Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

DNA-affinitetsrensede Chip (DAP-chip) metode til at bestemme Gene Mål for bakteriel Tokomponent reguleringsordninger

Published: July 21, 2014 doi: 10.3791/51715

Summary

Denne video artikel beskriver en in vitro microarray baseret metode til at bestemme gen-mål og bindingssteder for to-komponent-system respons regulatorer.

Abstract

In vivo-metoder såsom chip-chip er veletablerede teknikker, der anvendes til at bestemme den globale genmål for transkriptionsfaktorer. Men de er af begrænset nytte i at udforske bakterielle to-komponent reguleringssystemer med uncharacterized betingelser aktivering. Sådanne systemer regulerer transkription kun hvis aktiveret i nærvær af unikke signaler. Da disse signaler er ofte ukendt, kan beskrives i denne video artiklen in vitro microarray baserede metode anvendes til at bestemme gen-mål og bindingssteder for respons regulatorer. Dette DNA-affinitetsoprenset chip fremgangsmåde kan anvendes til enhver renset regulator i enhver organisme med et genom. Protokollen indebærer tillader oprenset mærkede protein til at binde til forskudt genomisk DNA og affinitet oprensning protein-bundet DNA, efterfulgt af fluorescerende mærkning af DNA'et og hybridisering til en brugerdefineret flisebelægning array. Foregående trin, der kan anvendes til at optimere analysen for specific regulatorer er også beskrevet. Toppene genereres ved analyse array data anvendes til at forudsige bindingssted motiver, som derefter eksperimentelt validerede. Motivet forudsigelser kan yderligere anvendes til at bestemme genmål af ortologe respons regulatorer på nært beslægtede arter. Vi demonstrerer anvendeligheden af denne metode ved at bestemme genmål og bindingssted motiver og dermed forudsige funktion for en sigma54-afhængig reaktion regulator DVU3023 på miljøområdet bakterie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

Introduction

Evnen af ​​bakterier til at overleve og trives er helt afhængig af, hvor godt de er i stand til at opfatte og reagere på forstyrrelser i deres omgivelser, og dette igen er afhængige af deres signaltransduktionssystemer. Antallet af signalsystemer en bakterie koder er blevet kaldt dets "mikrobiel IQ" og kan være en indikation af både variation af miljøet og dets evne til at fornemme flere signaler og finjustere sit svar 1. To komponent signaltransduktion (FKS), er den mest udbredte signalsystemer anvendes af bakterier, og de ​​består af en histidin kinase (HK), som registrerer det eksterne signal og transmitterer via fosforylering til en effektor reaktion regulator (RR) 2. RRs kan have en række af output domæner, og dermed forskellige effektor tilstande, men den mest almindelige reaktion er transkriptionel regulering via et DNA-bindende domæne 1. De signaler, fornemmede og de tilsvarende funktioner i vast størstedelen af ​​fjernsynskamerasystemer fortsat er ukendt.

Selv om in vivo-metoder, såsom chip-chip rutinemæssigt anvendes til bestemmelse af genomiske bindingssteder transskriptionsfaktorerne 3, kan de kun anvendes til bakterielle tokomponentsystem RRs hvis aktiverende betingelser eller signaler er kendt. Ofte miljømæssige signaler, der aktiverer en TCS er sværere at afgøre end deres genmål. In vitro microarray assay beskrevet her kan anvendes til effektivt og hurtigt bestemme genmål og forudsige funktioner af de pågældende systemer. Dette assay udnytter det faktum, at RRs kan phosphoryleres og således aktiveres in vitro ved anvendelse småmolekyle donorer som acetylphosphat 4.

I denne metode, opkaldt DAP-chip for DNA-affinitetsoprenset-chip (figur 1), er RR-genet af interesse klones med en His-mærke i E. coli, og en efterfølgende oprenset mærkede protein lades bind at klippes genomisk DNA. Proteinet bundet DNA derefter beriget med affinitet-rensning, er det berigede og input DNA forstærkes fluorescensmærkede, lagt sammen og hybridiseret til en flisebelægning array, der er specialfremstillet til organismen af interesse (Figur 1). Microarray eksperimenter er genstand for artefakter og dermed yderligere trin anvendes for at optimere analysen. Et sådant trin er at forsøge at bestemme et mål for RR under undersøgelse under anvendelse af elektroforetisk mobilitet shift assays (EMSA) (se arbejdsgangen i figur 2). Dernæst, efter binding til genomisk DNA og DAP trin, er protein-bundne og input DNA undersøges ved qPCR at se, om den positive mål er beriget i protein-bundne fraktion i forhold til fraktion input, hvilket bekræfter optimale bindingsbetingelser for RR (figur 2). Efter vifte hybridisering, er data analyseres for at finde toppe af højere intensitet signal indikerer genomisk loci hvor proteinet hannonce bundet. Funktioner kan forudsiges for RR baseret på genmål opnået. Target genomiske loci anvendes til at forudsige bindingssted motiver, som derefter eksperimentelt validerede hjælp EMSAs (figur 2). De funktionelle forudsigelser og genmål for RR kan derefter udvides til nært beslægtede arter, som koder for ortologe RRs ved at scanne disse genomer for lignende bindende motiver (figur 2). DAP-chip-metoden kan give et væld af informationer for en FKS, hvor der tidligere var ingen. Fremgangsmåden kan også anvendes til enhver transkriptionel regulator hvis proteinet kan oprenses og DNA-bindingsbetingelser kan bestemmes, og for enhver organisme af interesse med et genom-sekvens til rådighed.

Figur 1
Fig. 1. DNA-affinitetsoprenset-chip (DAP-chip) strategi 7.. RR-genet fra organismen af interesse klones med en carboxy-terminal His-mærke i en E. coli-ekspressionsvektoren stamme. Oprenset His-mærket protein aktiveres ved phosphorylering med acetylphosphat, og blandes med klippede genomisk DNA. En portion af bindingsreaktionen gemmes som input DNA, mens resten udsættes for affinitetsoprensning under anvendelse af Ni-NTA-harpiksen. Input og RR-bundet DNA er hele genomet forstærkes og mærket med Cy3 og Cy5, hhv. Det mærkede DNA samles sammen og hybridiseret til en flisebelægning array, som derefter analyseres for at bestemme gen-mål. Figur modificeret og genoptrykt hjælp Creative Commons licens fra 7..

Figur 2
Figur 2.. Resumé af workflow. For enhver renset tagged Protein, begynder ved at bestemme et mål ved hjælp af EMSA. Tillad protein til at binde genomisk DNA og derefter DNA-affinitetsoprensning (DAP) og hele genomet forstærke (WGA) beriget og input DNA. Hvis et gen målet er kendt, anvendes qPCR at sikre, at den kendte mål er beriget med protein-bundne fraktion. Hvis der ingen mål kunne bestemmes, gå direkte til DNA-mærkning og matrix hybridisering. Hvis det ikke kunne observeres berigelse af qPCR, derefter gentage protein-gDNA binding og DAP-WGA trin ved hjælp af forskellige protein beløb. Brug array analyse til at finde toppe og kortlægge dem til at målrette gener. Brug opstrøms regioner af målgener at forudsige bindingssted motiver. Godkend motiverne eksperimentelt ved EMSAs. Brug motivet til at scanne genomer af beslægtede arter, der koder orthologer af RR under studiet, og forudsige gener målrettet på disse arter som godt. Baseret på genmål opnået, kan den fysiologiske funktion af RR og dens orthologer forudsiges. Figur modificeret og genoptrykt ved hjælp af den skabende commons licens fra 7..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Protokollen nedenfor er skræddersyet til bestemmelse af gen mål for RR DVU3023 fra bakterien Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Det kan tilpasses til en anden transskriptionel regulator af interesse.

1.. Klon og Purify RR

  1. Klon RR genet specifikt DVU3023 fra D. vulgaris Hildenborough ind i en Escherichia coli ekspressionsvektor, således at genet er C-terminalt His-mærket og ekspression er under kontrol af en T7-promotor.
    Bemærk: Flere kloningsfremgangsmåder kan anvendes, og er bestemt af forskeren. Alternative affinitetsmærker kan også anvendes.
  2. Omdan ekspressionskonstruktionen i E. coli BL21 (DE3) ekspression stamme.
  3. Dyrk 1 L BL21 ekspression stamme ved 37 ° C. På midten af ​​log-fase, tilsættes IPTG til 0,5 mM for at inducere proteinekspression. Fortsæt vækst ved stuetemperatur i 24 timer.
  4. Centrifugér cellerne ved 5.000 xg i 10 min ved 4 ° C. Resuspender cellerne i lysepuffer (20 mM natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 40 mM imidazol, 1 mg / ml lysozym, 1x benzonase nuklease). Lyserer celler under anvendelse af en fransk presse ved 4 ° C.
  5. Centrifuger lysatet ved 15.000 x g i 30 min ved 4 ° C. Filtreres på et 0,45 um sprøjtefilter.
  6. Vask en 1 ml Ni Sepharose-søjle på en FPLC-instrument under anvendelse af 10 ml vaskebuffer (20 mM natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 40 mM imidazol).
  7. Load lysat på kolonnen. Vask søjlen med 20 ml vaskebuffer.
  8. Elute DVU3023 med en gradient af 0-100% elueringspuffer (20 mM natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol).
  9. Load eluerede fraktioner på en afsaltningskolonne, og vaskes med en afsaltning puffer (20 mM natriumphosphat pH 7,4, 100 mM NaCI).
  10. Centrifuge protein prøve i en høj molekylvægt cutoff centrifugefilter at koncentrere proteinet. Læg DTT til 0,1 mM, og glycerol til 50% og opbevare proteinet ved -20 ° C.
    Bemærk: Oprensningsmetoderne skal optimeres individuelt for hvert protein, der undersøges.

2.. Bestem Gene Mål for RR Brug Elektroforetisk Mobility Shift Assay (EMSA)

  1. PCR forstærke 400 bp region opstrøms for kandidat målgen DVU3025, ved hjælp af D. vulgaris Hildenborough genomisk DNA som template, og en forreste umærket primer og en revers 5'-biotin-mærket primer.
    Bemærk: Tips til at vælge en kandidat målgen: Ofte RRs binde opstrøms regioner af deres egen gen / operon, eller de kan regulere proximalt kodede gener. Hvis RR har orthologer i andre arter, kigge efter gener, der er konserveret i nabolaget. Alternative metoder omfatter vælger kandidatgener baseret på regulon forudsigelser (f.eks RegPrecise 5), eller forudsige sigma54-afhængige promotorer 6 for RRs, der selv sigma54 afhængige.
  2. Kør PCR-produktet på en 1% agarosegel, skåret ud af 400 bp størrelse produktet, og oprense DNA ved anvendelse af en gel ekstraktion rense kit.
  3. Bland DVU3023 protein (0,5 pmol) med 100 fmol af biotinyleret DNA substrat i 10 mM Tris HCl, pH 7,5, 50 mM KCI, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 25% glycerol og 1 ug / ml poly dI.dC (ikke -specifikt konkurrerende DNA) i et samlet volumen på 20 ul. Også oprettet en reaktion uden nogen protein som en kontrol. Inkubér reaktioner ved stuetemperatur på bænken i 20 min.
  4. Bemærk: Disse er standardbetingelser børsnoterede og andre reaktionskomponenter kan tilføjes, afhængigt af RR af interesse. Hvis der ønskes aktivering, tilsættes 50 mM acetylphosphat til reaktionsblandingen (ofte RRs vil binde DNA in vitro uden aktivering).
  5. Pre-køre en præfabrikeret mini 6% polyacrylamid-0.5x TBE gel i 0,5 x TBE-buffer ved 100 V i 30 minutter. Tilsæt 5 pi 5x loadingbuffer (0,1% bromphenolblåt, 0,1% xylencyanol, 30% glycerol i 1x TBE) de bindende reaktioner og belastning 18 pi af reaktionerne til gel. Køre ved 100 V i 2 timer.
    Bemærk: For at undgå overophedning, hvilket kan føre til dissociation af protein-DNA-komplekser, fylde ydre bufferkammer i elektroforese-systemet med rindende puffer, således at størstedelen af ​​gelen isoleret med puffer. Alternativt kan gelen køres ved 4 ° C.
  6. Skær en ladet nylonmembran til størrelsen af ​​gelen, og lægges i 0,5 x TBE i mindst ti minutter. Fjern gelen fra kassetten. Skær eventuelle kamme fra gelen og sandwich gelen og membranen mellem to tykke filtrerpapirer dyppet i 0,5 x TBE, og placere inde i en halvtør apparat blotting og køre på 20 V i 30 min.
  7. Placér membranen inde i en kommerciel UV-lys tværbinder instrument og indstille tiden til 3 min.
    Bemærk: Membranen kan nu opbevares tørt ved stuetemperatur i flere dage, før man går videre til det næste trin.
  8. Brug et kommercielt tilgængeligt kemiluminescent afsløring kit, der anvender en streptavidin-peberrod peroxidaSE-konjugat til at udvikle blottet ifølge producentens anvisninger.
  9. Billede blottet ved hjælp af en computer hooked op til en CCD udstyret kamera og kigge efter et skift i DNA substrat mobilitet i nærværelse af RR, hvilket indikerer, at RR binder DNA testes.
    Bemærk: Specificiteten af ​​protein-DNA skift kan testes ved at inkludere i reaktionen et overskud af umærket konkurrent DNA, som skal fjerne eller mindske skift set.

3.. Kontroller Target Berigelse efter Genomisk DNA-proteinbinding

  1. Genomisk DNA-protein-bindingsreaktion
    1. Shear genomisk DNA til en gennemsnitlig størrelse på 500 bp ved sonikering 100 ul genomisk DNA (ved koncentrationer 100-200 ng / ul) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved anvendelse af en mikrospids med 9 lav amplitude pulser af 1 sekund, med 2 sek hul i mellem hver.
      Bemærk: Hvis DNA stænk til siderne af røret, spin ned indholdet efter hver 3 pulser. De nøjagtige betingelser, der anvendesvil variere med den sonikator anvendte apparat. De klippede DNA-fragmenter kan variere fra 100-1000 bp, men den gennemsnitlige størrelse bør være inden for 400-600 bp. For meget forskydning kan resultere i færre intakte bindingssteder, og enten for meget eller for lidt klipning vil påvirke bibliotek præparat under de efterfølgende hele genom amplifikationstrinnene.
    2. Bland 2-3 ug forskudt genomisk DNA med RR-protein (0,5 pmol DVU3023) i 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1 mM DTT, 50 mM KCI, 5 mM MgCl2, 25% glycerol og 50 mM acetylphosphat. Inkuber reaktioner ved 25 ° C i 30 minutter. Transfer 10 pi af denne reaktion til et 1,5 ml rør og mærke som input DNA.
      Bemærk: tilsættes acetylphosphat at aktivere proteinet ved in vitro-phosphorylering. Phosphorylering stimulerer DNA-binding, men mange RRs også binde DNA in vitro uden aktivering 7. Mængden af ​​protein tilsat til reaktionsblandingen vil afhænge af aktiviteten af ​​proteinet prep. EMSA kan anvendes til at vælgeimize dette beløb.
  2. Affinity oprense proteinbundne DNA
    1. Tilsæt 30 ul af Ni-NTA agarose resin til et 0,6 ml mikrofugerør. Centrifuger ved 100 x g i 1 minut til opsamling af harpiks ved bunden og supernatanten fjernes. Tilsæt 100 pi vaskepuffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 50 mM KCI, 25% glycerol), svirp røret at blande, og centrifugeres ved 100 xg i 2 min. Fjern supernatanten.
    2. Tilsæt de resterende 90 ul af bindingsreaktionen til den vaskede Ni-NTA-harpiks og inkuber i et roterende rysteapparat i 30 minutter.
    3. Centrifuger ved 100 x g i 2 minutter, og supernatanten fjernes (ubundet DNA). Tilsæt 100 pi vaskepuffer svirp røret for at blande indholdet, og der centrifugeres ved 100 xg i 2 min. Fjern supernatanten. Gentag vasketrin to gange mere.
    4. Tilføj 35 pi elueringsbuffer (20 mM natriumphosphat, pH 8, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol) til harpiksen og vortexes. Inkuberes på bænken ved stuetemperatur i 5 min. Centrifuger ved 100 x g i 2 min. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml-rør og etiketten som DNA-fraktionen proteinbundet.
    5. Også tilføje 35 pi af elueringspufferen til input DNA.
    6. Renses indgangs-og proteinbundne DNA fraktioner ved hjælp af en PCR-oprensningskit.
  3. Hele genomet forstærke input og proteinbundne DNA-prøver.
    1. Der tilsættes 10 ul af input og proteinbundet DNA til at adskille PCR-rør. Tilsæt 1 pi 10x Fragmentation buffer, 2 pi Bibliotek Forberedelse buffer, og 1 ml af Bibliotek Stabilization løsning til hver prøve. Vortexes grundigt. Varme i en thermocycler ved 95 ° C i 2 minutter, og chill på is.
      Bemærk: start mængde DNA bør være mindst 10 ng for at undgå at indføre forstærkning bias.
    2. Tilsæt 1 pi Bibliotek enzympræparat, blandes ved pipettering og inkuberes i termiske cykler ved 16 ° C/20 min, 24 ° C/20 min, 37 ° C i 20 min, 75 ° C / 5 min, Og hold ved 4 ° C.
    3. Til hvert rør tilsættes 47,5 pi vand, 7,5 pi 10x amplifikation masterblandingen og 5 pi polymerase. Bland godt og opvarmes ved 95 ° C / 3 min, efterfulgt af 20 cyklusser ved 94 ° C/15 sek, 65 ° C / 5 min. Hold reaktioner ved 4 ° C.
    4. Renses de amplificerede DNA-prøver under anvendelse af et PCR-oprensningskit og måle DNA-koncentration spektrofotometrisk.
  4. Kontroller target berigelse i protein-bundet DNA ved hjælp af qPCR
    1. Design qPCR primere at forstærke 200 bp af det opstrøms region af EMSA-verificerede target-genet (DVU3025) ved hjælp af en frit tilgængelig primer design software.
    2. Opsæt tredobbelte qPCR reaktioner for hver DNA-skabelon med hver primer sæt. Forbered en master mix til hver primer sæt. 1x masterblanding indeholder 10 pi 2x Sybr Green qPCR mix, 0,5 uM af hver primer og vand til i alt 18 pi. Alikvote 18 pi af master mix per brønd i en 96-brønds PCR-plade.
    3. Fortynderene det amplificerede og oprenset input og proteinbundne DNA-prøver til 5 ng / pi med vand og bruges som DNA-skabelon. Tilsæt 2 pi DNA-template til brøndene.
    4. Forsegle skiltet med en ultra klar qPCR forsegling film, spin ned plade i en centrifuge ved 200 xg / 1 min. Placer pladen i en real time qPCR maskine. Cycle som følger ved hjælp af den tilhørende qPCR software: 95 ° C / 1 min og 40 cykler af 95 ° C/10 sek 59 ° C/15 sek, og 70 ° C/35 sek.
    5. Også oprettet tredobbelte qPCR reaktioner med primere til at forstærke opstrøms regioner af en ubeslægtet gen (negativ kontrol).
    6. Beregn ΔC T ved at fratrække C T værdi proteinbundet DNA fra det input DNA. Beregn fold berigelse af målgen i protein-bundet DNA som 2. ΔC T.
      Bemærk: Hvis målet opstrøms region blev beriget i proteinbundne DNA vs input DNA, indikerer det, at de bindende reaktioner og affinitetsoprensning var successful. Fortsæt til trin 4.. Hvis berigelse af målet opstrømsområdet ikke blev overholdt, gentages bindingsreaktionerne (trin 3.1) med forskellige mængder af protein.

4.. DNA Mærkning og Array hybridisering

  1. Label Input DNA med Cy3 og beriget DNA med Cy5
    ote: Cy3 og Cy5 farvestoffer er lysfølsomt og der skal sørges for at holde lys eksponering til et minimum.
    1. Bland 1 pg DNA med 40 ul Cy3/Cy5-labeled 9-merer og justere lydstyrken til 80 ul med vand.
    2. Heat denaturerer ved 98 ° C i 10 minutter i mørke (i en thermocycler). Quick chill på is i 2 min.
    3. Tilsæt 2 ul Klenow-polymerase (3'-5'-exo - 50.000 U / ml), 5 mM dNTP'er og 8 pi vand til hver reaktion, bland godt, og der inkuberes ved 37 ° C i 2 timer i mørke (i en thermocycler).
    4. Tilføj EDTA til 50 mM for at stoppe reaktionen, og NaCl-opløsning til 0,5 M.
    5. Overfør prøver til 1,5 ml rør containing 0,9 volumen isopropanol, inkuberes i mørke i 10 minutter og centrifugeres ved 12.000 xg i 10 min. Pelleten skal være lyserøde til Cy3-mærket DNA og blå for Cy5-mærket DNA.
    6. Vask pellet med 80% ethanol (500 ul) og centrifugeres ved 12.000 xg i 2 min. Lufttørre piller til 5-10 min i mørke.
      Bemærk: Pellets kan opbevares ved -20 ° C.
    7. Resuspender pellet i 25 pi vand. Måle DNA-koncentration spektrofotometrisk.
    8. Pool sammen 6 ug hver af Cy3-og Cy5-mærkede DNA i et 1,5 ml rør og vakuum tørres i en centrifuge ved lav varme i mørke (dække Centrifugelåget hvis den er gennemsigtig).
      Bemærk: Pellets kan opbevares ved -20 ° C indtil den er klar til hybridisering.
  2. Microarray hybridisering
    1. Drej hybridiseringssystemet på 3-4 hr før brug og sæt temperaturen til 42 ° C.
    2. Forbered en hybridiseringsopløsning mester mix sådan, at 1x opløsning indeholder 11,8 ul 2x Hybridining buffer, 4,7 pi Hybridization Komponent A og 0,5 pi tilpasning oligo.
    3. Resuspendere pillerne i 5 pi vand. Tilføj 13 pi af denne blanding til prøven. Vortex for 15 sekunder, inkuberes ved 95 ° C i et tørt bad i 5 min. Hold prøver ved 42 ° C i hybridisering systemet, indtil klar til lastning.
    4. Forbered microarray slide-blandegruppe ifølge producentens protokol.
    5. Placer mixer-slide samling inden hybridisering system. Load 16 pi prøve i fyldeporten forsegles portene med en selvklæbende folie, drej blanding i systemet, og at hybridisere i 16-20 timer ved 42 ° C.
    6. Forbered 1x vaskebuffere I (250 ml), II (50 ml) og III (50 ml) ved at fortynde 10X kommercielt tilgængelige buffere i vand, og til hver tilføje DTT til 1 mm. Varm Buffer I til 42 ° C.
    7. Skub mixer-dias i en demontering værktøj og sted inde i en skål indeholdende varm Buffer I. Skræl blanderen slukket, mens kraftigt shaking afmonteringen værktøj i hånden.
    8. Placer dias i en beholder med 50 ml vaskebuffer I og ryst kraftigt i 2 minutter med hånden.
    9. Transfer dias i en anden beholder med 50 ml vaskebuffer II og rystes kraftigt i 1 min med hånden.
    10. Transfer glide ind i en tredje beholder med 50 ml vaskebuffer III, og rystes kraftigt i 15 sekunder i hånden.
    11. Hurtigt skamplet kanterne af dias på et stykke køkkenrulle, og læg i en slide rack. Centrifuger ved 200 xg i 2 min for at tørre diaset. Placer indenfor slide tilfælde, pak den med folie og opbevares i en ekssikkator.
  3. Scanning af Array
    1. Anbring dias i microarray scanner efter instrumentets anvisninger.
    2. Brug en scanner software til at indstille de bølgelængder som 532 nm = Cy3 og 635 nm = Cy5, og de første lysforstærknings gevinster mellem 350 og 400.
    3. Få diaset for at finde array på diaset. Vælg array region for scanning. Scan array og justere fotomultiplikatoren indstillinger såsom at array funktioner er oftest gul. Histogrammet bør vise de røde og grønne kurver overlejret eller så tæt på hinanden som muligt. Kurverne skal ende over de 10 -5 normaliserede tællinger ved mætning.
    4. Spare både 532 og 635 nm billeder separat.
  4. Array Dataanalyse
    1. Importere billederne i et array analyse software. Brug af softwaren, oprette to par rapporter (. Par) for hver array (for Cy3 og Cy5 billeder). Opret skalerede log 2 forholdet filer ved hjælp af par filer. Brug log 2 forholdet filer for at søge efter toppe ved hjælp af en glidende vindue på 500 bp. Kort peak loci leverandørsektorerne regioner genmål.
    2. Kontroller, om den positive mål (bestemt ved hjælp af EMSA og bekræftet af qPCR, DVU3025 i dette eksempel) vises i de øverste tinder.
      Bemærk: Hvis den positive mål er ikke blandt de øverste hits, er det muligt, at RR under consideration har flere genmål og replikere DAP-chips kan udføres og toppe er fælles for alle replikater kan bruges til at generere et mål listen.

5.. Bindingssted Motiv Forudsigelse og validering

  1. Hent sekvenser for opstrømsregioner (400 bp) for top genmål som genereres af DAP-chip analyse. Påfør MEME på disse sekvenser gennem Mikrober Online (meme.nbcr.net) til at forudsige motiver.
    Bemærk: Enhancer bindende proteiner, såsom sigma54-afhængige regulatorer kan binde flere hundrede basepar opstrøms for startstedet. For andre transkriptionelle regulatorer, en kortere region som 200 bp opstrøms vil være tilstrækkelig.
  2. Design øverste og nederste streng DNA-oligomerer, der indeholder den forudsagte bindingssted motiv flankeret af 10 baser i begge ender. Bestil topstrengen 5 'biotinyleret.
  3. Bland de øverste og nederste streng-oligoer i 1:1,5-forhold i 10 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA og 50 mM NaCI iet samlet reaktionsvolumen på 20 ul i PCR-rør. Opvarm til 95 ° C i 5 minutter i en thermocycler, efterfulgt af langsom afkøling til 25 ° C. Fortynd ti gange og bruge som vildtype dsDNA substrat for EMSA.
  4. Fremstille modificerede substrater ved hjælp af de samme trin som ovenfor, men design oligomerer at bære 4-6 substitutioner i de konserverede baser af bindende motiv.
  5. Opsætning bindingsreaktioner med RR og vildtype eller modificerede substrater og undersøger ved hjælp af EMSA som beskrevet i trin 2.
  6. Bemærk: Den forudsagte motiv valideres, hvis RR binder vildtype substratet, men ikke modificeret en.

6.. Bevarelse af motiv i andre relaterede bakteriearter

  1. Vælg genomer af interesse, der indeholder orthologer af DVU3023. Anskaf sekvens og annotationsfiler for genomer fra NCBI site.
  2. Brug et programmeringssprog som Perl til at skrive scripts, der vil bruge motivet sekvenser fra DAP-chip mål for at opbygge en position vægtet matrix og bruge matricen at score lignende motiver til stede i andre sekventerede genomer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ovennævnte metode blev anvendt til at bestemme de globale genmål af RRS i modellen sulfat reducerende bakterie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Denne organisme har et stort antal af de pågældende systemer repræsenteret ved over 70 RRs, angiver det brede udvalg af mulige signaler, som den registrerer og reagerer på. In vivo analyser af funktionerne af disse signalsystemer er svære at udføre, da deres signaler og dermed deres aktiverende betingelser er ukendt. Her blev DAP-chip-metoden bruges til at bestemme genmål og dermed forudsige mulige funktioner for en repræsentativ RR DVU3023.

DVU3023 er en sigma-54-afhængig RR kodet i en operon med dets kognate HK (figur 3A). Den C-terminale His-tagged gen blev klonet ind i og oprenset fra E. coli. Ved første mål beslutsomhed, blev renset RR testet for binding til dets nedstrøms operon som er en ti gen-operon (DVU3025-3035) consisting af laktat optagelse og oxidation gener. RR DVU3023 flyttet regionen opstrøms DVU3025 (figur 3B). Næste RR DVU3023 fik lov til at binde sig til sheared D. vulgaris Hildenborough genomisk DNA. Selvom phosphorylering ikke var nødvendigt for binding til promotorregionen DVU3025 blev acetylphosphat tilsat til reaktionen, hvis det var påkrævet for binding til andre promotorer. Efter affinitetsoprensning af DNA-fraktionen proteinbundne blev qPCR bruges til at vise, at regionen opstrøms for DVU3025 er beriget (8,45 gange) i protein-bundne fraktion (C T = 6,9) i forhold til input-DNA (C t = 9,98 ) (figur 3C), hvilket viser, at de bindende anvendte betingelser var egnede til RR DVU3023. Mangel på berigelse af promotorregionen af ​​en tilfældigt udvalgt gen (DVU0013) blev anvendt som en negativ kontrol.

De proteinbundne og input DNA-prøver blev derefter mærket fluorescerende og hybridiseret tilet D. vulgaris Hildenborough flisebelægning array, der havde en høj sonde tæthed i intergeniske regioner. De fire øverste toppe blev valgt som de mest sandsynlige mål for DVU3023 (figur 3D). Disse fire toppe blev efterfulgt af flere andre, som også blev identificeret i DAP-chip analyser for flere andre RRs og dermed synes at være klistret DNA (tabel 1). Figur 3E er en skematisk fremstilling af de gener, der reguleres af DVU3023. Den positive mål DVU3025 var den første top, der opnås med den højeste score. To genmål er to andre enkeltvis kodede laktat permeaser (DVU2451 og DVU3284). Den fjerde gen mål ligger ikke i en opstrøms region, men i den intergeniske region mellem to konvergerende transskriberede gener / operoner (DVU0652 og DVU0653). Dette er en stor intergeniske region, og derudover også koder for et forudsagt sigma54-promotor. Det er muligt, at der er en uopdaget Srna kodes i denne region, er forordmulerede af RR DVU3023.

Brug af opstrøms regioner af mål opnået ved DAP-chip blev MEME brugt til at forudsige et bindingssted motiv (figur 3F, tabel 2). EMSA substrater bærer specifikke motiv opstrøms DVU3025 blev designet til at bekræfte, at RR DVU3023 genkender og binder den forudsagte motiv. Motivet blev yderligere valideret ved at udskiftninger i de bevarede baser i motivet, som elimineret bindende skift (figur 3G). Dette valideret motiv blev derefter brugt i Perl-genererede scripts til at scanne genom sekvenser af andre nært beslægtede sulfat reducerende bakterier, der havde orthologer for DVU3023. Loci blev valgt som mulige mål gen når motivet blev placeret i opstrøms regioner af åbne læserammer (Tabel 3). Brug af motivet sekvenser forudsagt for ortologe RRs var der enighed bindingssted motiv genereres (figur 3F), som lignede den one opnået for D. vulgaris Hildenborough alene.

Figur 3
Fig. 3. Bestemmelse genomiske mål for D. vulgaris respons regulator DVU3023. A. DVU3023 er kodet i en operon med dets beslægtede HK. Downstream operon har en sigma54-afhængig promotor (bøjet sort pil) og blev brugt som en kandidat målgen. B. Renset RR DVU3023 bundet og flyttet opstrøms region DVU3025 7.. C. Q-PCR af opstrøms regioner DVU3025 (positiv målrette) og DVU0013 (valgt som en negativ kontrol). E er proteinbundet beriget DNA-fraktion, jeg er input DNA. D. Top fire toppe efter DAP-chip analyse. Start og End refererer til DNA-koordinater i starten og slutningen af ​​peaks; score refererer til log 2 forholdet R for den fjerde højeste sonde i top; FDR = false opdagelse sats; cutoff_p er cutoff procentdel, hvor toppen blev identificeret. E. Skematisk repræsentation af genmål for DVU3023 baseret på DAP-chip toppe. Tal i felter angiver det maksimale antal i D. HK-RR gener er i grønne, target gener i blåt og andre gener i grå. Sorte bøjede pile er sigma54-afhængige initiativtagere, er grønne fyldte cirkler forudsagt bindingssted motiver. Gene navne er som følger: por - pyruvat ferredoxin oxidoreduktase; llp - lactat permease; GLCD-glycolatoxidase; glpc-Fe-S klynge bindende protein; pta - phosphotransacetylase; ack-acetat kinase; lldE - lactatoxidase underenhed; lldF / G - lactat-oxidase-underenhed; MCP -. Methyl-accepterende kemotaxis protein F. BNG 8 billeder af predicted bindingssted motiv. Top - stammer fra DAP-chip mål; Bund - stammer fra bindingssteder til stede i genomer med orthologer af DVU3023 7 G. Validering af forudsagt bindingssted motiv hjælp EMSA.. DVU3023 flyttet vildtype motiv (w), men ikke den modificerede motiv (m). Sekvenser for w og m motiver vises på højre 7. Figur modificeret og genoptrykt hjælp Creative Commons licens fra Rajeev et al 7.

Tabel 1
Tabel 1.. Top 20 toppe fra DAP-chip array analyse. Tabellen er delt i tre sektioner. Peak attributter viser detaljer af toppene som genereres af array analyse software, hvor Placering henviser til, om peak blev fundet i genomet eller ekstrakromosomale plasmid, Start og slut henvise til ssyrlig og ende loci for peak, Score refererer til log 2 R nøgletal for den fjerde højeste sonde i peak FDR refererer til den falske opdagelse sats værdi, og cutoff_p er cutoff procentdel, hvor toppen blev identificeret. De andre to sektioner Start koordinere kortlægning og slutkoordinaten kortlægning kort start og slut loci af henholdsvis top-til-genet. I disse sektioner Gene streng refererer til den streng, der koder genet, Offset indikerer afstand fra starten af ​​genet (positive værdier angiver loci opstrøms for genet, medens negative værdier angiver loci inden for genet) Overlap gen værdien SAND, hvis locus overlapper et gen, DVU refererer til DVU # af genet, som koordinaterne kort til og beskrivelse angiver genet annotation. Tabel modificeret og genoptrykt bruge creative commons licens fra Rajeev m.fl. 7.. Klik her for at se alarger version af denne tabel.

Tabel 2
Tabel 2.. Sekvenser anvendes til at bygge konsensus DAP-chip mål baseret motiv på fig. 3. Tabel modificeret og genoptrykt hjælp Creative Commons licens fra Rajeev et al 7.

Tabel 3
Tabel 3. Bindingssted motiver til DVU3023 orthologer stede i andre sekventeret Desulfovibrio og beslægtede arter. For hvert genom scannet, organismen navnet angivet, efterfulgt af locus tag for DVU3023 ortholog og procent identitet DVU3023 i parentes. Score angiver den værdi tildelt af Perl-program baseret på lighed til input sekventielleces. Beskrivelse hedder genet anmærkninger for generne i målet operonen. Tabel modificeret og genoptrykt hjælp Creative Commons licens fra Rajeev m.fl. 7. Klik her for at se en større version af denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den her beskrevne DAP-chip-metoden blev med succes anvendt til at bestemme genmål flere RRs i Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7, hvoraf den ene er vist her som et repræsentativt resultat. For RR DVU3023, vælge en kandidat gen mål var ligetil. DVU3025 er placeret umiddelbart nedstrøms for RR-genet og RR-og mål-gener er konserveret i adskillige Desulfovibrio arter, og derudover DVU3025 har en forudsagt sigma54-promotor. EMSA tilvejebringer en enkel metode til hurtigt at teste RR til binding til kandidat målgenet og tillader vurdering af aktiviteten af ​​det oprensede protein prøven, samt bestemme optimale protein-DNA-bindende betingelser også.

Det DNA-bindende aktivitet kan også testes i nærværelse og fravær af acetylphosphat at se, om phosphorylering er nødvendig for DNA-binding. Ikke alle RRs phosphoryleres med småmolekyle donorer9, i disse tilfælde den rensede kognate sensor kinase, hvis de er tilgængelige, kan anvendes til at aktivere proteinet. Der er også atypiske RRs kendt som mangler vigtige aktive websted rester i modtagerens domæne og ikke aktiveres ved phosphorylering 10. For hovedparten af RRs undersøgt, phosphorylering stimulerer DNA-bindende 11. Men der er eksempler, hvor fosforylering ikke påvirker in vitro DNA-binding 12, og der er eksempler, hvor fosforylering er nødvendig for binding 13, og også tilfælde, hvor den delmængde af initiativtagerne bundet stiger med fosforylering 14. DAP-chip-metoden kan udføres med og uden phosphorylering at afgøre, om der er forskelle i sættet af promotorer er bundet af RR. Det bør imidlertid også bemærkes, at nogle RRs kan oprenses i en funktionelt phosphorylerede form fra E. coli 13..

Protokollen beskrevet her er for et His-mærket Protein, således at proteinet bundet DNA er affinitetsoprenset ved hjælp af Ni-NTA agarose resin, men det kan let tilpasses til enhver form for mærket protein ved anvendelse af den passende affinitet harpiks til pull-down. Efter DAP-WGA trin, qPCR trin giver en ekstra kontrol for at sikre, at de protein-gDNA bindende forholdene var passende, og at protein-bundne DNA blev med succes beriget af affinitet rensning. Større end 3-fold berigelse er tilstrækkelig til at fortsætte med hybridisering trin. I modsætning EMSA reaktion, er der ingen ikke-specifik konkurrerende DNA som poly-dI.dC tilsat til gDNA bindingsreaktion, da det interfererer med WGA trin. På grund af dette, hvis proteinet prøven har ikke-specifik DNA bindende aktivitet så klar berigelse af den bekræftede mål-DNA vil ikke blive observeret af qPCR. Således qPCR kontrol trin kan anvendes til at optimere mængden af ​​protein, der anvendes i gDNA bindingsreaktion. Kommercielt tilgængelige kits til hele genomet forstærkning hævder at introduce ingen forstærkning partiskhed, når du følger deres retningslinjer for minimum start dna-materiale og lavt antal amplificeringscykler. Forstærkningen skævhed kan kontrolleres ved hjælp qPCR med forskellige primer sæt på forstærket versus unamplified DNA. Nogen effekt på downstream vifte hybridisering kan også bestemmes ved differentieret mærkning og hybridisering samlet forstærket og ikke-amplificeret genomisk DNA.

Listen af toppe, der er genereret efter matrix dataanalyse er normalt lang med flere toppe, der har en falsk opdagelse sats på 0. Derfor er en kombination af andre peak egenskaber, såsom høj log 2 R scorer og cutoff_p værdier (som genereres af array analyse software, der anvendes i denne undersøgelse) anvendes til frasortering listen ned til de højeste tillid genmål. Tilstedeværelsen af ​​den forudbestemte gen mål blandt de fem bedste hits i høj grad styrker tilliden i datasættet. Udførelse denne analyse for en række regulatoriske proteiner from den samme organisme, vil også hjælpe med at identificere "sticky" DNA-sekvenser, der vises i flere datasæt 7.. Derudover hvis et bindingssted motiv kan forudsiges og valideret derefter tilstedeværelsen af ​​motiv i toppe sænke ned i listen, kan også anvendes til at vælge en konservativ målgen listen. Berigelse af andre end promotorområder DNA-sekvenser kan være artefakter af matrix hybridisering eller kan indikere regulering af tidligere uidentificerede åbne læserammer eller små RNA 7. For regulatorer, hvor et gen mål ikke kunne forudbestemte hjælp EMSA, kan DAP-chip analyse kan udføres "blind" 7.. I sådanne tilfælde også vil identifikation af et bindingssted motiv forbedre udvælgelsen af ​​gen mål. Bestemmelse af proteinkoncentration, der skal anvendes i assayet, vil afhænge af den ikke-specifikke bindingsaktivitet af proteinet, som kan vurderes ved hjælp af EMSA tilfældigt udvalgte DNA substrater. Lavere koncentrationer fungere bedre for tslange proteiner med høj specifik bindingsaktivitet. Pålideligheden af ​​en blind DAP-chip kan forbedres ved at udføre replikere analyser med forskellige koncentrationer protein. For RRs med få mål, kan bare to eller endda en enkelt assay være tilstrækkelig til at generere et mål liste, som kan valideres ved hjælp af de efterfølgende EMSAs. DAP-chip data for sådanne RRs normalt vise en tydelig spring i log 2 R score eller cutoff_p værdier uden de første par toppe. For RRs med flere mål, kan data fra tre gentagelser blive analyseret for at generere en liste over almindelige toppe, hvoraf nogle måtte blive valgt til EMSA validering.

Evnen til at forudsige bindingssted motiver baseret på DAP-chip mål øger værdien af ​​denne metode og kraftigt øger de indhøstede oplysninger. EMSA igen giver en effektiv protokol til eksperimentelt verificere forudsigelser. Software scripts i Perl eller andre programmeringssprog kan bruges til hurtigt at søge gennem tilgængelige genom sequences. Resultaterne vil identificere både ortologe target gener samt målgenerne entydigt reguleret i genomer søgte. I repræsentativt resultat er vist her, har tre af de fire opstrøms målområder identificeret for DVU3023 kommenteret gen funktioner relateret til laktat optagelse og oxidation. Derudover eftersom bindingsstedet motiv for DVU3023 blev valideret, kan andre genomer søges lignende motiv sites. Sammen viser resultaterne, at den DVU3022-3023 TCS er godt bevaret i Desulfovibrio og andre relaterede sulfatreducerende bakterier, og at den regulerer gener for lactat transport og oxidation til acetat. Da lactat er den primære carbon-og elektron kilde anvendes af disse organismer, DVU3023 sandsynligvis spiller en central rolle i deres fysiologi. Blandt de bedste DAP-chip toppe for RR DVU3023, var der også en intergeniske region. Selv om et bindingssted motiv ikke blev fundet i denne region, tilstedeværelsen af ​​en forudsagt sigma-54-promotor antyder that kan der være en uidentificeret ORF eller Srna kodet, og at det kunne være et sandt mål for DVU3023. Dette fund understreger værdien af ​​den eksperimentelle DAP-chip tilgang kombineret med bindingssted forudsigelser i modsætning til at bestemme target sites baseret på beregningsmæssige forudsigelser alene.

Lignende in vitro-metoder som den er beskrevet her har kun været anvendt i få tilfælde 15-17 og meget sjældent for en tidligere unstudied regulator. Optimeringen EMSA og qPCR trin forud for array-hybridisering væsentligt vil hjælpe med at analysere de resultater, når fremgangsmåden skal anvendes til en ny regulator. Hvis matrix udskrivning bliver en hindring, kan DAP trin kombineres med næste generation sekventering til at opnå bindingssteder 18,19. Efterhånden som flere-array-baserede metoder bliver erstattet med sekventering baserede strategier, sådan fremtidig tilpasning af metoden omgår behovet for at udforme brugerdefinerede flisebelægning microarrays for organism af interesse. Chip-Seq teknologier resulterer i større følsomhed og specificitet for detektion af toppe når der sammenlignes med chip-chip-metoder, og er også hurtigt ved at blive mere omkostningseffektiv 20. Selv om denne artikel fokuseret på to komponent respons regulatorer, kan denne metode bruges til ethvert prokaryot eller eukaryot transskription faktor 15. NUKLEOSOM occupancies ofte have en effekt på mål, der reguleres og sammenligning af target-bindende sites for eukaryote transkriptionsfaktorer ved in vivo og in vitro analyser kan afsløre disse virkninger 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Amy Chen for hendes hjælp i forberedelserne til video shoot og for at demonstrere teknikken. Dette arbejde udføres af ENIGMA: Økosystemer og netværk Integreret med gener og molekylære Forsamlinger (http://enigma.lbl.gov), en videnskabelig Fokusområde Program på Lawrence Berkeley National Laboratory, blev støttet af Ministeriet for Videnskab, Kontoret for biologisk og Environmental Research, af det amerikanske Department of Energy i henhold til kontrakt nr. DE-AC02-05CH11231.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HisTrapFF column (Ni-Sepharose column) GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA 17-5255-01
Akta explorer (FPLC instrument) GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA
HiPrep 26/10 Desalting column GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA 17-5087-01
Qiaquick Gel extraction kit Qiagen Inc, Valencia, CA, USA 28704
Biotin-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies N/A
6% polyacrylamide-0.5x TBE precast mini DNA retardation gel Life Technologies, Grand Island, NY, USA EC63652BOX Alternately, you can pour your own gel.
Nylon membrane EMD Millipore, Billerica, MA, USA INYC00010
Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell Biorad, Hercules, CA, USA 170-3940
Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm Biorad, Hercules, CA, USA 170-3967
UV crosslinker Model XL-1000 Fisher Scientific 11-992-89
Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce) Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA 89880
Ni-NTA agarose resin Qiagen Inc, Valencia, CA, USA 30210
GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10x amplification master mix, WGA polymerase) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA WGA2-50RXN
Nanodrop ND-1000 Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA For quantitation of DNA
Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX Quanta biosciences 95055-500 Any Sybr Green PCR mix may be used
PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR Axygen
Name Company Catalog Number Comments
96-well clear low profile PCR microplate Life Technologies, Grand Island, NY, USA PCR-96-LP-AB-C
Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system Life Technologies, Grand Island, NY, USA 4376600 Any real time PCR system may be used
Qiaquick PCR purification kit Qiagen Inc, Valencia, CA, USA 28104 Any PCR clean up kit may be used
Cy3/Cy5-labeled nonamers Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA N46-0001, N46-0002
Klenow polymerase 50,000 U/ml, 3'-5' exo- New England Biolabs, Ipswich, MA M0212M
Hybridization system Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used.
Custom printed microarrays and mixers Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A
Hybridization kit (2x Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo) Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A
Wash buffer kit (10x Wash buffer I, II, III, 1 M DTT) Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A
GenePix 4200A microarray scanner Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA This model has been replaced by superior ones
GenePix Pro microarray software Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA
Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galperin, M. Y. Diversity of structure and function of response regulator output domains. Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).
  2. Casino, P., Rubio, V., Marina, A. The mechanism of signal transduction by two-component systems. Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).
  3. Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo. Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).
  4. McCleary, W. R., Stock, J. B. Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators. J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).
  5. Novichkov, P. S., et al. RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics. Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).
  6. Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes. Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).
  7. Rajeev, L., et al. Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium. Genome Biol. 12, 99 (2011).
  8. Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. WebLogo: a sequence logo generator. Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).
  9. Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts. J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).
  10. Bourret, R. B. Receiver domain structure and function in response regulator proteins. Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).
  11. Gao, R., Stock, A. M. Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity. Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).
  12. Hung, D. C., et al. Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation. J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).
  13. Ladds, J. C., et al. The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).
  14. Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).
  15. Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity. Genome Res. 15, 421-427 (2005).
  16. Gossett, A. J., Lieb, J. D. DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity. CSH Protoc. 2008, (2008).
  17. Mascher, T., et al. The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis. J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).
  18. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).
  19. Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites. Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).
  20. Ho, J. W., et al. ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis. BMC Genomics. 12, 134 (2011).
  21. Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection. Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).

Tags

Genetics DNA-affinitetsoprenset-chip responsregulatorprotein transkriptionsfaktor bindingssted tokomponentsystem signaltransduktion, Laktat udnyttelse regulator chip-chip
DNA-affinitetsrensede Chip (DAP-chip) metode til at bestemme Gene Mål for bakteriel Tokomponent reguleringsordninger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rajeev, L., Luning, E. G.,More

Rajeev, L., Luning, E. G., Mukhopadhyay, A. DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems. J. Vis. Exp. (89), e51715, doi:10.3791/51715 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter