Abstract
Zarflı virüsler konakçı hücrelere giriş aracılık etmek ile ilgili yüzeyi üzerindeki zar glikoproteinleri kullanmaktadır. Bu glikoprotein 'sivri' Üç-boyutlu yapısal analizler çoğunlukla viral patogenezi anlamak için ve ilaç tasarımında teknik açıdan zor ama önemlidir. Burada, bir protokol elektron cryo-tomografi verileri hesaplama ortalamaya yoluyla viral başak yapı tayini için sunulmuştur. Elektron cryo tomografi bir doğala yakın, dondurulmuş sulu halde membran virüsler gibi biyolojik örneklerin pleomorfik, üç boyutlu hacimli tomografik rekonstrüksiyon veya tomografi, elde etmek için kullanılan elektron mikroskobu bir tekniktir. Bu tomografi düşük çözünürlükte olsa, üç boyutta ilgi yapılar ortaya çıkarmak. Alt birimlerine veya alt tomografi Hesaplamalı ortalama, viral glikoprotein sivri gibi yapısal motiflerini, tekrar eden yüksek çözünürlüklü detay elde etmek için gereklidir. Ali için ayrıntılı bir hesaplama yaklaşımıgning ve Jsubtomo yazılım paketi kullanarak, alt-tomogram ortalama özetlenmiştir. Bu yaklaşım, virion zar üzerinde yüksek seviyeli başak sivri uç etkileşimlerin bir çalışma 20-40 Â çözünürlük aralığında ve çalışma viral glikoprotein sivri yapısının görselleştirme sağlar. Tipik sonuçlar Bunyamwera virüsü, Bunyaviridae ailesinden zarflı virüs için sunulmuştur. Bu aile, insan ve hayvan sağlığı için bir tehdit patojenlerin yapısal olarak farklı bir gruptur.
Introduction
Elektron cryo-tomografi karmaşık biyolojik örneklerin bir üç boyutlu (3D) yeniden hesaplanmasını sağlayan bir elektron cryo-mikroskopi görüntüleme tekniğidir. Müsait örnekler bütün prokaryotik hücreler 5 ve bütün ökaryotik hücreler 6 bile ince alanlara saflaştırılmış makro-moleküler kompleksler 1, filaman 2, kaplamalı veziküller 3 ve pleomorfik membran virüs 4 arasında değişir. Bir tilt-dizi, 3D tomografik hacimleri, ya tomogramları veri toplama ardından, Bsoft 7 ve imod 8 olmak üzere birkaç kurulan yazılım paketleri kullanılarak hesaplanabilir.
Elektron cryo-tomografi sınırı gelen tomografik hacimlerinin biyolojik yorumlanması biyolojik örneklerin çalışmaya doğasında iki yönü. Bağlı olarak büyük radyasyon hasarı verilmesinden önce, biyolojik malzemelerden uygulanabilir sınırlı elektron doz signa, İlktomografi veri L-gürültü oranları tipik olarak çok düşüktür. İkinci olarak, veri toplama sırasında kısıtlı örnek eğim geometrisinin bir sonucu olarak, nesnenin bazı incelemeler tomografik hacimde bir sözde 'eksik kama' artefakt yol mevcut kalır. Tomografik birim halinde başarılı olarak 9-12 ortalama böyle makromoleküler kompleksler olarak özdeş yapılar, tekrar içerir, ancak, bu dezavantajların her ikisi de aşılabilir.
Tomogram rekonstrüksiyonlarda gelen yapıları ortalama önce, ilgi nesneler bulundu ve aynı yönde hizalanmış olmalıdır. Bu tür yapıları yerlerinin çoğu zaman, şablon olarak 13 eşleşen anılan bir yaklaşım kullanarak tomografik hacminde bir şablon yapının çapraz korelasyon elde edilebilir. Bu eşleştirme işleminde kullanılan şablon elektron cryo-mikroskobu veya 3D rekonstrüksiyon ile birlikte elektron cryo-tomografi elde edilebilir, ya da gelen simüle bir yoğunluk haritası olabilirBir atom yapısı. Birkaç bilgisayar paketler 11, bu görevleri yerine getirmek üzere geliştirilmiştir.
HIV-1 gibi membran virüsler, glikoprotein sivri ortalama, onların yapısını 14-16 çalışmak için özellikle başarılı bir yaklaşım olmuştur. Yapının, virüs konakçı etkileşimleri hem de moleküler temeli ortaya çıkartılması ve anti-viral ve aşı tasarımının gelişimi yönlendirmek için ayrılmaz bir parçasıdır. Makromoleküler glikoproteinler kristalografi ayrı ayrı virütik ve komplekslerin yapı analizine (4, bir zaman daha iyi) yüksek çözünürlüklü için tercih edilen bir tekniktir, ancak bu yöntemle elde edilen X-ışını yapısı, viryonun üzerindeki doğal ortamdan izole membran proteinleri vardır . Bu durumda, bu virion bağlamında viral glikoproteinlerin daha yüksek dereceli mimari, önemli bilgileri, eksik kalır. Öte yandan, elektron mikroskobu ve kriyo-tek parçacık yenidenbütün kılıflı virüsler ikosahedral simetri 17,18 ile virionlann sınırlandırılmıştır. Alt ses uyumu ile birlikte elektron cryotomography böylece yerinde düzensiz şekilli, pleomorfik virüslerin glikoprotein sivri çalışma izin tamamlayıcı bir teknik olarak ortaya çıkmıştır.
Biz Jsubtomo tomografik alt birimlerin tespiti, hizalama ve ortalama için (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) adında bir yazılım geliştirdik. Jsubtomo hücresel ve viral yapının 19-26 bir dizi yapı belirlemelerinde kullanılmıştır. Burada, biz belirlenmesi viral yüzey başak yapıları sağlayan ayrıntılı bir protokol, anahat. Gürültü ilişkilendirerek aşırı arıtma ortalama yapıların aşmak için, 'altın standart' arıtma şeması 10,27 benimsenmiştir. Son olarak, görselleştirme ve tipik sonuçların yorumlanması için stratejiler tartışılmıştır.
Protocol
Hesaplama uyum ve viral glikoprotein sivri sonraki ortalama için ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir. Protokol Şekil 1'de gösterilen iş akışını takip ve ilk şablon yapılar ve bir altın standart yapı arıtma kullanarak ani bir otomatik arama birleştirir.
Bu protokol için giriş veri viryonlarının tomografik rekonstrüksiyon bir dizi. Bir tomogram bir veya daha fazla virüsleri içerir. Başlangıçta, sivri küçük bir alt kümesidir elle aldı ve ortalama ve iki bağımsız modelleri rafine için kullanılır. Bu modeller, otomatik olarak virüslerin tümü üzerinde ani bulmak için kullanılır. Son olarak, iki bağımsız iyileştirmeler uygulanır ve elde edilen ortalama göre ve nihai bir yapı üretmek için bir araya getirilmektedir.
Rafine etme yaklaşımı Jsubtomo paketten programları kullanılarak gösterilmiştir. Bsoft paketi 28 dan programları genel görüntü p kullanılırrocessing görevler ve moleküler grafik paketi ucsf Chimera 29 sonuçlarını görselleştirmek için kullanılır. Italik ve dosya formatları verilmiştir bireysel programların adları büyük dosya adı uzantıları ile gösterilir.
Şekil 1:.. Pleomorfik membran virüslerden başak kompleksleri glikoprotein yapıları belirlemek için genel strateji numaraları Protokolde farklı bölümlere karşılık bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
1. Tam boyutlu tomografi den Virüs Alt hacimleri ayıklanıyor
- Tomogramları elle virüs parçacıkları seçin.
- Bshow bir tomogram dosyasını açın. Merkezi bir virüs partic koordinatı tanımlayınle parçacık-toplama aracını kullanarak. Tüm virionları işlendikten kadar bu adımı tekrarlayın. Kaydet virüs STAR dosyasında koordinatları.
- Tüm tomografi işlendikten kadar adımı tekrarlayın 1.1.1. Piksel viryonu çapı not edin.
NOT: sivri ("80,10000 -bandpass" parametresi) 80-Å çözünürlüğü tomogram filtre, tomogramları görmek low-pass için bfilter kullanmak zor ise.
- Bireysel hacim dosyaları virionu alt birimleri ayıklamak için özü modunda (parametre "--mode özü") jsubtomo.py çalıştırın. Input dosyaları olarak adımda 1.1.1 kaydedilen YILDIZ dosyaları kullanın.
- Veri kümesindeki en büyük viryonunun% 25 daha büyük bir boyut (parametre "--size") ~ verin. Örneğin, viryonu çapı ~ 200 piksel, kullanım boyutu 250 x 250 x 250 piksel ise.
- Virion hacimleri Çıkış dosyaları MAP-formatında olacak. Ayrıca, (parametrede her virionu hacmi için beraberindeki YILDIZ-dosyası oluşturmakter "--output").
- (Parametre "-rescale 0,1") bimg içinde virionu hacimleri normalleştirmek.
İki Bağımsız İlk Modellerinin 2. Nesil
- Viryonu alt-hacimleri sivri bir alt kümesini seçin.
- Bshow bir virionu alt ses MAP dosyasını açın. Merkez Araç penceresinden erişilebilir parçacık-toplama aracını kullanarak bir başak koordinat tanımlayın. Tüm açıkça farklı kramponları işlendikten kadar bu adımı tekrarlayın. Kaydet başak STAR dosyasında koordinatları.
- Gerekirse, yaklaşık 200 glikoprotein kramponları işlendikten kadar diğer virionlann için adımı 2.1.1 tekrarlayın. Piksel başak boyutları unutmayın.
Not: ~ 200 sivri kaba bir kılavuz ve daha fazla, bazı uygulamalar için gerekli olabilir. Mümkünse, farklı yönlerde ani almak hedefliyoruz. Sadece top görüşlerini toplayıp kaçının.
- Jviews.p çalıştırarak sivri bir ilk görünüm vektör atamaY. Input dosyaları olarak adım 2.1.1 üretilen YILDIZ dosyaları kullanın.
NOT: Bu, vektör virion referansla başak yönünü yakındır.- Merkezi bir küresel viryonun için görüşlerini atamak için koordinat kullanın. Viryon 250 x 250 x 250 piksel boyutu ile bir kutu (adım 1.2) sonra ortasında ise, örneğin, koordinat merkezinden 125125125 piksel (isteğe bağlı "--Radial 125125125") 'dir.
- , Ipliksi bir viryonun için görüşlerini atamak girdi dosyası olarak adım 2.1.1 tanımlanan YILDIZ dosyasını kullanarak bshow her virionu alt seviyesini açmak için. Filament toplama aracını kullanarak filamanın iki uç noktalarını tanımlayın ve YILDIZ dosyayı kaydedin. Tüm YILDIZ dosyaları güncellendi kadar bu adımı tekrarlayın ve giriş dosyaları (--option Segment) olarak güncellenen YILDIZ dosyalarını kullanarak jviews.py çalıştırın.
- Jsubtomo_create_mask.py kullanarak gerçek bir uzay maskesi oluşturmak. Gerçek uzay maske aynı DIMENS olmasını sağlamakortalama yapı için kullanılmasına bağlı olarak, iyonlar (2.6.2) ve sivri ucu ve altta yatan zarın bir yama her ikisini de içerir için yeterince büyüktür.
- Jsubtomo_create_wedgemask.py kullanarak karşılıklı uzay maskesi oluşturmak. Karşılıklı uzay maskesi tek eksen tomografik veri toplama kaynaklanan 'kayıp kama' bölgede bölgeleri dışlamak için kullanılır. (2.6.2) ortalama yapı için kullanılmasına bağlı olarak, aynı boyutlarda olduğundan emin olun.
- Jsubtomo_evenodd.py ve adım 2.2 oluşturulan YILDIZ dosyalarını kullanarak "1" ve "2" setlerine ait viryonlarını tanımlayan bir seçim dosyasını (SEL dosyası) oluşturun.
- Jsubtomo_create_averages.py kullanarak ilk iki ortalamalar oluşturun.
- Girdi dosyası olarak adım 2.5 oluşturulan SEL dosyasını kullanın.
- Bir boyut (parametresi "--size") sivri en büyük boyutundan daha büyük, en az 32 piksel. Örnek başak olması gibi bir durumda ~ 40 piksel uzunluğunda ver, Kullanım boyutu 72 x 72 x 72 piksel.
- Başak uzun ekseni etrafında silindirik ortalama yaklaştığı, yüksek ortalamalara göre simetri (örneğin, C100) (parametre "--symmetry c100") uygulayın. İlk ortalamalara gürültüyü azaltmak için symmetrization kullanın.
- Projenin (parametresi "--suffix") çıkış dosyaları için benzersiz bir ad sağlayın.
- (Background parametresini "--mask") uzak maskelemek için adım 2.3 oluşturulan gerçek uzay maskesi kullanın. Eksik bir takozun (parametresi "--Mask") mevcudiyeti ile ortaya sinyal kayıplarını telafi etmek için adım 2.4 oluşturulan karşılıklı boşluk maskesi kullanın.
3. Altın standart iteratif Hizalama ve İki Başlangıç Spike Modelleri ortalamasının
Iteratif hizalamak ve jsubtomo_iterate_gold.py ile 2. bölümde oluşturulan ilk iki model ortalama.
- Evre I. Bu aşamada hedefi rafine etmekgörünümü vektör yönü. Girdi dosyası adım 2.5 oluşturulan SEL dosyasıdır.
- (Parametre "8,8,8 --angles") 8 derecelik açısal örnekleme kullanın.
- (Parametre "16 --thetaphilimit") başak görünümü vektörü yönünde 16 derecelik değişiklikler izin ama başak uzun eksen sabit (parametre "--alphalimit 0") etrafında açıyı korumak.
- Küçük öteleme vardiya (örneğin, 5 piksel) manuel sivri Piklemede yanlışlıklar için hesap ver (parametre "--shiftlimit 5").
- Başak uzun ekseni etrafında silindirik ortalama yaklaştığı, yüksek ortalamalara göre simetri (örneğin, C100) (parametre "--symmetry c100") uygulayın.
NOT: Symmetrization ortalamalara gürültüyü azaltmak için kullanılır. - Eksik kama (parametreler "--M için çevredeki ani ve hesabı uzak maskelemek için gerçek bir uzay maske ve adımları 2.3 ve 2.4 oluşturulan karşılıklı uzay maskesi kullanınsırasıyla "ve" --Mask ",) isteyin.
- 2.6 oluşturulan iki MAP dosyalarını kullanın ("hatta" etiketleri ile gösterilir ve dosya adı "garip") (sırasıyla parametreleri "--Template1" ve "--Template2") şablonları gibi.
- Hizalama yanlılığı önlemek için 50-Å çözünürlük (parametre "--resolution") bir alçak geçirgen filtre uygulayın.
- Arıtma ("2 --bin" parametresi) hızlandırmak için 2 bin bir faktör uygulayın.
- ("1 --lastiter 5 --firstiter" parametreleri) hizalama ve ortalama 5 prototipi.
- Evre II. Bu aşamanın amacı görünümü vektörü etrafında açısını rafine etmektir. Girdi dosyası aşama 3.1.9 den çıktı SEL dosyasıdır.
- Adım 3.1.9 son yineleme üretilen düşük geçişli filtrelenmiş MAP dosyası açarak başak doğru boyutlarını ölçün bshow olarak (dosya etiketi "_lp" ile gösterilir). Yeni bir gerçek oluşturunuzay maske benzer başak tanımlar ancak zar ve komşu sivri çoğu hariç 2.3 adıma.
Not: Maskenin ideal boyutu büyüklüğüne ve başak özelliklerine bağlıdır. - Daha önce olduğu gibi (parametre "8,8,8 --angles") 8 derecelik açısal örnekleme kullanın.
- Başak görünümü vektörü ("- alphalimit 180" parametresi) etrafında açı 180 derecelik bir değişiklik yapılmasına izin ama teta tutmak ve phi açıları sabit (parametre "0 --thetaphilimit").
- Herhangi bir öteleme vardiya izin vermeyin (parametre "0 --shiftlimit").
- Ortalamalarının (parametre "--symmetry" ihmal) herhangi bir simetri geçerli değildir.
- Eksik kama için hesap adım 2.4 oluşturulan karşılıklı uzay maskesi kullanın.
- Simetri olmadan adım 3.1.9 son tekrarında oluşturulan iki MAP dosyalarını kullanın şablonları (parametreleri olarak R (etiketleri dosya adı "even_nosym" ve "odd_nosym" ile gösterilen)20, - Template1 "ile" --Template2 ").
- Hizalama yanlılığı engellemek için birinci tekrarda 50-Å çözünürlük (parametre "--resolution") bir alçak geçirgen filtre uygulayın. Iki bağımsız ortalamalar arasındaki otomatik altın standart Fourier Shell İlişkisi (FSC) dayalı (parametre "--adaptivefilter") sonraki yineleme filtre parametrelerini ayarlayın. 0.143-ölçütünü kullanın (parametresini "0.143 --fsccrit"). CTF düzeltme tomogramları uygulanan sürece, kontrast transfer fonksiyonu (CTF) (parametre "--minhires") ilk sıfır geçmiş arıtma izin vermeyin.
- (Örneğin, parametreleri "6 --lastiter 15 --firstiter") uyum 5-10 prototipi ve ortalama. Bildirilen kararda değişiklikleri izlemek. Önemli bir değişiklik bakıldığında, süreç durdurulabilir.
- Adım 3.1.9 son yineleme üretilen düşük geçişli filtrelenmiş MAP dosyası açarak başak doğru boyutlarını ölçün bshow olarak (dosya etiketi "_lp" ile gösterilir). Yeni bir gerçek oluşturunuzay maske benzer başak tanımlar ancak zar ve komşu sivri çoğu hariç 2.3 adıma.
- Examini tarafından yapının simetri derecesini değerlendirmekbaşak bir trimerik karmaşık ise, kuruntu. Örn olarak (dosya etiketi "_lp" ile gösterilir) ortaya çıkan düşük-geçişli filtrelenmiş MAP dosyası ng, 3-katlı simetri belirgin olmalıdır.
- Evre III. Bu aşamanın amacı doğru simetri ile daha fazla görünümü vektörü etrafında açısını rafine etmektir. Girdi dosyası aşama 3.2.9 den çıktı SEL dosyasıdır. Parametreler, birkaç istisna dışında aşama 3.2 'de aynıdır:
- Başak görünümü vektörü etrafında açısındaki uygun değişiklikleri izin ver. Örneğin, yapı 3-katlı bir simetriye sahip ise, (parametresi "60 --alphalimit"), alfa açısı 60 derece arasında değişiklik sağlar.
- Ortalamalarının (parametre --symmetry c3 ") üzerine doğru simetriyi (örneğin, c3) uygulayın.
- Girdi şablonu dosyaları (parametreleri "--Template1" ve adım 3.2.9 (dosya adı "hatta" etiketleri ile gösterilir ve "garip") son tekrarında oluşturulan iki MAP dosyalarını kullanın --Template2).
- (Örneğin, parametreleri "16 --lastiter 25 --firstiter") uyum 5-10 prototipi ve ortalama. Bildirilen kararda değişiklikleri izlemek. Önemli bir değişiklik bakıldığında, süreç durdurulabilir.
- Evre IV. Bu aşamanın amacı doğru aynı anda her üç açıları rafine etmektir. Girdi dosyası aşama 3.4.4 den çıktı SEL dosyasıdır. Parametreler, birkaç istisna dışında adım 3.4 olarak aynıdır:
- Başak görünümü vektörü ("- alphalimit 8" parametresi) açıyla 8 derecelik bir değişiklik yapılmasına izin ve başak görünüşüdür vektörü yönünde 8 derecelik değişikliği (parametresi "8 --thetaphilimit"). 4-derece doğrulukla yönelimleri rafine (parametreler "8,8,8 --iterate 2 --angles").
- (Parametre "5 --shiftlimit") küçük kaymaların (örneğin, 5 piksel) Önceki hizalama adımda yanlışlıklar hesaba izin verin.
- UAdım 3.4.4 son tekrarında oluşturulan iki MAP dosyaları ("hatta" etiketleri ile gösterilir ve dosya adı "garip") giriş şablon dosyaları (parametreleri "--Template1" ve --Template2) gibi se.
- (Örneğin, parametreleri "26 --lastiter 35 --firstiter") uyum 5-10 prototipi ve ortalama. Bildirilen kararda değişiklikleri izlemek. Önemli bir değişiklik bakıldığında, süreç durdurulabilir.
Şablon Eşleştirme için Virüs Yüzey için tohumları 4. Nesil ve Uyum
- Şablon eşleme için viryonu yüzeyi üzerinde eşit bulunan tohum üretmek ve jviews.py çalıştırarak tohumlara bir başlangıç görünüm vektörü atayın. Input dosyaları olarak adım 1.2.2 üretilen YILDIZ dosyaları kullanın. Sivri beklenen sayıdan yaklaşık 1,5 kat daha fazla tohum üretir.
NOT: Bu görünüm vektör her tohum noktasına yakın başak yönünü yakındır.- Kabaca küresel viryonunun (parametre "--Even") üzerine eşit dağıtılmış tohumları oluşturmak için, ("--radius" parametresi) açısal ayırma tohumların (örneğin, 20 derece) (parametre yarıçapı verir "20 --angle" ) ve merkezi virionun koordinat örn., viryon 250 x 250 x 250 piksel boyutu ile birlikte bir kutunun içinde aşama 1.2) sonra (ortasında ise, merkezi koordine) "125125125 --origin" 125125125 piksel (seçenektir .
- Ipliksi bir parçacığın üzerinde eşit dağıtılmış tohumları oluşturmak için, "--Filament" parametresini kullanın ve yarıçapı ve sarmal simetri parametrelerini (artış ve büküm) hem de belirtin.
NOT: sarmal simetri parametreler sadece eşit dağıtılmış tohum pozisyonları tanımlayan uygun bir yol olarak burada kullanılan ve lifte sivri gerçek sıralamasını yansıtması gerekmez.
- Açıklayabilecek gibi virüs yüzeyinin iki bağımsız ortalamalar oluşturmak2. Bölümde d.
- Jsubtomo_evenodd.py ve adım 4.1 oluşturulan YILDIZ dosyalarını kullanarak "1" ve "2" setlerine ait viryonlarını tanımlayan bir SEL dosyası oluşturun.
NOT: veri setlerinin bağımsızlığını, gruplar halinde viryonlann herhangi bir önceki atama sağlamak için "1" ve "2" aynı kalmalıdır.
- Jsubtomo_evenodd.py ve adım 4.1 oluşturulan YILDIZ dosyalarını kullanarak "1" ve "2" setlerine ait viryonlarını tanımlayan bir SEL dosyası oluşturun.
- Tohumların konumunu geliştir.
- Aksi belirtilmedikçe adımda 3.1 yönergeleri izleyin. Girdi dosyası olarak adım 4.2.1 üretilen SEL dosyasını kullanın.
- Tohumlar membran (parametresi "--zshiftlimit") için normal boyunca sadece kaymasına izin. Virionları İdeal küresel geometri sapma ne kadar bağlı kayma izin miktarını ayarlayın (örneğin, parametre "25 --zshiftlimit).
- Adım 4.2 oluşturulan iki MAP dosyalarını kullanın --Tem "girdi şablonu dosyaları (parametreleri olarak (" hatta "etiketleri ve dosya adı" garip "olarak adlandırılmıştır)plate1 "ve --Template2).
- (Örneğin, parametresi "--suffix _seeds") orijinal giriş YILDIZ dosyaların üzerine yazılmasını önlemek için benzersiz bir sonek kullanın.
- Hesaplama ("4 --bin" parametresi) ve low-pass filtre hızlandırmak için 4 binning kullanın (örneğin, parametresi "--resolution 50").
- (Parametre "--cmm") jviews.py kullanarak rafine tohum YILDIZ dosyaların Chimera işaretleyici dosyaları (CMM) oluşturun. . Kimerada CMM dosyaları (ve ilişkili virion MAP dosyaları) açarak tohumları inceleyin rafine tohumlar virüs zara doğru göreli hizalanmış olduğundan emin olun.
Not: Farklı renkler belirteçlerin ayrı ayrı kümeler (parametresi "color") ayırt etmek için kullanılabilir. Alternatif rafine belirteçlerin çapraz korelasyon katsayısı (örneğin, parametresi "--fomcolor 0.1,0.3") dayalı renkli olabilir.
5. Altın-standıard Iterative Hizalama ve Spike Yapısı ortalamasının
Otomatik rafine tohumların etrafında yerel şablonu kullanarak eşleme viryonu alt birimlerde bütün sivri bulmak ve hizalayın ve yer ani ortalama. İlk şablon olarak elle aldı sivri bir alt oluşturulan ortalamalar kullanın.
- Program jsubtomo_iterate_gold.py kullanarak tüm ani ortalamasına tohumların etrafında yerel şablon eşleştirme gerçekleştirin. Aksi belirtilmedikçe adımda 3,5 yönergeleri izleyin.
- Girdi dosyası adım 4.3 oluşturulan rafine tohumlar için SEL dosyasıdır.
- Görünümü vektör açısı için yeteri kadar büyük bir kullanım limiti. Tohumlar her 20 derece (adım 4.1) üretilir olsaydı Örneğin, bir bu değerin yarısından biraz daha büyük bir açı (parametre "12 --thetaphilimit") kullanın. Başak görünümü vektörü etrafında açısındaki uygun değişiklikleri izin ver.
- (Parametre tohum zarının düzlemine kaydırmaya izin"--xyshiftlimit"). Tohum-to-tohum mesafesi 25 piksel ise Örneğin, toplam örneğin bu yarısından (biraz daha fazla kayma, parametreleri kullanmak "--shiftlimit 6 --xyshiflimit 10").
Not: Aşama 3.5 üretilen MAP içerik tohumların daha viryon merkezinden farklı bir mesafede ortalanır, ek çeviri değişimleri ve miktarları gerekli olabilir. - Adım 3.5 oluşturulan iki MAP dosyalarını kullanın ("hatta" etiketleri ile gösterilir ve dosya adı "garip") girdi şablonu dosyaları (parametreleri "--Template1" ve --Template2) gibi.
- Adım 3.5 (parametre --resolution) üretilen MAP dosyaları geçerli çözünürlüğü kullanın.
- ("1 --lastiter 10 --firstiter" örneğin, parametreleri) şablon eşleştirme, uyum ve ortalamanın 5-10 yineleme çalıştırın. Bildirilen kararda değişiklikleri izlemek. Önemli bir değişiklik bakıldığında, süreç durdurulabilir.
- Sonra her bir yinelemenin, Örtüşen hit hariç. Başak genişliği 30 piksel ise Örneğin, diğer hitleri (parametre "--mindist 30") daha yakın 30 piksel olan hit hariç.
- Co-verimli, düşük çapraz korelasyon hit hariç. Örneğin, her bir virion (parametresi "--topp 75"), en iyi% 75 sivri uçları vardır.
NOT: Bir düşük çapraz korelasyon katsayısı ile tıklanma yanlış pozitif hit temsil muhtemeldir.
Sonuçların 6. Görselleştirme
- Görselleştirme için kimerada başak rafine yapısını açın ve atomik yapıların uydurma.
- Girdi dosyası olarak adım 5.1.6 son tekrarında oluşturulan (tag "lp" olarak adlandırılmıştır) düşük geçişli filtrelenmiş MAP dosyasını kullanın.
- Aracı "Harita Fit" kimerada uydurma merkezli çapraz korelasyon için adım 5.1.6 belirtilen çözünürlüğü kullanın.
- Virio bir bileşik modeli oluşturunN jsubtomo_create_model.py kullanılmıştır.
- Için giriş MAP dosyası olarak adım 5.1.6 son tekrarında oluşturulan (tag "lp" olarak adlandırılmıştır) düşük geçişli filtrelenmiş MAP dosyası kullan (parametre "--Template").
- Giriş YILDIZ dosyası olarak adım 5.1.6 son tekrarında oluşturulan STAR dosyası kullanın.
- Kompozit modeli (parametre "--mask") içindeki yoğunluklara örtüşen hesap adım 3.2.1 oluşturulan maske dosyasını kullanın.
- Aynı boyutta bir kompozit modeli (parametresini "--size") oluşturmak için viryonu MAP dosyasının boyutunu belirtiniz.
- Kimerada görselleştirme için kompozit modeli açın.
Representative Results
Biz 24 set daha önce yayınlanmış verileri kullanılarak Bunyamwera virüsü (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) zarf glikoprotein kompleksi için yukarıda belirtilen alt tomogram ortalama iş akışı uygulama göstermektedir. Veri toplama ve arıtım parametreleri izleyen Tablo 1 'de listelenmiştir. Bir temsilci tomogram, Şekil 2'de gösterilmiştir.
| Parametre (birim) | Değer |
| Veri toplama | |
| Gerilimi (kV) | 300 |
| Kalibre büyütme (X) | 111.000 |
| Piksel boyutu (Å) | 5.4 |
| Tahmini doz (e - / Å 2) | 100 |
| Underfocus (um) | 4.0-4.5 |
| İlk CTF sıfır (Å) bir | 26-30 |
| Eğim aralığı (°) | -60-60 |
| Tilt örnekleme (°) | 3 |
| Veri ve arıtma | |
| Tomografi | 11 |
| Virionları | 29 |
| Viryonunun başına Tohumlar | 106 |
| Tohum sayısı | 3.074 |
| Spike tespit | 1.346 |
| Örtüşmeler çıkarıldıktan sonra ani | 1.401 |
| Çapraz-korelasyon sivri tabanlı değil seçimi | 1.022 |
| Spike son ortalamaya dahil | 1.022 |
| Simetri | C3 |
| Açısal örnekleme (°) | 8 |
| Çözünürlükarıtmada kullanılan aralığı (Å) | 42-334 |
| Nihai çözünürlük tahmini (a) b | 35 |
Tablo 1: Bunyamwera veri toplama ve arıtma istatistikleri.
Bir CTF, kontrast transfer fonksiyonu.
b 0.143 bir eşik iki bağımsız rafine yapılar arasındaki Fourier kabuk korelasyon kullanılarak hesaplanmıştır.
Şekil 2:. Bunyamwera virionlann bir tomografisinde yoluyla Dilim her viryonunun çevresi belirgin Çeşitli başak yan görüntüleridir ok uçları ile gösterilir. Tomogram 60 Â Filtresinde düşük geçiş olmuştur. Ölçek çubuğu 100 nm.
Öncelikle, biz 205 elle aldı sivri kullanarak bir başlangıç modeli (rafine
Şekil 3: ilk şablon yapısı iyileştirildi. (A) Silindir şeklinde sivri elle tanımlanmış pozisyonlarda inşa (C100) şablonu ortalama. (B) Ortalama yoğunluğu arıtma beş tur sonra herhangi bir simetri olmadan (C1), üç kat ile görüntüler bir başak empozesimetrik özellikleri. Modelin çözünürlüğü 48 Å. Başak (C) Ortalama üç kat simetri ile arıtma beş turdan sonra 41 Å de çözüldü.
Şekil 4:.. Tohumların Arıtma ab) A, (daha önce tohumların bir alt) ve sonra (B) 'arıtma Şekil 2' den bir viryon yoğunluğuna (B) 'de gösterilmektedir tohumlar olmuştur renk kodlu ilgili Çapraz göre korelasyon katsayıları (mavi, düşük korelasyon; kırmızı, yüksek korelasyon).
(Örtüşmelerin çıkardıktan sonra üst% 75; ~ 1,000 kramponları) iyi correlating glikoprotein başak yamalar son ortalamasını hesaplamak için kullanıldı. Ortalama 35-Å çözünürlük (Şekil 5) karar verildi. Bu, ortada bir trimetik başak yapı ortaya çıkardıaltı komşu sivri bazı katkı ilave. Bilinen pozisyonlarda yapısını yerleştirerek hesaplanan virionlar, kompozit modelleri, viryon yüzeyi (Şekil 6) üzerine sivri yerleştirilmesini saptandı. Bazen, sivri yerel emretti yamalar (Şekil 6B) belirgindir.
Şekil 5: şablon eşleştirme sonra glikoprotein başak tabakasının bir yama Rafine yapısı. (AB) 'bile' ve 'garip', verilerin iki yarısı yeniden inşa İki haritalar gösterilmektedir. Iki harita yaklaşımın validness doğrulayan bir benzerlik dikkat çekici derecesini göstermektedir. Iki harita birbirinden bağımsız olarak tamamen yeniden inşa edilmiş olarak başak uzun ekseni etrafında yönelim farklı. Iki harita (C) ortalama ile gösterilir35 Å nihai kararı.
Şekil 6: Bunyamwera virion üzerindeki sivri Yerleştirme. (A), viryonun Bileşik modeli. Görünüm vektörleri (sopa) sivri yönelimleri göstermektedir. Renkler her başak ve şablon yapısı (mavi, düşük korelasyon; kırmızı, yüksek korelasyon) arasındaki çapraz korelasyon göstermektedir. Sivri bir sipariş yama (B) A close-up.
Discussion
Viryon membran viral glikoprotein başak yapısının ortaya çıkarılmasıyla, virüs kopyalanmasını anlamak ve tedavi etmek ve enfeksiyonu önlemek için terapötik maddelerin geliştirilmesi için esastır. Tek bir parçacık ortalama ile bir araya Elektron mikroskobu kriyo-glikoprotein dahil olmak üzere sivri zarflı virüs partiküllerinin, yapılarını çözmek için en çok kullanılan yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem, simetrik virüsleri icosahedrally sınırlıdır. Burada, Jsubtomo elektron cryo-tomografi ve subtomogram ortalamanın uygulaması ile, biz pleomorfik diğer mevcut yapısal biyoloji yöntemleri uygun değildir virüsleri glikoprotein sivri zarflı belirlenmesi için genel bir protokol ana hatlarıyla. Bizim için temsili sonuçlar, bu yöntemin çözünürlüğü etki mimari, oligomerizasyonu ve sağlam viryonları üzerindeki glikoprotein sivri yüksek dereceli kuruluşa bakış açısı ortaya çıkarmak için yeterli olduğunu göstermektedir.
jove_content "> Bu protokol çerçevesinde en kritik adım, bu aşamada başka. Başarılı yürütme glikoprotein kramponları, böylece yeterince büyük ve çok sıkı birbirlerine karşı değil dolu olduğunu varsayar birinden istatistiksel olarak bağımsız iki güvenilir bir başlangıç modelleri oluşturmak bireysel sivri yapabilirsiniz görsel tanınan ve el tomogramları toplanmış ve iki bağımsız modelleri ortalaması alınmalıdır., bu mümkün değilse, protokol iki değişiklik teşebbüs edilebilir. Birincisi, iki bağımsız random modeller sonra ilk subtomograms rastgele iki alt kümelerini tanımlama ve inşa edilebilir Bu alt-gruplar içinde 30 subtomograms ortalama. İkinci olarak, izole edilmiş bir sivri yapı, X-ışını kristalografisi ile, örneğin başka yollarla elde edilmiş olsa bile, bu başlangıç modeli olarak kullanılabilir. Ancak, bakım, düşük alınmalıdır arıtmanın bir sonraki turda olacak iki sonuçlanan modelleri gibi, düşük çözünürlüklü cut-off (50-70 Å) kullanarak filtreyi Bu modeli geçmekSadece bu çözünürlükte ötesinde istatistiksel bağımsız olması. Bu ihtar nedeniyle, eski yaklaşım tavsiye edilir.Bu protokol elde çözünürlük, dört ana faktöre bağlıdır: i. veri toplama stratejisi ve girdi verilerinin kalitesi, ii. subtomograms sayısı, III. hizalama subtomograms doğruluğu ve iv. yapıların heterojen. Birinci ve ikinci sınırlama, büyük ölçüde yüksek sinyal-gürültü doğrudan elektron CTF ile kombine dedektörleri tomografi giderilmiştir ve otomatik veri toplanmasını kullanılarak aşılabilir birlikte, hizalama hassasiyeti daha da ilgi kendisinin yapısının boyutu ve şekli etkilenir. Belirgin özellikleri göstermeyen küçük sivri bu protokolü uygulanır, bu hizalama doğruluk ve böylece çözünürlüğü arttırmak için 31 sivri Fab fragmanlarını bağlamak için avantajlı olabilir. Son olarak, bu yapılar için ortalama halinde sergi çoklu biçimlerde, alt-tomam sınıflandırma yöntemi ayrıca farklı konformasyonlara ortalama için kullanılabilir. Bu amaçla, Jsubtomo güçlü subtomogram sınıflandırma 9 sunan, Dinamo paketi ile bütünleştirir.
Yukarıdaki protokol izole edilmiş viral glikoproteinler de, X-ışını kristalografisi tamamlayıcıdır. Kristalografik yapılar viryon zanna göre glikoproteinin Tam bir yönlendirme elde etmek için alt-tomogram ortalamalar içine monte edilebilir. Bu metodolojinin uygulama şüphesiz zarflı virüs yapısında ve patobiyolojisi üzerine ışık tutmaya devam edecektir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
| Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
| UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |
References
- Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography. Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).
- Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography. Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).
- Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly. Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).
- Grünewald, K., et al. Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography. Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).
- Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor. Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).
- Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
- Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft. Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).
- Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).
- Fernández, J. J. Computational methods for electron tomography. 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).
- Briggs, J. A. G. Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging). Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).
- Frangakis, A. S., et al. Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).
- Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ. PLoS pathogens. 2 (8), (2006).
- Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers. Nature. 455 (7209), (2008).
- Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
- Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).
- Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids. Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).
- Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).
- Arranz, R., et al. The structure of native influenza virion ribonucleoproteins. Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).
- Karotki, L., et al. Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold. Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).
- Pietilä, M. K., et al. Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea. Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).
- Huiskonen, J. T., et al. Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses. Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).
- Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike. PLoS pathogens. 9 (5), (2013).
- Maurer, U. E., et al. The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction. Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).
- Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes. Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature. 9 (9), 853-854 (2012).
- Heymann, J. B., Belnap, D. M. Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy. Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).
- Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. Visualizing density maps with UCSF Chimera. Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).
- Faini, M., et al. The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions. Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).
- Wu, S., et al. Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins. Structure. 20 (4), London, England. 582-592 (2012).
