تنقية الحمض النووي تقارب رقاقة (DAP رقاقة) طريقة لتحديد الأهداف الجيني للبكتيريا نظامان التنظيمية المكون
Summary
توضح هذه المقالة الفيديو على ميكروأري يستند أسلوب في المختبر لتحديد أهداف الجينات ومواقع الربط لمدة المنظمين استجابة النظام المكون.
Abstract
في الأساليب فيفو مثل رقاقة رقاقة هي تقنيات راسخة المستخدمة لتحديد الأهداف الجين العالمية لعوامل النسخ. ومع ذلك، فإنها ليست ذات فائدة محدودة في استكشاف البكتيرية نظامين التنظيمية المكون مع الظروف تفعيل uncharacterized. هذه النظم تنظيم النسخ فقط عند تفعيلها في وجود إشارات فريدة من نوعها. منذ هذه الإشارات غالبا ما تكون غير معروفة، في المختبر ميكروأري تستند الطريقة الموضحة في هذه المقالة الفيديو يمكن استخدامها لتحديد الأهداف الجينات ومواقع الربط للمنظمين الاستجابة. هذا الأسلوب تنقية الحمض النووي تقارب رقاقة يمكن أن تستخدم لأي منظم تنقيته في أي كائن حي مع تسلسل الجينوم. ينطوي على بروتوكول يسمح البروتين الموسومة تنقيته لربط الحمض النووي الجيني المنفصمة ثم تنقية تقارب الحمض النووي المرتبط بالبروتين، يليه وضع العلامات الفلورية من الحمض النووي والتهجين لمجموعة وتبليط مخصصة. السابقة الخطوات التي يمكن استخدامها لتحسين مقايسة لspecifiكما وصف المنظمين ج. وتستخدم القمم الناتجة عن تحليل البيانات للتنبؤ مجموعة زخارف موقع الملزمة، والتي يتم بعد ذلك التحقق من صحة تجريبيا. التنبؤات عزر يمكن استخدامها لتحديد المزيد من الأهداف الجينات المنظمين استجابة orthologous في الأنواع ذات الصلة عن كثب. ونحن لشرح تطبيق هذه الطريقة من خلال تحديد أهداف ملزمة الجينات والزخارف الموقع وبالتالي توقع وظيفة لمنظم استجابة DVU3023 تعتمد على sigma54 في البكتيريا البيئية منتزعة الكبريت الشائع Hildenborough.
Introduction
قدرة البكتيريا على البقاء على قيد الحياة وتزدهر اعتمادا كبيرا على مدى وهم قادرون على إدراك والرد على الاضطرابات في بيئاتهم، وهذا بدوره يعتمد على أنظمتها نقل الإشارة. وقد دعا عدد من النظم يدل على تشفير بكتيريا في "الذكاء الميكروبي"، ويمكن أن يكون مؤشرا لكلا تنوع بيئتها وقدرتها على الإحساس إشارات متعددة وتهذيب ردها 1. نظامان مكون نقل الإشارة (TCS) هي أنظمة الإشارات الأكثر انتشارا التي تستخدمها البكتيريا، وأنها تتكون من كيناز الحامض الاميني (هونج كونج) تستشعر إشارة خارجية وينقل عبر الفسفرة إلى منظم استجابة المستجيب (RR) 2. يمكن سجلات المورد دينا مجموعة متنوعة من المجالات الانتاج وسائط المستجيب مما مختلفة، لكن الرد الأكثر شيوعا هو التنظيم النسخي عن طريق الحمض النووي نطاق 1 ملزمة. إشارات لمست وظائف المقابلة من خدمات القيمة المضافةر غالبية TCSs لا تزال مجهولة.
على الرغم من أن في الجسم الحي أساليب مثل رقاقة رقاقة تستخدم بشكل روتيني لتحديد مواقع الربط الجيني لعوامل النسخ 3، فإنها يمكن أن تستخدم إلا لاثنين من الممثلين الإقليميين النظام المكون الجرثومي إذا من المعروف أن الظروف تفعيل أو الإشارات. غالبا ما تكون العظة البيئية التي تنشيط TCS هي أصعب لتحديد الأهداف من الجينات الخاصة بهم. في المختبر ميكروأري مقايسة على أساس وصفها هنا يمكن أن تستخدم لتحديد بفعالية وبسرعة الأهداف الجينات والتنبؤ ظائف TCSs. هذا الاختبار يستفيد من حقيقة أن الممثلين الإقليميين يمكن فسفرته وبالتالي تفعيلها في المختبر باستخدام جزيء صغير المانحين مثل الاسيتيل الفوسفات 4.
في هذه الطريقة، واسمه DAP رقاقة الحمض النووي للتقارب منقى رقاقة (الشكل 1)، يتم استنساخ الجين RR من الفائدة مع صاحب العلامة في E. القولونية، ويسمح للبروتين الموسومة تنقيته بعد ذلك إلى ثنائيةالثانية لالمنفصمة الحمض النووي الجيني. ثم يتم إثراء الحمض النووي ملزمة البروتين تقارب تنقية، وتتضخم الحمض النووي المخصب والمدخلات، fluorescently المسمى، المجمعة معا، وتهجين لمجموعة والتبليط الذي هو العرف لكائن من الفائدة (الشكل 1). تجارب ميكروأري تخضع لالتحف، وبالتالي يعملون خطوات إضافية لتحسين الفحص. واحدة من هذه الخطوة هو محاولة لتحديد هدف واحد لRR قيد الدراسة باستخدام فحوصات الكهربي التحول التنقل (EMSA) (انظر سير العمل في الشكل 2). ثم، بعد الملزمة لالحمض النووي الجيني والخطوات مديرية إدارة السجون، ويتم فحص الحمض النووي المرتبط بالبروتين والمدخلات التي كتبها QPCR لمعرفة ما إذا تم تخصيب الهدف الإيجابي في جزء محدد من البروتين بالنسبة للجزء المدخلات، مؤكدة بذلك الشروط الملزمة الأمثل ل RR (الشكل 2). بعد مجموعة التهجين، يتم تحليل البيانات للعثور على قمم أعلى كثافة إشارة تشير إلى مواضع الجيني حيث البروتين حالإعلان ملزمة. يمكن توقع وظائف للRR على أساس أهداف الجينات التي تم الحصول عليها. يتم استخدام مواضع الجيني المستهدف للتنبؤ الزخارف موقع ملزمة، والتي يتم بعد ذلك التحقق من صحة تجريبيا باستخدام EMSAs (الشكل 2). ثم قد يتم تمديد التوقعات الوظيفية والأهداف الجينات لRR إلى الأنواع التي تكود الممثلين الإقليميين orthologous عن طريق مسح الجينوم لتلك الزخارف ملزمة مماثلة (الشكل 2) ترتبط ارتباطا وثيقا. يمكن طريقة DAP رقاقة توفر ثروة من المعلومات عن TCS حيث سبق وكان هناك لا شيء. ويمكن أيضا أن تستخدم أسلوب لأي منظم النسخي إذا كان البروتين يمكن تنقيته ويمكن تحديد شروط ملزمة الحمض النووي، ولأي كائن من الفائدة مع تسلسل الجينوم المتاحة.
الشكل 1. ورقاقة تنقية الحمض النووي تقارب (DAP-رقاقة) استراتيجية 7. يتم استنساخ الجين RR من كائن من الفائدة مع كربوكسي محطة صاحب العلامة إلى E. سلالة التعبير القولونية. يتم تنشيط البروتين تنقية صاحب الموسومة من قبل الفسفرة مع الاسيتيل الفوسفات، ومختلطة مع الحمض النووي الجيني المنفصمة. يتم حفظ قسامة من رد فعل ملزم ال DNA المدخلات، في حين يخضع الباقي لتنقية تقارب باستخدام الراتنج ني NTA. المدخلات والحمض النووي محددة RR هي الجينوم تضخيمها، والمسمى مع CY3 وCy5، على التوالي. يتم تجميع الحمض النووي المسمى معا، وتهجين لمجموعة وتبليط، والتي يتم بعد ذلك تحليلها لتحديد الأهداف الجين. الرقم تعديل وطبعها باستخدام رخصة المشاع الإبداعي من 7.
الشكل 2. ملخص سير العمل. للحصول على أي البروتينات الموسومة تنقيتهن، تبدأ من خلال تحديد الهدف باستخدام EMSA. تسمح البروتين لربط الحمض النووي الجيني ومن ثم الحمض النووي تقارب تنقية (DAP) والجينوم تضخيم (WGA) والحمض النووي والمدخلات المخصب. إذا كان من المعروف هدفا الجين، استخدم QPCR لضمان أن الهدف معروف غير المخصب في جزء محدد من البروتين. إذا لم يتسن تحديد الهدف، الانتقال مباشرة إلى وضع العلامات الحمض النووي ومجموعة التهجين. إذا التخصيب بحلول QPCR لا يمكن ملاحظة، ثم كرر ملزمة البروتين gDNA والخطوات DAP-WGA باستخدام كميات البروتين المختلفة. استخدام تحليل مجموعة للعثور على القمم ورسم خريطة لها لاستهداف الجينات. استخدام مناطق المنبع من الجينات المستهدفة للتنبؤ الزخارف موقع ملزمة. التحقق من صحة الزخارف تجريبيا باستخدام EMSAs. استخدام الحافز لمسح الجينوم من الأنواع ذات الصلة ترميز orthologs من لوائح الراديو قيد الدراسة، والتنبؤ الجينات المستهدفة في تلك الأنواع كذلك. استنادا إلى أهداف الجينات التي تم الحصول عليها، ويمكن توقع وظيفة فسيولوجية من لوائح الراديو وorthologs لها. الرقم تعديل وطبعها باستخدام ج الإبداعيةترخيص ommons من 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام أسلوب DAP رقاقة الموصوفة هنا بنجاح لتحديد الأهداف الجين لعدة سجلات المورد في منتزعة الكبريت الشائع Hildenborough 7 من الذي يظهر واحد هنا نتيجة ممثل. لRR DVU3023، واختيار الهدف الجين مرشح كان مباشرة. يقع DVU3025 المصب على الفور من الجين RR، ويتم حفظها لوائح الرادي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ايمي تشن لمساعدتها في التحضير لتصوير الفيديو ولإظهار هذه التقنية. هذا العمل الذي قامت به ENIGMA: النظم البيئية والشبكات المتكاملة مع الجينات الجزيئية وجمعيات (http://enigma.lbl.gov)، وهو برنامج مجال التركيز العلمي في مختبر لورنس بيركلي الوطني، وبدعم من مكتب العلوم ومكتب البيولوجية و البحوث البيئية، من وزارة الطاقة في الولايات المتحدة بموجب العقد رقم DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments |
| HisTrapFF column (Ni-Sepharose column) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5255-01 | |
| Akta explorer (FPLC instrument) | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | ||
| HiPrep 26/10 Desalting column | GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA | 17-5087-01 | |
| Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28704 | |
| Biotin-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| 6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | EC63652BOX | Alternately, you can pour your own gel. |
| Nylon membrane | EMD Millipore, Billerica, MA, USA | INYC00010 | |
| Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3940 | |
| Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm | Biorad, Hercules, CA, USA | 170-3967 | |
| UV crosslinker Model XL-1000 | Fisher Scientific | 11-992-89 | |
| Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce) | Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA | 89880 | |
| Ni-NTA agarose resin | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 30210 | |
| GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase ) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | WGA2-50RXN | |
| Nanodrop ND-1000 | Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA | For quantitation of DNA | |
| Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX | Quanta biosciences | 95055-500 | Any Sybr Green PCR mix may be used |
| PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR | Axygen | ||
| 96 well clear low profile PCR microplate | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | PCR-96-LP-AB-C | |
| Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system | Life Technologies, Grand Island, NY, USA | 4376600 | Any real time PCR system may be used |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen Inc, Valencia, CA, USA | 28104 | Any PCR clean up kit may be used |
| Cy3/Cy5-labeled nonamers | Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA | N46-0001, N46-0002 | |
| Klenow polymerase 50,000U/ml, 3'-5' exo- | New England Biolabs, Ipswich, MA | M0212M | |
| Hybridization system | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used, |
| Custom printed microarrays and mixers | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT) | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
| GenePix 4200A microarray scanner | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | This model has been replaced by superior ones | |
| GenePix Pro microarray software | Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA | ||
| Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software | Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA | N/A | |
References
- Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
- Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).
- Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo. Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).
- McCleary, W. R., Stock, J. B. Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators. J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).
- Novichkov, P. S., et al. RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics. Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).
- Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes. Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).
- Rajeev, L., et al. Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium. Genome Biol. 12, 99 (2011).
- Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).
- Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts. J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).
- Bourret, R. B. Receiver domain structure and function in response regulator proteins. Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).
- Gao, R., Stock, A. M. Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity. Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).
- Hung, D. C., et al. Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation. J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).
- Ladds, J. C., et al. The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).
- Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).
- Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity. Genome Res. 15, 421-427 (2005).
- Gossett, A. J., Lieb, J. D. DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Mascher, T., et al. The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis. J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
- Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites. Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).
- Ho, J. W., et al. ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis. BMC Genomics. 12, 134 (2011).
- Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection. Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).
