DNA purificato per affinità Chip (DAP-chip) metodo per determinare obiettivi del gene per batterica, due sistemi di regolamentazione dei componenti
Summary
In questo articolo video descrive un metodo microarray basato in vitro per determinare gli obiettivi del gene e siti di legame per due regolatori di risposta del sistema dei componenti.
Abstract
Nei metodi in vivo come ChIP-chip sono tecniche comunemente utilizzate per determinare obiettivi del gene globali per i fattori di trascrizione. Tuttavia, essi sono di uso limitato a esplorare batteriche due sistemi di regolazione dei componenti con condizioni di attivazione non caratterizzate. Tali sistemi regolano la trascrizione solo quando attivato in presenza di segnali unici. Poiché questi segnali sono spesso sconosciuti, il metodo vitro microarray basato in descritto in questo articolo video può essere utilizzata per determinare obiettivi del gene e siti di legame per i regolatori di risposta. Questo metodo-chip DNA purificato per affinità può essere utilizzato per qualsiasi regolatore purificata in qualsiasi organismo con un genoma sequenziato. Il protocollo prevede che permette la proteina taggato purificata da associare alla tosato DNA genomico e poi affinità purificazione del DNA alle proteine, seguita dalla marcatura fluorescente del DNA e ibridazione di una matrice di affiancamento personalizzato. Precedente passaggi che possono essere utilizzati per ottimizzare il dosaggio per specifiregolatori c sono anche descritti. I picchi generati dall'analisi dei dati della matrice vengono utilizzati per prevedere motivi sito di legame, che vengono poi validate sperimentalmente. Le previsioni motivi possono essere ulteriormente utilizzati per determinare obiettivi del gene di regolatori di risposta ortologhi in specie strettamente correlate. Dimostriamo l'applicabilità di questo metodo determinando gli obiettivi gene e vincolante motivi sito e prevedere quindi la funzione di un regolatore di risposta DVU3023 sigma54-dipendente nel batterio ambientale Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.
Introduction
La capacità dei batteri di sopravvivere e prosperare è criticamente dipendente da come sono in grado di percepire e rispondere alle perturbazioni nel loro ambiente, e questo a sua volta dipende dalla loro sistemi di trasduzione del segnale. Il numero dei sistemi di segnalamento un batterio codifica è stato chiamato il suo "IQ microbica" e può essere un'indicazione di entrambi variabilità del suo ambiente e della sua capacità di percepire segnali multipli e mettere a punto la sua risposta 1. Due sistemi componenti di trasduzione del segnale (TCS) sono i sistemi di segnalazione più diffusi utilizzati dai batteri, e sono costituiti da una istidina chinasi (HK) che rileva il segnale esterno e trasmette tramite fosforilazione di un regolatore risposta effettrice (RR) 2. RR può avere una varietà di domini di uscita e quindi diverse modalità effettrici, ma la risposta più comune è la regolazione trascrizionale tramite un dominio di legame al DNA 1. I segnali rilevati e le corrispondenti funzioni dei vast maggioranza dei STC rimangono sconosciute.
Sebbene i metodi in vivo come ChIP-chip sono abitualmente utilizzati per la determinazione dei siti di legame di fattori di trascrizione genomica 3, possono essere utilizzati solo per batteriche RR sistema a due componenti se sono note le condizioni attivanti o segnali. Spesso i segnali ambientali che attivano una TCS sono più difficili da determinare rispetto ai loro obiettivi del gene. Il microarray in vitro saggio basato qui descritto può essere utilizzato per determinare efficacemente e rapidamente i geni bersaglio e prevedere funzioni di STC. Questo saggio sfrutta il fatto che RR possono essere fosforilati e quindi attivate in vitro utilizzando piccoli donatori molecola come acetil fosfato 4.
In questo metodo, denominato DAP-chip per DNA-affinità-chip purificata (Figura 1), il gene RR di interesse viene clonato con His-tag in E. coli, e una proteina marcata successivamente purificata è consentito bind a tranciata DNA genomico. Il DNA alle proteine viene poi arricchita da affinità di purificazione, il DNA arricchito e l'ingresso sono amplificati, fluorescente, in pool insieme e ibridato in una matrice di piastrelle che è su misura per l'organismo di interesse (Figura 1). Esperimenti microarray sono soggette ad artefatti e quindi passaggi aggiuntivi sono impiegati per ottimizzare il dosaggio. Un passo è tentare di determinare un obiettivo per il RR sotto studio mediante saggi di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) (vedi workflow in figura 2). Poi, dopo il legame al DNA genomico e le fasi DAP, il DNA legato alle proteine e di ingresso vengono esaminate da qPCR per vedere se il bersaglio positivo è arricchito nella frazione legata alle proteine rispetto alla frazione di ingresso, confermando così condizioni ottimali di legame per l' RR (Figura 2). Dopo matrice ibridazione, i dati vengono analizzati per individuare picchi di segnale di maggiore intensità che indicano loci genomici dove la proteina had vincolato. Le funzioni possono essere previsti per l'RR base agli obiettivi genica ottenuti. I loci genomici destinazione vengono utilizzati per prevedere motivi sito di legame, che vengono poi sperimentalmente validati utilizzando EMSAs (Figura 2). Le previsioni funzionali e obiettivi del gene per la RR possono poi essere estesi alle specie che codificano RR ortologhe mediante la scansione di questi genomi per motivi di legame simili (Figura 2), strettamente legato. Il metodo DAP-chip in grado di fornire una serie di informazioni per una TCS dove prima non c'era nessuno. Il metodo può anche essere usato per qualsiasi regolatore trascrizionale se la proteina può essere purificata e DNA condizioni di legame può essere determinata, e per qualsiasi organismo di interesse con una sequenza genomica disponibili.
Figura 1. Il chip DNA purificato per affinità (DAP-chip) strategia 7. Il gene RR dall'organismo di interesse viene clonato con carbossi-terminale His-tag in un E. ceppo di espressione coli. Purificato la proteina His-tagged viene attivata dalla fosforilazione con acetil fosfato, e miscelato con tranciato DNA genomico. Un'aliquota della reazione di legame viene salvato come DNA di ingresso, mentre il resto è sottoposto a purificazione per affinità utilizzando resina Ni-NTA. L'ingresso e il DNA RR-bound sono intero genoma amplificato, ed etichettati con Cy3 e Cy5, rispettivamente. Il DNA marcato viene raggruppate e ibridato a una matrice piastrelle, che viene poi analizzato per determinare gli obiettivi del gene. Figura modificato e ristampato utilizzando la licenza Creative Commons da 7.
Figura 2. Sintesi dei flussi di lavoro. Per qualsiasi Protei taggato purificaton, iniziare determinando un obiettivo utilizzando EMSA. Lasciare proteina di legare il DNA genomico e poi DNA-affinità-Purify (DAP) e l'intero genoma di amplificare (WGA) e il DNA ingresso arricchito. Se un gene bersaglio è noto, utilizzare qPCR per garantire che il bersaglio noto è arricchito nella frazione legata alle proteine. Se nessun obiettivo potrebbe essere determinato, procedere direttamente alla etichettatura del DNA e la matrice di ibridazione. Se non poteva essere osservato arricchimento da qPCR, quindi ripetere il legame proteina-gDNA e gradini DAP-WGA utilizzando diverse quantità di proteine. Utilizzare l'analisi di matrice per individuare e mappare i picchi loro di geni bersaglio. Utilizzare le regioni a monte dei geni bersaglio per prevedere motivi sito di legame. Convalidare i motivi sperimentalmente utilizzando EMSAs. Utilizzare il motivo per eseguire la scansione del genoma di specie affini che codificano ortologhi del RR in fase di studio, e prevedere i geni mirati in quelle specie. Sulla base degli obiettivi del gene ottenuti, la funzione fisiologica della RR e suoi ortologhi può essere previsto. Figura modificato e ristampato con il c creativaommons licenza da 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo DAP-chip qui descritto è stato utilizzato con successo per determinare gli obiettivi del gene per diversi RR in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7 di cui una è indicata qui come risultato rappresentativo. Per RR DVU3023, la scelta di un obiettivo gene candidato era semplice. DVU3025 si trova immediatamente a valle del gene RR, ed i geni RR e di destinazione sono conservati in diverse specie Desulfovibrio, e inoltre DVU3025 ha un promotore sigma54-dipendente predetto. L'EM…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Amy Chen per il suo aiuto nella preparazione per le riprese video e per dimostrare la tecnica. Questo lavoro condotto da ENIGMA: Ecosistemi e reti integrate con i geni e assembly molecolari (http://enigma.lbl.gov), un programma di messa a fuoco Scientifico Area presso il Lawrence Berkeley National Laboratory, è stato supportato da Office of Science, Ufficio biologiche e ricerca ambientale, del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti nell'ambito del contratto n ° DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments |
| HisTrapFF column (Ni-Sepharose column) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5255-01 | |
| Akta explorer (FPLC instrument) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | ||
| HiPrep 26/10 Desalting column | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5087-01 | |
| Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28704 | |
| Biotin-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| 6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | EC63652BOX | Alternately, you can pour your own gel. |
| Nylon membrane | EMD Millipore, Billerica, MA, USA | INYC00010 | |
| Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3940 | |
| Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3967 | |
| UV crosslinker Model XL-1000 | Fisher Scientific | 11-992-89 | |
| Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce) | Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA | 89880 | |
| Ni-NTA agarose resin | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 30210 | |
| GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase ) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | WGA2-50RXN | |
| Nanodrop ND-1000 | Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA | For quantitation of DNA | |
| Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX | Quanta biosciences | 95055-500 | Any Sybr Green PCR mix may be used |
| PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR | Axygen | ||
| 96 well clear low profile PCR microplate | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | PCR-96-LP-AB-C | |
| Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | 4376600 | Any real time PCR system may be used |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28104 | Any PCR clean up kit may be used |
| Cy3/Cy5-labeled nonamers | Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA | N46-0001, N46-0002 | |
| Klenow polymerase 50,000U/ml, 3'-5' exo- | New England Biolabs, Ipswich, MA | M0212M | |
| Hybridization system | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used, |
| Custom printed microarrays and mixers | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| GenePix 4200A microarray scanner | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | This model has been replaced by superior ones | |
| GenePix Pro microarray software | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | ||
| Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
References
- Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
- Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).
- Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo. Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).
- McCleary, W. R., Stock, J. B. Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators. J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).
- Novichkov, P. S., et al. RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics. Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).
- Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes. Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).
- Rajeev, L., et al. Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium. Genome Biol. 12, 99 (2011).
- Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).
- Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts. J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).
- Bourret, R. B. Receiver domain structure and function in response regulator proteins. Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).
- Gao, R., Stock, A. M. Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity. Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).
- Hung, D. C., et al. Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation. J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).
- Ladds, J. C., et al. The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).
- Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).
- Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity. Genome Res. 15, 421-427 (2005).
- Gossett, A. J., Lieb, J. D. DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Mascher, T., et al. The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis. J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
- Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites. Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).
- Ho, J. W., et al. ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis. BMC Genomics. 12, 134 (2011).
- Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection. Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).
