DNA-affinitetsrensede Chip (DAP-chip) metode til at bestemme Gene Mål for bakteriel Tokomponent reguleringsordninger

Summary

Denne video artikel beskriver en in vitro microarray baseret metode til at bestemme gen-mål og bindingssteder for to-komponent-system respons regulatorer.

Abstract

In vivo-metoder såsom chip-chip er veletablerede teknikker, der anvendes til at bestemme den globale genmål for transkriptionsfaktorer. Men de er af begrænset nytte i at udforske bakterielle to-komponent reguleringssystemer med uncharacterized betingelser aktivering. Sådanne systemer regulerer transkription kun hvis aktiveret i nærvær af unikke signaler. Da disse signaler er ofte ukendt, kan beskrives i denne video artiklen in vitro microarray baserede metode anvendes til at bestemme gen-mål og bindingssteder for respons regulatorer. Dette DNA-affinitetsoprenset chip fremgangsmåde kan anvendes til enhver renset regulator i enhver organisme med et genom. Protokollen indebærer tillader oprenset mærkede protein til at binde til forskudt genomisk DNA og affinitet oprensning protein-bundet DNA, efterfulgt af fluorescerende mærkning af DNA'et og hybridisering til en brugerdefineret flisebelægning array. Foregående trin, der kan anvendes til at optimere analysen for specific regulatorer er også beskrevet. Toppene genereres ved analyse array data anvendes til at forudsige bindingssted motiver, som derefter eksperimentelt validerede. Motivet forudsigelser kan yderligere anvendes til at bestemme genmål af ortologe respons regulatorer på nært beslægtede arter. Vi demonstrerer anvendeligheden af denne metode ved at bestemme genmål og bindingssted motiver og dermed forudsige funktion for en sigma54-afhængig reaktion regulator DVU3023 på miljøområdet bakterie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

Introduction

Evnen af ​​bakterier til at overleve og trives er helt afhængig af, hvor godt de er i stand til at opfatte og reagere på forstyrrelser i deres omgivelser, og dette igen er afhængige af deres signaltransduktionssystemer. Antallet af signalsystemer en bakterie koder er blevet kaldt dets "mikrobiel IQ" og kan være en indikation af både variation af miljøet og dets evne til at fornemme flere signaler og finjustere sit svar ^1. To komponent signaltransduktion (FKS), er den mest udbredte signalsystemer anvendes af bakterier, og de ​​består af en histidin kinase (HK), som registrerer det eksterne signal og transmitterer via fosforylering til en effektor reaktion regulator (RR) ^2. RRs kan have en række af output domæner, og dermed forskellige effektor tilstande, men den mest almindelige reaktion er transkriptionel regulering via et DNA-bindende domæne ^1. De signaler, fornemmede og de tilsvarende funktioner i vast størstedelen af ​​fjernsynskamerasystemer fortsat er ukendt.

Selv om in vivo-metoder, såsom chip-chip rutinemæssigt anvendes til bestemmelse af genomiske bindingssteder transskriptionsfaktorerne ^3, kan de kun anvendes til bakterielle tokomponentsystem RRs hvis aktiverende betingelser eller signaler er kendt. Ofte miljømæssige signaler, der aktiverer en TCS er sværere at afgøre end deres genmål. In vitro microarray assay beskrevet her kan anvendes til effektivt og hurtigt bestemme genmål og forudsige funktioner af de pågældende systemer. Dette assay udnytter det faktum, at RRs kan phosphoryleres og således aktiveres in vitro ved anvendelse småmolekyle donorer som acetylphosphat ^4.

I denne metode, opkaldt DAP-chip for DNA-affinitetsoprenset-chip (figur 1), er RR-genet af interesse klones med en His-mærke i E. coli, og en efterfølgende oprenset mærkede protein lades bind at klippes genomisk DNA. Proteinet bundet DNA derefter beriget med affinitet-rensning, er det berigede og input DNA forstærkes fluorescensmærkede, lagt sammen og hybridiseret til en flisebelægning array, der er specialfremstillet til organismen af interesse (Figur 1). Microarray eksperimenter er genstand for artefakter og dermed yderligere trin anvendes for at optimere analysen. Et sådant trin er at forsøge at bestemme et mål for RR under undersøgelse under anvendelse af elektroforetisk mobilitet shift assays (EMSA) (se arbejdsgangen i figur 2). Dernæst, efter binding til genomisk DNA og DAP trin, er protein-bundne og input DNA undersøges ved qPCR at se, om den positive mål er beriget i protein-bundne fraktion i forhold til fraktion input, hvilket bekræfter optimale bindingsbetingelser for RR (figur 2). Efter vifte hybridisering, er data analyseres for at finde toppe af højere intensitet signal indikerer genomisk loci hvor proteinet hannonce bundet. Funktioner kan forudsiges for RR baseret på genmål opnået. Target genomiske loci anvendes til at forudsige bindingssted motiver, som derefter eksperimentelt validerede hjælp EMSAs (figur 2). De funktionelle forudsigelser og genmål for RR kan derefter udvides til nært beslægtede arter, som koder for ortologe RRs ved at scanne disse genomer for lignende bindende motiver (figur 2). DAP-chip-metoden kan give et væld af informationer for en FKS, hvor der tidligere var ingen. Fremgangsmåden kan også anvendes til enhver transkriptionel regulator hvis proteinet kan oprenses og DNA-bindingsbetingelser kan bestemmes, og for enhver organisme af interesse med et genom-sekvens til rådighed.

Fig. 1. DNA-affinitetsoprenset-chip (DAP-chip) strategi ^7.. RR-genet fra organismen af interesse klones med en carboxy-terminal His-mærke i en E. coli-ekspressionsvektoren stamme. Oprenset His-mærket protein aktiveres ved phosphorylering med acetylphosphat, og blandes med klippede genomisk DNA. En portion af bindingsreaktionen gemmes som input DNA, mens resten udsættes for affinitetsoprensning under anvendelse af Ni-NTA-harpiksen. Input og RR-bundet DNA er hele genomet forstærkes og mærket med Cy3 og Cy5, hhv. Det mærkede DNA samles sammen og hybridiseret til en flisebelægning array, som derefter analyseres for at bestemme gen-mål. Figur modificeret og genoptrykt hjælp Creative Commons licens fra ^7..

Figur 2.. Resumé af workflow. For enhver renset tagged Protein, begynder ved at bestemme et mål ved hjælp af EMSA. Tillad protein til at binde genomisk DNA og derefter DNA-affinitetsoprensning (DAP) og hele genomet forstærke (WGA) beriget og input DNA. Hvis et gen målet er kendt, anvendes qPCR at sikre, at den kendte mål er beriget med protein-bundne fraktion. Hvis der ingen mål kunne bestemmes, gå direkte til DNA-mærkning og matrix hybridisering. Hvis det ikke kunne observeres berigelse af qPCR, derefter gentage protein-gDNA binding og DAP-WGA trin ved hjælp af forskellige protein beløb. Brug array analyse til at finde toppe og kortlægge dem til at målrette gener. Brug opstrøms regioner af målgener at forudsige bindingssted motiver. Godkend motiverne eksperimentelt ved EMSAs. Brug motivet til at scanne genomer af beslægtede arter, der koder orthologer af RR under studiet, og forudsige gener målrettet på disse arter som godt. Baseret på genmål opnået, kan den fysiologiske funktion af RR og dens orthologer forudsiges. Figur modificeret og genoptrykt ved hjælp af den skabende commons licens fra ^7..

Protocol

Bemærk: Protokollen nedenfor er skræddersyet til bestemmelse af gen mål for RR DVU3023 fra bakterien Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Det kan tilpasses til en anden transskriptionel regulator af interesse. 1.. Klon og Purify RR Klon RR genet specifikt DVU3023 fra D. vulgaris Hildenborough ind i en Escherichia coli ekspressionsvektor, således at genet er C-terminalt His-mærket og ekspression er under kontrol af en T7-promotor. Bemærk: Fl…

Representative Results

Ovennævnte metode blev anvendt til at bestemme de globale genmål af RRS i modellen sulfat reducerende bakterie Desulfovibrio vulgaris Hildenborough 7. Denne organisme har et stort antal af de pågældende systemer repræsenteret ved over 70 RRs, angiver det brede udvalg af mulige signaler, som den registrerer og reagerer på. In vivo analyser af funktionerne af disse signalsystemer er svære at udføre, da deres signaler og dermed deres aktiverende betingelser er ukendt. Her blev DAP-chip-…

Discussion

Den her beskrevne DAP-chip-metoden blev med succes anvendt til at bestemme genmål flere RRs i Desulfovibrio vulgaris Hildenborough ^7, hvoraf den ene er vist her som et repræsentativt resultat. For RR DVU3023, vælge en kandidat gen mål var ligetil. DVU3025 er placeret umiddelbart nedstrøms for RR-genet og RR-og mål-gener er konserveret i adskillige Desulfovibrio arter, og derudover DVU3025 har en forudsagt sigma54-promotor. EMSA tilvejebringer en enkel metode til hurtigt at teste RR til…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog number	Comments
HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA	17-5255-01
Akta explorer (FPLC instrument)	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA
HiPrep 26/10 Desalting column	GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA	17-5087-01
Qiaquick Gel extraction kit	Qiagen Inc, Valencia, CA, USA	28704
Biotin-labeled oligonucleotides	Integrated DNA Technologies	N/A
6% polyacrylamide-0.5X TBE precast mini DNA retardation gel	Life Technologies, Grand Island, NY, USA	EC63652BOX	Alternately, you can pour your own gel.
Nylon membrane	EMD Millipore, Billerica, MA, USA	INYC00010
Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell	Biorad, Hercules, CA, USA	170-3940
Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm	Biorad, Hercules, CA, USA	170-3967
UV crosslinker Model XL-1000	Fisher Scientific	11-992-89
Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)	Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA	89880
Ni-NTA agarose resin	Qiagen Inc, Valencia, CA, USA	30210
GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10X amplification master mix, WGA polymerase )	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	WGA2-50RXN
Nanodrop ND-1000	Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA		For quantitation of DNA
Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX	Quanta biosciences	95055-500	Any Sybr Green PCR mix may be used
PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR	Axygen
96 well clear low profile PCR microplate	Life Technologies, Grand Island, NY, USA	PCR-96-LP-AB-C
Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system	Life Technologies, Grand Island, NY, USA	4376600	Any real time PCR system may be used
Qiaquick PCR purification kit	Qiagen Inc, Valencia, CA, USA	28104	Any PCR clean up kit may be used
Cy3/Cy5-labeled nonamers	Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA	N46-0001, N46-0002
Klenow polymerase 50,000U/ml, 3'-5' exo-	New England Biolabs, Ipswich, MA	M0212M
Hybridization system	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A	This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used,
Custom printed microarrays and mixers	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
Hybridization kit (2X Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
Wash buffer kit (10X Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A
GenePix 4200A microarray scanner	Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA		This model has been replaced by superior ones
GenePix Pro microarray software	Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA
Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software	Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA	N/A