DNA-affinitetsrenade Chip (DAP-chip) metod för att bestämma genen mål för bakteriell Två komponent regelsystem

Summary

Denna video artikeln beskriver en microarray baserad in vitro-metod för att bestämma genen mål och bindningsställen för två komponentregulatorer systemets svars.

Abstract

In vivo-metoder såsom chip-chip är väl etablerade tekniker som används för att fastställa det övergripande gen mål för transkriptionsfaktorer. De är dock av begränsad nytta för att utforska bakteriella två komponent regelsystem med uncharacterized aktiveringsvillkor. Sådana system endast reglerar transkriptionen när den aktiveras i närvaro av unika signaler. Eftersom dessa signaler är ofta okänd, kan det in vitro-mikromatrisbaserad metod som beskrivs i denna video artikeln användas för att bestämma genen mål och bindningsställen för responsregulatorer. Denna DNA-affinitetsrenade-chip metoden kan användas för alla renade regulatorn i organismen med en sekvens genom. Protokollet involverar att låta den renade märkta proteinet att binda till skjuvade genomiskt DNA och därefter affinitetsrenande erhållna proteinbundna DNA: t, följt av fluorescensmärkning av DNA: t och hybridisering till en anpassad tiling array. Föregående stegen, som kan användas för att optimera analysen för specific tillsynsmyndigheter beskrivs också. Topparna som genereras genom analys av array-data används för att förutsäga bindningsställemotiv, vilka sedan experimentellt validerade. De motiv förutsägelser kan användas vidare för att bestämma genen mål av ortologa regulatorer svar på närbesläktade arter. Vi visar att tillämpningen av denna metod genom att bestämma genen mål och bindande site motiv och därmed förutsäga funktionen för en sigma54 beroende respons regulator DVU3023 i miljö bakterien Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

Introduction

Förmågan hos bakterier att överleva och frodas är kritiskt beroende på hur väl de kan uppfatta och reagera på störningar i sina miljöer, och detta i sin tur är beroende av sina signalöverföringssystem. Antalet signalsystem en bakterie Kodar har kallat sin "mikrobiell IQ" och kan vara en indikation på såväl variationen i dess miljö och dess förmåga att känna flera signaler och finjustera sitt svar ^1. Två komponentsignalöverföringssystem (TCS) är de vanligaste signalsystem som används av bakterier, och de består av en histidin kinas (HK) som känner av den externa signalen och sänder via fosforylering till en effektor svar regulator (RR) ^2. RR kan ha en mängd olika utgångs domäner och därmed olika effektor lägen, men det vanligaste svaret är transkriptionsreglering via en DNA-bindande domän ^1. De signaler, som avkänns och de motsvarande funktionerna hos vast majoriteten av TV-kamerasystem är fortfarande okända.

Även in vivo-metoder såsom chip-chip används rutinmässigt för bestämning av genomiska bindningsställen för transkriptionsfaktorer ^3, kan de endast användas för bakteriella tvåkomponentsystem RR om aktiverande villkor eller signaler är kända. Ofta de miljömässiga signaler som aktiverar en TCS är svårare att avgöra än sina genen mål. Den in vitro-mikroarray-baserad analys som beskrivs här kan användas för att effektivt och snabbt bestämma genmål och förutse funktioner TV-kamerasystem. Denna analys tar fördel av det faktum att RR kan fosforyleras och sålunda aktiveras in vitro med användning av små molekyler givare som acetylfosfat ^4.

I denna metod, benämnd DAP-chip för DNA-affinitetsrenat-chip (figur 1), är RR intressanta genen klonas med en His-tag i E. coli och renas därefter taggade proteinet tillåts bind att skjuvas genom-DNA. Den proteinbundna DNA sedan berikas av affinitetsrening, är det anrikade och input-DNA förstärks, fluorescerande, sammanförs och hybridiseras till en kakel array som anpassade görs till organismen av intresse (Figur 1). Microarray experiment är föremål för artefakter och därmed ytterligare steg används för att optimera analysen. Ett sådant steg är att försöka bestämma ett mål för RR som studeras med hjälp av elektro mobilitet förskjutningsanalyser (EMSA) (se arbetsflödet i Figur 2). Sedan, efter bindning till genomiskt DNA och DAP steg, är proteinbundet och input-DNA undersöktes genom qPCR för att se om den positiva målet anrikas i den proteinbundna fraktionen i förhållande till den ingående fraktionen, vilket bekräftar optimala bindningsbetingelser för RR (Figur 2). Efter array hybridisering, är de data som analyseras för att hitta toppar av högre intensitet signal som indikerar genomisk lokus där proteinet had bunden. Funktioner kan förutsägas för RR baserad på genen mål som uppnåtts. De målinriktade genomic loci används för att förutsäga bindningsställemotiv, vilka sedan experimentellt validerade använder EMSAs (Figur 2). De funktionella förutsägelser och gen mål för RR kan sedan utvidgas till att nära besläktade arter som kodar ortologa RR genom att skanna dessa genomen för liknande bindande motiv (Figur 2). DAP-chip-metoden kan ge en mängd information för en TCS där tidigare det fanns ingen. Metoden kan också användas för någon transkriptionsregulator om proteinet kan renas och DNA-bindningsförhållanden kan bestämmas, och för en organism av intresse med en genomsekvens som finns tillgänglig.

Figur 1. DNA-affinitetsrenat-chip (DAP-chip) strategi ^7. RR-genen från organismen av intresse klonas med en karboxi-terminal His-tag i en E. coli-expressionsstammen. Purified His-märkta proteinet aktiveras genom fosforylering med acetylfosfat, och blandas med skjuvade genomiskt DNA. En alikvot av bindningsreaktionen sparas som input-DNA, medan resten utsattes för affinitetsrening med användning av Ni-NTA-harts. Ingången och RR bundna DNA är hela genom förstärkt, och märkta med Cy3 och Cy5, respektive. Det märkta DNA poolas tillsammans och hybridiserades till en plattsättning array, som sedan analyseras för att fastställa genmål. Figur modifierad och omtryckt genom att använda Creative Commons-licens från ^7.

Figur 2. Sammanfattning av arbetsflöde. För varje renad taggade protein, börja med att bestämma ett mål med hjälp av Europeiska sjösäkerhetsbyrån. Låt protein för att binda iskt DNA och DNA-affinitetsrena (DAP) och hela genomet förstärker (WGA) den berikade och input-DNA. Om en gen som målet är känt använder qPCR för att säkerställa att det kända målet anrikas i den proteinbundna fraktionen. Om inget mål kunde bestämmas, gå direkt till DNA-märkning och array hybridisering. Om anrikning av qPCR inte kunde observeras, sedan upprepa protein gDNA bindande och DAP-WGA steg med hjälp av olika protein belopp. Använd array analys för att hitta toppar och mappa dem till mål gener. Använd de uppströms regionerna av målgener för att förutsäga bindningsställe motiv. Validera motiven experimentellt med EMSAs. Använd motivet att skanna genom av besläktade arter som kodar ortologer av RR som studeras, och förutsäga gener inriktade på dessa arter. Baserat på genen mål som uppnåtts, kan den fysiologiska funktionen av RR och dess ortologer förutsägas. Figur modifierad och omtryckt genom att använda den kreativa commons licens från ^7.

Protocol

OBS: Protokollet nedan är anpassad för bestämning av genen mål i RR DVU3023 från bakterien Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Den kan anpassas till varje annan transkriptionsregulator av intresse. 1. Clone och rena RR Klona RR genen, speciellt DVU3023, från D. vulgaris Hildenborough in i en Escherichia coli-uttrycksvektor så att den gen som är C-terminalt His-märkt och expression är under kontroll av en T7-promotor. Anmärkning: Flera…

Representative Results

Metoden ovan tillämpades för att fastställa de globala genmål av RRS i modellen sulfatreducerande bakterie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Denna organism har ett stort antal TV-kamerasystem som representeras av över 70 RR, anger många möjliga signaler som den känner och reagerar på. In vivo-analyser på funktionerna i dessa signalsystem är svåra att utföra eftersom deras signaler och därmed deras aktiverande villkor är okända. Här DAP-chip metod användes för att bes…

Discussion

DAP-chip-metod som beskrivs här har med framgång använts för att bestämma genen mål för flera RRs i Desulfovibrio vulgaris Hildenborough ⁷ av vilka en visas här som ett representativt resultat. För RR DVU3023, välja en kandidat gen mål var enkelt. DVU3025 är belägen omedelbart nedströms om RR-genen och RR och målgener är konserverade i flera Desulfovibrio arter, och dessutom DVU3025 har en förutsagd sigma54-beroende promotor. EMSA tillhandahåller en enkel metod för att sna…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog number	Comments
HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA	17-5255-01
Akta explorer (FPLC instrument)	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA
HiPrep 26/10 Desalting column	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA	17-5087-01
Qiaquick Gel extraction kit	Qiagen Inc, Valencia, CA, USA	28704
Biotin-labeled oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	N/A
6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel	Life Technologies, Grand Island, NY, USA	EC63652BOX	Alternately, you can pour your own gel.
Nylon membrane	EMD Millipore, Billerica, MA, USA	INYC00010
Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell	Biorad, Hercules, CA, USA	170-3940
Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm	Biorad, Hercules, CA, USA	170-3967
UV crosslinker Model XL-1000	Fisher Scientific	11-992-89
Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)	Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA	89880
Ni-NTA agarose resin	Qiagen Inc, Valencia, CA, USA	30210
GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase )	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	WGA2-50RXN
Nanodrop ND-1000	Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA		For quantitation of DNA
Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX	Quanta biosciences	95055-500	Any Sybr Green PCR mix may be used
PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR	Axygen
96 well clear low profile PCR microplate	Life Technologies, Grand Island, NY, USA	PCR-96-LP-AB-C
Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system	Life Technologies, Grand Island, NY, USA	4376600	Any real time PCR system may be used
Qiaquick PCR purification kit	Qiagen Inc, Valencia, CA, USA	28104	Any PCR clean up kit may be used
Cy3/Cy5-labeled nonamers	Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA	N46-0001, N46-0002
Klenow polymerase 50,000U/ml, 3'-5' exo-	New England Biolabs, Ipswich, MA	M0212M
Hybridization system	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A	This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used,
Custom printed microarrays and mixers	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
GenePix 4200A microarray scanner	Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA		This model has been replaced by superior ones
GenePix Pro microarray software	Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA
Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A