידי הנוכחות של טריז חסר (פרמטר "--Mask").
יישור איטרטיבי .3 זהב סטנדרטי ומיצוע של שני מודלי ספייק ראשוניים
Iteratively ליישר ומחשבים את ממוצע שני הדגמים ראשוניים שנוצרו בסעיף 2 עם jsubtomo_iterate_gold.py.
- שלב I. המטרה של שלב זה הוא כדי לחדד אתכיוון של וקטור הנוף. קובץ הקלט הוא קובץ SEL שנוצר בשלב 2.5.
- השתמש בדגימה זוויתי 8 מעלות (פרמטר "--angles 8,8,8").
- לאפשר שינויי 16 מעלות בכיוון של וקטור השקפת ספייק (פרמטר "--thetaphilimit 16") אבל לשמור את הזווית סביב הציר ארוך ספייק קבוע (הפרמטר "--alphalimit 0").
- לאפשר משמרות translational קטנות (לדוגמא, 5 פיקסלים) לדין וחשבון על אי דיוקים במסיק ידני של הקוצים (פרמטר "--shiftlimit 5").
- החל סימטריה גבוהה (למשל, c100) על הממוצעים (פרמטר "c100 --symmetry"), לקירוב ממוצע גלילי סביב ארוך הציר של ספייק.
הערה: Symmetrization משמש כדי להפחית את הרעש בממוצעים. - השתמש במסכת החלל האמיתית ומסיכת החלל ההדדית שנוצרה בשלבים 2.3 ו2.4 כדי להסוות משם קוצים וחשבון מקיף לטריז החסר (פרמטרים "--mלשאול "ו" --Mask ", בהתאמה).
- השתמש בשני קבצי MAP שנוצרו ב2.6 (כונה על ידי תגים "אפילו" ו "מוזר" בשם הקובץ) כתבניות (פרמטרים "--Template1" ו "--Template2", בהתאמה).
- החל מסנן מעביר נמוך ב50-החלטה ("--resolution" פרמטר) כדי למנוע הטיה יישור.
- החל גורם סל של 2 על מנת לזרז את העידון (הפרמטר "--bin 2").
- לרוץ 5 חזרות של יישור וממוצע (פרמטרים "--firstiter 1 --lastiter 5").
- השלב השני. המטרה של שלב זה היא כדי לחדד את הזווית סביב וקטור הנוף. קובץ הקלט הוא פלט קובץ SEL מצעד 3.1.9.
- מדדו את הממדים מדויקים של ספייק ידי פתיחת קובץ MAP המסונן הנמוך לעבור נוצר באיטרציה האחרונה בשלב 3.1.9 (כונה על ידי תג "_lp" בשם הקובץ) בbshow. צור אמיתי חדשמסכת החלל בדומה לצעד 2.3 המגדירים את ספייק אך אינו כולל את רוב הקוצים הקרום ושכנים.
הערה: הגודל האופטימלי של המסכה תלוי בגודל והתכונות של ספייק. - השתמש בדגימה זוויתי 8 מעלות (פרמטר "--angles 8,8,8") כמו קודם.
- לאפשר שינויי 180 מעלות בזווית סביב וקטור השקפת ספייק (פרמטר "- alphalimit 180") אבל לשמור תטא וזוויות phi קבועים (פרמטר "--thetaphilimit 0").
- אל תאפשר לאף משמרות translational (פרמטר "--shiftlimit 0").
- האם לא חל כל סימטריה על הממוצעים (להשמיט "--symmetry" פרמטר).
- השתמש במסכת החלל ההדדית שנוצרה בשלב 2.4 לתת דין וחשבון לטריז החסר.
- השתמש בשני קבצי MAP שנוצרו באיטרציה האחרונה של שלב 3.1.9 ללא סימטריה (כונה על ידי תגים "even_nosym" ו "odd_nosym" בשם הקובץ) כR תבניות (פרמטרים20; - Template1 "ו" --Template2 ", בהתאמה).
- החל מסנן מעביר נמוך ב50-החלטה ("--resolution" פרמטר) באיטרציה הראשונה כדי למנוע הטיה יישור. כוון את הפרמטרים מסנן בחזרות שלאחר מכן באופן אוטומטי ("--adaptivefilter" פרמטר) המבוסס על המתאם פורייה Shell זהב סטנדרטי (FSC) בין שני הממוצעים עצמאיים. השתמש 0.143-קריטריון (פרמטר "--fsccrit 0.143"). אל תאפשר לעידון עבר אפס הראשון של פונקצית העברת ניגוד (CTF) ("--minhires" פרמטר), אלא אם כן תיקון CTF הוחל tomograms.
- הפעל 5-10 חזרות של יישור וממוצע (לדוגמא, פרמטרים "--firstiter 6 --lastiter 15"). לעקוב אחר השינויים ברזולוציה דיווחה. כאשר לא חלה שינויים משמעותיים הם נצפו, ניתן להפסיק את התהליך.
- מדדו את הממדים מדויקים של ספייק ידי פתיחת קובץ MAP המסונן הנמוך לעבור נוצר באיטרציה האחרונה בשלב 3.1.9 (כונה על ידי תג "_lp" בשם הקובץ) בbshow. צור אמיתי חדשמסכת החלל בדומה לצעד 2.3 המגדירים את ספייק אך אינו כולל את רוב הקוצים הקרום ושכנים.
- להעריך את מידת הסימטריה במבנה על ידי examining את הקובץ שנוצר נמוך לעבור MAP המסונן (כונה על ידי "_lp" תג בשם הקובץ) בכימרה. לדוגמא, אם ספייק הוא מורכב trimeric, סימטריה של פי 3 צריכה להיות ברורה.
- בשלב III. המטרה של שלב זה היא כדי לחדד את הזווית סביב וקטור המבט נוסף עם סימטריה נכונה. קובץ הקלט הוא פלט קובץ SEL מצעד 3.2.9. הפרמטרים הם אותו הדבר כמו בשלב 3.2 עם כמה יוצאים מן הכלל:
- לאפשר שינויים מתאימים בזווית סביב וקטור השקפת ספייק. לדוגמא, אם המבנה יש סימטריה של פי 3, יאפשר שינויים של 60 מעלות בזווית אלפא (פרמטר "--alphalimit 60").
- החל הסימטריה הנכונה (למשל, C3) על הממוצעים (C3 --symmetry פרמטר ").
- השתמש בשני קבצי MAP שנוצרו באיטרציה האחרונה בשלב 3.2.9 (כונה על ידי תגים "אפילו" ו "מוזר" בשם הקובץ) כקבצי תבנית קלט (פרמטרים "--Template1" ו---Template2).
- הפעל 5-10 חזרות של יישור וממוצע (לדוגמא, פרמטרים "--firstiter 16 --lastiter 25"). לעקוב אחר השינויים ברזולוציה דיווחה. כאשר לא חלה שינויים משמעותיים הם נצפו, ניתן להפסיק את התהליך.
- בשלב IV. המטרה של שלב זה היא לחדד בצורה מדויקת את כל שלוש הזוויות בו זמנית. קובץ הקלט הוא פלט קובץ SEL מצעד 3.4.4. הפרמטרים הם אותו הדבר כמו בשלב 3.4 עם כמה יוצאים מן הכלל:
- לאפשר שינויי 8 מעלות בזווית סביב וקטור השקפת ספייק (פרמטר "- alphalimit 8") ושינויי 8 מעלות בכיוון של וקטור השקפת ספייק (פרמטר "--thetaphilimit 8"). לחדד את האוריינטציות לדיוק 4 מעלות (פרמטרים "--angles 8,8,8 --iterate 2").
- לאפשר משמרות קטנות (לדוגמא, 5 פיקסלים) לדין וחשבון על אי דיוקים בצעדי יישור קודמים (פרמטר "--shiftlimit 5").
- Use שני קבצי MAP שנוצרו באיטרציה האחרונה בשלב 3.4.4 (כונה על ידי תגים "אפילו" ו "מוזר" בשם הקובץ) כקבצי תבנית קלט (פרמטרים "--Template1" ו--Template2).
- הפעל 5-10 חזרות של יישור וממוצע (לדוגמא, פרמטרים "--firstiter 26 --lastiter 35"). לעקוב אחר השינויים ברזולוציה דיווחה. כאשר לא חלה שינויים משמעותיים הם נצפו, ניתן להפסיק את התהליך.
.4 דור ויישור של זרעים למשטח הווירוס להתאמת תבנית
- צור זרעים ממוקמים באופן שווה על פני השטח virion להתאמת תבנית ולהקצות וקטור תצוגה ראשוני לזרעים על ידי הפעלת jviews.py. השתמש בקבצי STAR שנוצרו בשלב 1.2.2 כקבצי קלט. צור כ 1.5 פעמים את זרעים יותר מאשר המספר הצפוי של קוצים.
הערה: וקטור השקפה זו קרוב לכיוון של ספייק הקרוב ביותר לכל נקודת זרע.- כדי ליצור זרעים מופצים באופן שווה על virion בערך כדורי (פרמטר "--Even"), לתת את הרדיוס (פרמטר "--radius"), הפרדה זוויתי (לדוגמא, 20 מעלות) של הזרעים (פרמטר "--angle 20" ) ולתאם מרכזי של virion. לדוגמא, אם virion מרוכז (לאחר שלב 1.2) בקופסא עם גודל של 250 x 250 x 250 פיקסלים, לתאם המרכזי הוא 125125125 פיקסלים (אפשרות "--origin 125125125") .
- כדי ליצור זרעים מופצים באופן שווה על חלקיקים סיביים, להשתמש בפרמטר "--Filament" ולציין גם את הרדיוס ופרמטרי סליל סימטריה (עלייה וטוויסט).
הערה: הפרמטרים הסימטריה הסליל משמשים כאן רק כדרך נוחה של הגדרת תפקידי זרע מופץ באופן שווה ושהם לא צריכים לשקף את ההזמנה בפועל של הקוצים על נימה.
- צור שני ממוצעים עצמאיים של משטח הווירוס כexplaineד בסעיף 2.
- ליצור קובץ SEL הגדרת virions המשתייכת לקבוצות "1" ו "2" באמצעות קבצי STAR שנוצרו בשלב 4.1 jsubtomo_evenodd.py ו.
הערה: כדי להבטיח את עצמאותה של מערכי נתונים, כל משימה קודמת של virions לקבוצות ו" 2 "" 1 "חייב להישאר אותו הדבר.
- ליצור קובץ SEL הגדרת virions המשתייכת לקבוצות "1" ו "2" באמצעות קבצי STAR שנוצרו בשלב 4.1 jsubtomo_evenodd.py ו.
- לחדד את העמדה של הזרעים.
- בצע את ההוראות בשלב 3.1 אלא אם צוין אחרת. השתמש בקובץ SEL שנוצר בשלב 4.2.1 כקובץ הקלט.
- לאפשר את הזרעים להעביר רק לאורך נורמליים הקרום (הפרמטר "--zshiftlimit"). התאם את הכמות המוותרת של משמרת תלוי כמה virions לסטות מגיאומטריה כדורית אידיאלית (למשל, פרמטר --zshiftlimit 25 ").
- השתמש בשני קבצי MAP שנוצרו בשלב 4.2 (כונה על ידי תגים "אפילו" ו "מוזרים" בשם הקובץ) כקבצי תבנית קלט (פרמטרים "--Template1 "ו--Template2).
- השתמש בסיומת ייחודית כדי למנוע דריסת קבצי STAR קלט המקורי (לדוגמא, פרמטר "--suffix _seeds").
- השתמש binning של 4 כדי לזרז את החישוב (פרמטר "--bin 4") ומסנן נמוך לעבור (לדוגמא, פרמטר "--resolution 50").
- ליצור קבצי כימרה סמן (CMM) של קבצי STAR הזרע המעודנים באמצעות jviews.py (פרמטר "--cmm"). בדוק את הזרעים על ידי פתיחת קבצי CMM (וקבצי MAP virion הקשורים) בכימרה. ודא שהזרעים המעודנים מיושרים כהלכה ביחס לקרום הווירוס.
הערה: בצבעים שונים ניתן להשתמש כדי לבדל את הסטים נפרדים של סמנים ("--color" פרמטר). לחלופין יכולים להיות בצבע הסמנים המעודנים המבוססים על מקדם מתאם הצלב שלהם (למשל, פרמטר "--fomcolor 0.1,0.3").
.5 זהב-דוכןארד איטרטיבי מערך ומיצוע של מבנה ספייק
באופן אוטומטי לאתר כל הקוצים בכרכי משנה virion באמצעות התאמת תבנית מקומית סביב הזרעים המעודנים וליישר וממוצע הקוצים ממוקמים. השתמש בממוצעים שנוצרו מקבוצת משנה של קוצים ידני הרימו כתבניות ראשוניות.
- לבצע התאמת תבנית מקומית סביב הזרעים לממוצע כל הקוצים באמצעות jsubtomo_iterate_gold.py תכנית. בצע את ההוראות בשלב 3.5 אלא אם צוין אחרת.
- קובץ הקלט הוא קובץ SEL לזרעים המעודנים שנוצרו בשלב 4.3.
- השתמש במגבלה גדולה מספיק לזווית וקטור נוף. לדוגמא, אם זרעים שנוצרו בכל 20 מעלות (שלב 4.1), להשתמש בזווית מעט גדולה יותר ממחציתו של ערך זה (פרמטר "--thetaphilimit 12"). לאפשר שינויים מתאימים בזווית סביב וקטור השקפת ספייק.
- לאפשר זרעים להעביר במטוס של הקרום (פרמטר"--xyshiftlimit"). לדוגמא, אם מרחק זרע לזרע הוא 25 פיקסלים, להשתמש משמרת כוללת מעט יותר ממחצית מזו (לדוגמא, פרמטרים "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
הערה: משמרות translational נוספות עשויות להידרש אם קבצי MAP שנוצרו בשלב 3.5 מרוכזים במרחק שונה ממרכז virion מהזרעים. - השתמש בשני קבצי MAP שנוצרו בשלב 3.5 (כונה על ידי תגים "אפילו" ו "מוזר" בשם הקובץ) כקבצי תבנית קלט (פרמטרים "--Template1" ו--Template2).
- השתמש ברזולוציה הנוכחית של קבצי MAP שנוצרו ב3.5 (--resolution פרמטר) הצעד.
- הפעל 5-10 חזרות של התאמת תבנית, יישור ומיצוע (למשל, פרמטרים "--firstiter 1 --lastiter 10"). לעקוב אחר השינויים ברזולוציה דיווחה. כאשר לא חלה שינויים משמעותיים הם נצפו, ניתן להפסיק את התהליך.
- לאחר כל איטרציה, שלא לכלול להיטים חופפים. לדוגמא, אם רוחבו של ספייק הוא 30 פיקסלים, שלא לכלול להיטים שהם קרובים יותר מ30 פיקסלים ללהיטים אחרים (פרמטר "--mindist 30").
- תכלול להיטים עם מתאם שיתוף יעיל נמוך צלב. לדוגמא, כוללים הקוצים 75% הטובים ביותר עבור כל virion (פרמטר "--topp 75").
הערה: כניסות עם מתאם צלב נמוך שיתוף יעיל עשויות לייצג להיטים חיוביים כוזבים.
.6 ויזואליזציה של התוצאות
- פתח את המבנה המעודן של העלייה החדה בכימרה להדמיה והתאמה של מבנים אטומיים.
- השתמש בקובץ הנמוך לעבור MAP המסונן (כונה על ידי תג "lp") שנוצר באיטרציה הסופית בשלב 5.1.6 כקובץ הקלט.
- השתמש ברזולוציה מצויינים בשלב 5.1.6 למתאם צולב מבוססים הולם בכימרה "Fit במפה" כלי.
- ליצור מודל משולב של virion באמצעות jsubtomo_create_model.py.
- השתמש בקובץ הנמוך לעבור MAP המסונן (כונה על ידי תג "lp") שנוצר באיטרציה הסופית בשלב 5.1.6 כקובץ MAP הקלט (פרמטר "--Template").
- השתמש בקובץ STAR נוצר באיטרציה הסופית בשלב 5.1.6 כקובץ STAR הקלט.
- השתמש בקובץ המסכה שנוצר בשלב 3.2.1 כדי להסביר חופף צפיפות במודל המשולב ("--mask" פרמטר).
- ציין את גודל קובץ MAP virion ליצור מודל מורכב של באותו הגודל (פרמטר "--size").
- פתח את המודל מרוכבים להדמיה בכימרה.
Representative Results
אנו מדגימים את היישום של זרימת העבודה מיצוע משנה tomogram שתוארה לעיל למורכב מעטפת גליקופרוטאין של וירוס Bunyamwera (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) באמצעות נתונים שפורסמו בעבר להגדיר 24. פרמטרים איסוף נתונים ועידונם מופיעים בטבלה 1. tomogram נציג אחד שמוצג באיור 2.
| פרמטר (יחידה) | ערך |
| איסוף נתונים | |
| מתח (ק) | 300 |
| הגדלה מכוילת (X) | 111,000 |
| גודל פיקסל (א) | 5.4 |
| מינון משוער (ה - / 2) | 100 |
| Underfocus (מיקרומטר) | 4.0-4.5 |
| אפס CTF הראשון (א) | 26-30 |
| טווח הטיה (°) | -60-60 |
| דגימת הטיה (°) | 3 |
| נתונים ועידון | |
| Tomograms | 11 |
| Virions | 29 |
| זרעים לvirion | 106 |
| מספר כולל של זרעים | 3,074 |
| Spikes זוהה | 1,346 |
| קוצים לאחר הסרת חפיפות | 1,401 |
| קוצים לאחר בחירה מבוססת חוצה קשר | 1,022 |
| Spikes נכלל בממוצע הסופי | 1,022 |
| סימטריה | C3 |
| דגימה הזוויתי (°) | 8 |
| רזולוציהטווח שימוש בעידון (א) | 42-334 |
| אומדן החלטה סופי ב (א) | 35 |
טבלה 1: איסוף נתונים Bunyamwera וסטטיסטיקת עידון.
CTF, פונקצית העברת ניגוד.
ב מחושב באמצעות מתאם פגז פורייה בין שני מבנים באופן עצמאי מעודנים בסף של 0.143.
איור 2:. Slice דרך tomogram של virions Bunyamwera כמה מבטי צד ספייק ניכרו בפריפריה של כל virion מצוינים עם ראשי חץ. Tomogram היה נמוך לעבור סינון ל60 א. סרגל קנה מידה 100 ננומטר.
ראשית, אנו מעודנים מודל ראשוני באמצעות 205 קוצים ידני הרימו (
איור 3: עידון של מבנה התבנית הראשוני. () Cylindrically ממוצע התבנית (C100) הבנויה מתפקידים שהוגדרו באופן ידני של קוצים. (B) צפיפות פי ממוצע לאחר חמישה סבבים של עידון ללא כל סימטריה (C1) שהוטלה מציגה עלייה חדה בפי שלושהתכונות סימטריות. הרזולוציה של המודל היא 48 א. (C) הממוצע של ספייק הוחלט ב41 Å לאחר חמישה סבבים של עידון עם סימטריה פי שלוש.
איור 4:. עידון של הזרעים AB) קבוצת משנה של זרעים לפני () ועידון אחרי (B) מוצגים בצפיפות virion אחד מהאיור 2 זרעים ב( ב) היו מבוססים על צולב בהתאמה צבעים. מקדמי מתאם (כחול, מתאם נמוך; מתאם גבוה אדום,).
התיקונים הטובים ביותר התאמתו גליקופרוטאין ספייק (75% העליונים לאחר הסרת חפיפה; ~ 1,000 הקוצים) ששימשו בחישוב ממוצע הסופי. הממוצע הוחלט 35 החלטה (איור 5). זה חשף מבנה ספייק trimeric באמצע, בבנוסף לכמה תרומה משישה קוצים הסמוכות. מודלים מורכבים של virions, מחושבת על ידי הצבת המבנה בעמדות הידועות, חשפו מיקום של הקוצים על פני השטח virion (איור 6 א). מדי פעם, טלאים הורו באופן מקומי של קוצים ניכרו (איור 6).
איור 5: מבנה מעודן של תיקון של שכבת ספייק גליקופרוטאין לאחר התאמת תבנית. (AB) שתי מפות "אפילו 'ו' מוזר ', שחזרו משני חצאים של הנתונים מוצגים. שתי מפות להראות מידה יוצאת דופן של דמיון, המאמתות את validness של הגישה. האורינטציה סביב הציר הארוך ספייק היא שונה כשתי המפות שוחזרו באופן עצמאי באופן מלא מכל אחר. (C) הממוצע של שתי המפות מוצג בההחלטה הסופית של 35 א.
איור 6: מיקום של הקוצים על virion Bunyamwera. מודל משולב לvirion (). צפו בוקטורים (מקלות) מצביעים על האוריינטציות של הקוצים. צבעים מצביעים על המתאם הצולב בין כל ספייק ומבנה התבנית (כחול, מתאם נמוך; מתאם גבוה אדום,). (ב) תקריב של תיקון מסודר של קוצים.
Discussion
ידע של מבנה ספייק גליקופרוטאין הנגיפי על קרום virion הוא חיוני להבנת שכפול נגיף ופיתוח תרופות לטיפול ולמניעת זיהום. cryo-מיקרוסקופ אלקטרונים בשילוב עם מיצוע חלקיק יחיד התפתח כשיטת המנוצלת ביותר כדי לפתור את המבנים של חלקיקי נגיף עטפו, כוללים הקוצים גליקופרוטאין. עם זאת, שיטה זו מוגבלת לicosahedrally וירוסים סימטריים. כאן, באמצעות היישום של אלקטרון cryo-טומוגרפיה ומיצוע subtomogram בJsubtomo, שהצגנו פרוטוקול כללי לקביעת קוצים גליקופרוטאין על pleomorphic עטף וירוסים שאינם ניתנים לשיטות ביולוגיה אחרות הנוכחיות מבניות. תוצאות הנציג שלנו מראות כי הרזולוציה של שיטה זו היא מספיק כדי לחשוף תובנות ארכיטקטורת תחום, oligomerization, וארגון מסדר גבוה יותר של קוצים גליקופרוטאין על virions שלמה.
jove_content "> השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא בניית שני מודלים התחלה אמינות שאינם תלויים מבחינה סטטיסטית זה מזה ביצוע. מוצלח של שלב זה מבוסס על ההנחה כי הקוצים גליקופרוטאין הם מספיק גדולים ולא עמוסים אחד נגד השני בחוזקה רבה מדי, כדי שקוצים בודדים יכול יוכר מבחינה ויזואלית וידני הרים בtomograms, ושני מודלים עצמאיים בממוצע. אם זה לא ריאלי, יכול להיות ניסו שני שינויים בפרוטוקול. ראשית, ניתן לבנות שני מודלים אקראיים עצמאיים על ידי ההגדרה ראשונה שתי תת קבוצות של subtomograms אקראיות ולאחר מכן ממוצע subtomograms בתוך תת אלה 30. שני, אם מבנה של ספייק המבודד כבר נגזר באמצעים אחרים, למשל על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן, ניתן להשתמש בו כמודל התחלה. עם זאת, יש להקפיד לנמוך תעבור סינון מודל זה באמצעות חתך ברזולוציה נמוכה (50-70 א), כשני מודלים וכתוצאה מכך בסיבוב הבא של עידון יהיהלהיות עצמאי מבחינה סטטיסטית רק מעבר להחלטה זו. בשל אזהרה זו, הגישה לשעבר מומלצת.הרזולוציה השגה מפרוטוקול זה תלוי בארבעה גורמים עיקריים: א. אסטרטגיה של איסוף נתונים והאיכות של נתוני הקלט, ii. מספר subtomograms, iii. דיוק יישור של subtomograms, וiv. ההטרוגניות של המבנים. בעוד המגבלה הראשונה ושנייה ניתן להתגבר במידה רבה על ידי שימוש בגלאים גבוהים אות לרעש ישירים אלקטרונים בשילוב עם CTF תיקן טומוגרפיה ואיסוף נתונים אוטומטי, דיוק היישור מושפע יותר על ידי הגודל וצורה של המבנה של העניין עצמו. בעת החלת פרוטוקול זה על קוצים קטנים חסרי מאפיינים בולטים, זה עשוי להיות יתרון לאגד שברי Fab לספייק כדי לשפר את דיוק היישור וכך החלטה ביום 31 ב. לבסוף, תצורות מרובות תערוכה אם המבנים להיות בממוצע, משנה tomogrשיטות סיווג בבוקר עשויות לשמש לממוצע תצורות שונות בנפרד. לשם כך, Jsubtomo משתלב עם חבילת דינמו, מציע subtomogram החזק סיווג 9.
הפרוטוקול לעיל הוא משלים לקריסטלוגרפיה רנטגן של גליקופרוטאינים נגיפיים מבודדים. יכולים להיות מצוידים מבנים קריסטלוגרפיים לממוצעים תת tomogram להשיג את הכיוון המדויק של גליקופרוטאין ביחס לקרום virion. יישום של מתודולוגיה זו, ללא ספק, ימשיך לשפוך אור על מבנה נגיף עטוף וpathobiology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
| Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
| UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |
References
- Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography. Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).
- Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography. Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).
- Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly. Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).
- Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
- Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor. Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).
- Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).
- Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).
- Fernández, J. J. Computational methods for electron tomography. 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).
- Briggs, J. A. G. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging). Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Frangakis, A. S., et al. Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).
- Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ. PLoS pathogens. 2 (8), (2006).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455 (7209), (2008).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
- Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).
- Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids. Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).
- Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).
- Arranz, R., et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins. Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).
- Karotki, L., et al. Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold. Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).
- Pietilä, M. K., et al. Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea. Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).
- Huiskonen, J. T., et al. Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses. Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).
- Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike. PLoS pathogens. 9 (5), (2013).
- Maurer, U. E., et al. The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction. Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).
- Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature. 9 (9), 853-854 (2012).
- Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Faini, M., et al. The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions. Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).
- Wu, S., et al. Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins. Structure. 20 (4), London, England. 582-592 (2012).
