Bakteriyel için iki bileşenli Düzenleme Sistemleri Gen Hedefler belirlemek için DNA afinite-saflaştırılmış Chip (DAP-chip) Yöntem
Summary
Bu video makalede, iki bileşenli bir sistem yanıt düzenleyici gen hedef ve birleştirme bölgelerini belirlemek için bir in vitro mikro-dizi göre bir yöntem açıklanır.
Abstract
Böyle chip çip gibi in vivo yöntemlerde transkripsiyon faktörleri için küresel gen hedefleri tespit etmek için kullanılan iyi bilinen tekniklerdir. Bununla birlikte, aktivasyon koşulları karakterize edilmemiş bakteriyel, iki bileşenli düzenleyici bir sistem keşfetmek kısıtlı kullanımı vardır. Benzersiz sinyallerin varlığında kullanıldığı zaman bu tür sistemler sadece transkripsiyonunu düzenler. Bu sinyaller genellikle bilinmediği için, bu video makalede tarif edilen in vitro mikro-dizi göre yöntem gen hedefleri ve tepki düzenleyicileri için birleştirme bölgelerini belirlemek için kullanılabilir. Bu DNA-afiniteyle saflaştırılmış yongalı yöntem Sıralı bir genomu olan, herhangi bir organizmanın herhangi bir saflaştırılmış kontrolü için kullanılabilmektedir. Protokol arıtıldı etiketli protein özel bir fayans dizisine DNA'nın melezleşme ve floresan etiketleme ve ardından protein-bağlı DNA, kesilmiş genomik DNA'ya bağlanan ve daha sonra afinite saflaştırılması için izin içerir. Öz dirençli için tahlil optimize etmek için kullanılabilir olan adımlarıc düzenleyiciler de tarif edilmektedir. Dizi veri analizi ile üretilmiştir Tepeler daha sonra, deneysel olarak doğrulanmış bağlanma yeri motifleri, tahmin etmek için kullanılır. Motif tahminler daha yakından ilgili türlerinde ortolog yanıt düzenleyici gen hedeflerini belirlemek için kullanılabilir. Böylece, bu genin tespiti ve hedef sitesi motifleri bağlanması ve bu nedenle, çevresel bir bakteri Desulfovibrio vulgaris Hildenborough bir sigma54 bağımlı tepki regülatör DVU3023 fonksiyonunu tahmin bu yöntemin uygulanabilirliğini göstermektedir.
Introduction
Hayatta kalmak ve gelişmek için bakterilerin yetenek ki algılarlar ve kendi ortamlarında tedirginlikler cevap verebilecek kadar iyi kritik bir şekilde bağlıdır, ve bu da onların sinyal iletimi sistemlerine bağlıdır. Sinyalizasyon sistemleri bir bakteri kodlar sayısı onun "mikrobiyal IQ" adı olmuştur ve çevresinin değişkenliği ve çoklu sinyallerini algılayan kabiliyeti ve ince ayar onun tepki 1 hem de bir göstergesi olabilir. İki bileşenli sinyal iletim sistemleri (ASR) bakteriler tarafından kullanılan en yaygın sinyal sistemleri de vardır ve bunlar, harici sinyali algılar ve bir efektör yanıt düzenleyici (RR) 2 fosforilasyon yoluyla ileten bir histidin kinaz (HK) oluşur. RR bir çıkış alanlarının çeşitliliği ve böylece farklı efektör modları olabilir, ancak en yaygın tepki alanı 1 bağlayıcı bir DNA aracılığıyla transkripsiyon düzenlemedir. Algılanan sinyaller ve vaz ilgili fonksiyonlarıntestis kanseri yaşayanlarının t çoğunluğu hala bilinmiyor.
Böyle chip yonga gibi in vivo yöntemler rutin olarak transkripsiyon faktörleri 3 genomik bağlanma sitelerinin belirlenmesi için kullanılır, ancak aktive etme koşulları veya sinyaller bilinmektedir, bunlar sadece bakteriyel iki bileşenli sistem RR için kullanılabilir. Genellikle bir TCS etkinleştirmek çevre ipuçları kendi gen hedefleri belirlemek daha zordur. In vitro mikro-dayalı tahlil, burada açıklanan etkili ve hızlı bir şekilde gen hedefleri tespit etmek ve testis kanseri yaşayanlarının fonksiyonları tahmin etmek için de kullanılabilir. Bu deney, RR fosforile ve bu nedenle asetil fosfat gibi 4 küçük molekül vericiler kullanılarak in vitro aktive edilebilir gerçeğinden yararlanır.
Bu yöntemde, DNA-afiniteyle saflaştırılmış yonga (Şekil 1) için DAP-chip adlı, ilgi konusu gen RR E'de bir His-tag ile klonlanır coli ve daha sonra saf hale etiketli protein bi bırakılırnd kesilmiş genomik DNA için. Protein-bağlı DNA, daha sonra afinite saflaştırma ile zenginleştirilmiştir, zenginleştirilmiş ve giriş DNA çoğaltılır, floresan bir araya toplanmış ve özel ilgilenilen organizmadan (Şekil 1) için yapılan bir fayans dizisine hibridize etiketli. Mikrodizi deneyler eserler tabidir ve bu nedenle ek adımlar tahlili optimize etmek için kullanılır. Böyle bir adım (Şekil 2 iş akışını bakınız) elektroforetik mobilite kayma analizleri (EMSA) kullanarak çalışma kapsamında RR için bir hedef belirlemek için teşebbüs etmektir. Sonra, genomik DNA ve DAP adımları bağlanma ardından, protein-bağlı olduğu ve bu nedenle giriş DNA için uygun bağlama koşulları teyit pozitif hedef giriş fraksiyonuna göre protein-bağlı fraksiyon içinde zenginleştirilmiş olup olmadığını görmek için qPCR incelenir RR (Şekil 2). Dizi Hibritlemeden sonra, veri genomik lokus gösteren yüksek yoğunluğu sinyalinin tepe noktaları bulmak için analiz edilmektedir burada protein hreklam bağlı. Fonksiyonlar elde gen hedeflere göre RR için tahmin edilebilir. Hedef genomik loci sonra deneysel EMSA (Şekil 2) kullanılarak doğrulanır bağlanma sitesi motifleri, tahmin etmek için kullanılır. RR için fonksiyonel tahminler ve gen hedefleri sonra yakından benzer bağlama motifleri için olanlar genomları (Şekil 2) tarayarak orthologous RR'lerle kodlamak ilgili türlerinde uzatılabilir. DAP-çip yöntemi daha önce yok oldu, bir TCS için bilgi hazinesi sağlayabilir. Yöntem, aynı zamanda, protein saflaştırılabilir ve DNA bağlanma şartları tespit edilebilir, herhangi bir kopyalama düzenleyicisi için kullanılır ve bir genom sekansı ile çıkar organizma için uygun olabilir.
Şekil 1. DNA-afiniteyle saflaştırılmış yonga (DAP-chip) stratejisi 7. Ilgilenilen organizmadan RR geni, bir E bir karboksi-terminal His-tag ile klonlanır Coli suşu. Saflaştırılmış His-etiketli protein asetil fosfat ile birlikte fosforilasyon ile aktive edilir ve kesilmiş genomik DNA ile karıştırılır. Geri kalanı Ni-NTA reçinesi kullanılarak afinite saflaştırma işlemine tabi tutulur ise, bağlama reaksiyonunun bir alikosu, giriş DNA olarak kaydedilir. Giriş ve RR-bağlı DNA büyütülmüş bütün genom, ve sırasıyla Cy3 ve Cy5 etiketli. Etiketlenmiş DNA bir araya toplanmış ve daha sonra gen hedeflerini belirlemek için analiz edilir bir döşeme tadını hibridize edilir. Şekil değiştirilmiş ve Creative Commons License 7'den kullanılarak yeniden basıldı.
Iş akışı Şekil 2.. Özeti. Herhangi arıtılmış etiketlendi Protei içinn Emsa kullanarak bir hedef belirleyerek başlar. (WGA) ile zenginleştirilmiş ve giriş amplifiye DNA, genomik DNA ve DNA afiniteli saflaşır (DAP) ve tam genom bağlamak için protein izin verin. Bir gen hedef biliniyorsa, bilinen bir hedef proteine bağlı fraksiyonunda zenginleştirilmiş olmasını sağlamak için qPCR kullanın. Hiçbir hedef belirlenebilir olsaydı, DNA etiketleme ve dizi melezleme doğrudan geçin. QPCR zenginleştirme gözlenen olamazdı, o bağlayıcı protein-gDNA ve farklı protein miktarları kullanılarak DAP-WGA adımları tekrarlayın. Zirveleri bulmak ve genlerin hedef bunları eşleştirmek için dizi analizi kullanın. Bağlanma yeri motifleri tahmin etmek için, hedef genlerin yukarı bölgelerini kullanarak. Deneysel EMSA kullanarak motifleri doğrulayın. Çalışma altında RR ortologları kodlayan, ilgili türlerin genom taraması için motifi kullanarak ve aynı zamanda bu türlerin hedef genleri tahmin. Elde edilen gen hedeflere bağlı olarak, RR ve ortologlar fizyolojik işlevi tahmin edilebilir. Şekil değiştirilmiş ve yaratıcı c kullanarak yeniden basıldıommons 7'den lisans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan DAP çipli bir yöntemi başarılı bir şekilde temsil eden bir sonucu olarak burada gösterilen bir Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 birkaç RR için gen hedef belirlemek için kullanılmıştır. RR DVU3023 için, bir aday gen hedef seçerek kolay oldu. DVU3025 RR geninin hemen alt baş tarafında bulunur, ve RR ve hedef genlerin çeşitli Desulfovibrio türlerinde muhafaza edilir, ve buna ek olarak DVU3025 öngörülen sigma54 bağımlı promoteri bulunmaktadır….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz video çekimi için hazırlanıyor ona yardım için ve tekniği göstermek için Amy Chen teşekkür ederim. ENIGMA tarafından yürütülen bu çalışma: Genler ve Moleküler Meclisleri (http://enigma.lbl.gov) ile Ekosistemler ve Ağlar Entegre, Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı Bilimsel Odak Alanı Programı, Bilim, Biyolojik Ofisi Ofisi tarafından desteklenen Sözleşme No: DE-AC02-05CH11231 altında ABD Enerji Bakanlığı Çevre Araştırma,.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments |
| HisTrapFF column (Ni-Sepharose column) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5255-01 | |
| Akta explorer (FPLC instrument) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | ||
| HiPrep 26/10 Desalting column | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5087-01 | |
| Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28704 | |
| Biotin-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| 6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | EC63652BOX | Alternately, you can pour your own gel. |
| Nylon membrane | EMD Millipore, Billerica, MA, USA | INYC00010 | |
| Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3940 | |
| Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3967 | |
| UV crosslinker Model XL-1000 | Fisher Scientific | 11-992-89 | |
| Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce) | Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA | 89880 | |
| Ni-NTA agarose resin | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 30210 | |
| GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase ) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | WGA2-50RXN | |
| Nanodrop ND-1000 | Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA | For quantitation of DNA | |
| Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX | Quanta biosciences | 95055-500 | Any Sybr Green PCR mix may be used |
| PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR | Axygen | ||
| 96 well clear low profile PCR microplate | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | PCR-96-LP-AB-C | |
| Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | 4376600 | Any real time PCR system may be used |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28104 | Any PCR clean up kit may be used |
| Cy3/Cy5-labeled nonamers | Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA | N46-0001, N46-0002 | |
| Klenow polymerase 50,000U/ml, 3'-5' exo- | New England Biolabs, Ipswich, MA | M0212M | |
| Hybridization system | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used, |
| Custom printed microarrays and mixers | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| GenePix 4200A microarray scanner | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | This model has been replaced by superior ones | |
| GenePix Pro microarray software | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | ||
| Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
References
- Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
- Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).
- Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo. Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).
- McCleary, W. R., Stock, J. B. Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators. J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).
- Novichkov, P. S., et al. RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics. Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).
- Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes. Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).
- Rajeev, L., et al. Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium. Genome Biol. 12, 99 (2011).
- Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).
- Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts. J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).
- Bourret, R. B. Receiver domain structure and function in response regulator proteins. Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).
- Gao, R., Stock, A. M. Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity. Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).
- Hung, D. C., et al. Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation. J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).
- Ladds, J. C., et al. The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).
- Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).
- Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity. Genome Res. 15, 421-427 (2005).
- Gossett, A. J., Lieb, J. D. DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Mascher, T., et al. The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis. J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
- Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites. Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).
- Ho, J. W., et al. ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis. BMC Genomics. 12, 134 (2011).
- Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection. Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).
