細菌のための2つの成分規制システムを遺伝子標的を決定するために、DNA親和性精製チップ（DAP-チップ）方法
Summary
このビデオの記事は、遺伝子標的と2成分系の応答調節因子の結合部位を決定するためのin vitroのマイクロアレイベースの方法を説明します。
Abstract
このようなChIPチップインビボ方法において 、転写因子のためのグローバルな遺伝子標的を決定するために使用される十分に確立された技術である。しかし、彼らは特徴づけられていない活性化条件で、細菌の2成分の規制制度を模索中使用が制限されている。このようなシステムは、ユニークな信号の存在下で活性化する場合にのみ転写を調節する。これらの信号はしばしば不明であるので、このビデオ資料に記載のインビトロマイクロアレイベースの方法は、遺伝子標的および応答調節因子の結合部位を決定するために使用することができる。このDNA-アフィニティー精製チップ法は、配列決定されたゲノムを有する任意の生物の任意の精製されたレギュレータに使用されてもよい。プロトコルは、精製されたタグが付いたタンパク質は、カスタムタイリングアレイへのDNAとハイブリダイゼーションの蛍光標識に続いて、タンパク質に結合したDNAを剪断ゲノムDNAに結合して、親和性浄化することができますが含まれます。仕するためのアッセイを最適化するために使用され得る工程の前にCレギュレータはまた、記載されている。アレイデータの分析によって生成されたピークは、次いで、実験的に検証される結合部位モチーフを予測するために使用される。モチーフの予測は、さらに密接に関連した種にオルソロガス応答調節因子の遺伝子標的を決定するために使用することができる。私たちは、遺伝子標的を決定し、サイトのモチーフを結合し、このような環境細菌デスルホビブリオ尋常 Hildenborough中sigma54依存応答レギュレータDVU3023機能を予測することにより、この方法の適用可能性を実証する。
Introduction
生存し繁殖する細菌の能力は、それらが知覚とその環境における摂動に応答することができるどの程度に決定的に依存し、これは順番に、それらのシグナル伝達系に依存する。信号システム細菌エンコードの数は、その「微生物のIQ」と呼ばれているとその環境の変動と複数の信号を感知する能力を微調整その応答1の両方を示している可能性があり。二成分シグナル伝達系（TCS）細菌によって使用される最も普及しているシグナル伝達系であり、それらは外部信号を感知し、エフェクターレスポンスレギュレーター（RR）2リン酸化を介して送信するヒスチジンキナーゼ（HK）からなる。 RRは、出力領域の様々なため、異なるエフェクターのモードを持つことができますが、最も一般的な応答は、ドメイン1のDNA 結合を介した転写調節です。信号が感知され、VASの対応する機能のTCSsのT大半は不明のままである。
このようなChIPチップ等のインビボ方法は、日常的に、転写のゲノム結合部位の決定のために使用されているが3因子活性化状態または信号が既知である場合、それらは、細菌の二成分系資源レコードのために使用することができる。多くの場合、TCSをアクティブに環境手がかりは、その遺伝子標的よりも決定することが困難です。ここに記載したインビトロマイクロアレイに基づくアッセイは、効果的かつ迅速に遺伝子標的を決定し、のTCSsの機能を予測するために使用することができる。このアッセイは、RRがリン酸化され、従って、アセチルリン酸4などの小分子供与体を用いてインビトロで活性化することができるという事実を利用する。
この方法では、DNA-親和性精製チップ（ 図1）DAP-チップという、目的のRR遺伝子はE.でHisタグにクローニングする大腸菌 、そして続いて精製タグを付けたタンパク質を双方向に許可されているNDゲノムDNAをせん断した。タンパク質に結合したDNAは、その後、アフィニティー精製、濃縮し、入力DNAによって濃縮されて増幅され、蛍光標識されたが、一緒にプールし、カスタム目的の生物（ 図1）に対して行われるタイリングアレイにハイブリダイズ。マイクロアレイ実験は、アーチファクトを受けやすく、したがって、追加のステップは、アッセイを最適化するのに用いられる。一つのそのような工程は、（ 図2のワークフローを参照）を電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いて、研究中のRR毎にターゲットを決定しようとすることである。その後、ゲノムDNAおよびDAPステップに結合した後、タンパク質結合及び投入DNAは、このように最適な結合条件を確認し、正のターゲットは入力割合と比較して、タンパク質に結合した画分に濃縮されているかどうかを確認するために定量PCRによって調べられるRR（ 図2）。アレイハイブリダイゼーションの後、データは、ゲノム遺伝子座タンパク質hを示す高強度信号のピークを見つけるために分析される広告が結合した。関数が得られた遺伝子標的に基づいて、RRのために予測することができる。標的ゲノム遺伝子座を、次いで、実験的にEMSAを（ 図2）を用いて検証される結合部位モチーフを予測するために使用される。 RRのための機能的予測および遺伝子標的は、次いで密接に（ 図2）と類似の結合モチーフをそれらのゲノムをスキャンすることによってオーソロガスRRをコードする種が関連するように拡張することができる。 DAPチップ方式は、以前に何もありませんでしたTCSのための豊富な情報を提供することができます。この方法はまた、タンパク質を精製することができ、DNA結合条件を決定することができる場合、任意の転写調節のために使用され、ゲノム配列を有する関心対象の任意の生物に利用可能することができる。
図1。のDNAアフィニティー精製したチップ（DAP-チップ）戦略7。目的の生物からのRR遺伝子を大腸菌にカルボキシ末端Hisタグでクローン化される大腸菌発現株。精製されたHisタグ付きタンパク質は、アセチルリン酸とリン酸化により活性化され、剪断されたゲノムDNAと混合する。残りは、Ni-NTA樹脂を用いてアフィニティー精製を行っている間の結合反応のアリコートを、入力DNAとして保存される。入力およびRR-結合したDNAは、増幅全ゲノムであり、それぞれCy3およびCy5で標識。標識されたDNAを一緒にプールし、次いで、遺伝子標的を決定するために分析されたタイリングアレイにハイブリダイズされる。図は、修正され、7からクリエイティブコモンズライセンスを使用して復刻。
図2。ワークフローの概要。任意の精製されたタグが付いprotei用nは、EMSAを使用してターゲットを決定することから始めます。許可したゲノムDNAを結合して、DNA-アフィニティ精製するタンパク質（DAP）、全ゲノム（WGA）濃縮し、入力DNAを増幅する。遺伝子標的が既知である場合、公知の標的は、タンパク質結合画分中に濃縮されることを確実にするために定量PCRを使用する。標的が決定できなかった場合には、DNAの標識およびアレイハイブリダイゼーションに直接進む。定量PCRによる濃縮が観察されなかった場合には、結合タンパク質のgDNAと異なるタンパク質の量を使用してDAP-WGAステップを繰り返す。ピークを見つけ、遺伝子をターゲットにマップするために、配列解析を使用してください。結合部位モチーフを予測するために、標的遺伝子の上流領域を使用してください。 EMSAをを使用して実験的にモチーフを検証します。研究中のRRのオルソログをコードする近縁種のゲノムをスキャンし、同様にそれらの種で標的遺伝子を予測するモチーフを使用してください。得られた遺伝子標的に基づいて、RRおよびそのオーソログの生理学的機能を予測することができる。図は、創造的なCを使用して修正して復刻ommonsは7からライセンス。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明DAPチップ方式が正常つが代表的結果として示されているのビブリオ尋常 Hildenborough 7におけるいくつかのRRのための遺伝子標的を決定するために使用された。 RR DVU3023、候補遺伝子ターゲットを選択することは簡単でした。 DVU3025は、RR遺伝子のすぐ下流に位置し、RRおよび標的遺伝子は、いくつかのビブリオ種において保存され、さらに、予測DVU3025 sigma54依存性…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ビデオ撮影の準備で彼女の助けと技術を実証するためのエイミー·チェンに感謝します。エニグマが行ったこの作品：遺伝子および分子集合体（http://enigma.lbl.gov）と生態系とネットワークの統合、ローレンスバークレー国立研究所の科学重点領域プログラム、科学局によってサポートされていました、生物のOfficeと契約番号DE-AC02-05CH11231下、米国エネルギー省の環境研究、。
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments |
| HisTrapFF column (Ni-Sepharose column) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5255-01 | |
| Akta explorer (FPLC instrument) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | ||
| HiPrep 26/10 Desalting column | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5087-01 | |
| Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28704 | |
| Biotin-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| 6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | EC63652BOX | Alternately, you can pour your own gel. |
| Nylon membrane | EMD Millipore, Billerica, MA, USA | INYC00010 | |
| Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3940 | |
| Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3967 | |
| UV crosslinker Model XL-1000 | Fisher Scientific | 11-992-89 | |
| Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce) | Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA | 89880 | |
| Ni-NTA agarose resin | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 30210 | |
| GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase ) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | WGA2-50RXN | |
| Nanodrop ND-1000 | Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA | For quantitation of DNA | |
| Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX | Quanta biosciences | 95055-500 | Any Sybr Green PCR mix may be used |
| PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR | Axygen | ||
| 96 well clear low profile PCR microplate | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | PCR-96-LP-AB-C | |
| Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | 4376600 | Any real time PCR system may be used |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28104 | Any PCR clean up kit may be used |
| Cy3/Cy5-labeled nonamers | Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA | N46-0001, N46-0002 | |
| Klenow polymerase 50,000U/ml, 3'-5' exo- | New England Biolabs, Ipswich, MA | M0212M | |
| Hybridization system | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used, |
| Custom printed microarrays and mixers | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| GenePix 4200A microarray scanner | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | This model has been replaced by superior ones | |
| GenePix Pro microarray software | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | ||
| Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
References
- Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
- Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).
- Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo. Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).
- McCleary, W. R., Stock, J. B. Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators. J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).
- Novichkov, P. S., et al. RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics. Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).
- Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes. Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).
- Rajeev, L., et al. Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium. Genome Biol. 12, 99 (2011).
- Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).
- Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts. J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).
- Bourret, R. B. Receiver domain structure and function in response regulator proteins. Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).
- Gao, R., Stock, A. M. Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity. Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).
- Hung, D. C., et al. Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation. J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).
- Ladds, J. C., et al. The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).
- Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).
- Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity. Genome Res. 15, 421-427 (2005).
- Gossett, A. J., Lieb, J. D. DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Mascher, T., et al. The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis. J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
- Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites. Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).
- Ho, J. W., et al. ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis. BMC Genomics. 12, 134 (2011).
- Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection. Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).
